FGF-2-Induced人类羊膜间充质干细胞播种人类非细胞羊膜支架在一只兔子Tendon-to-Bone愈合加速关节外模式

文摘

背景。FGF-2(基本成纤维细胞生长因子)有一个积极的影响多种msc的增殖和分化。因此,它代表了一个理想的分子来促进tendon-to-bone愈合。然而,没有研究调查FGF-2-induced人类羊膜间充质干细胞的应用(hAMSCs)加速tendon-to-bone治疗体内。客观的。本研究的目的是探索FGF-2对chondrogenic hAMSCs体外分化和影响FGF-2-induced hAMSCs结合人类的非细胞羊膜(HAAM)脚手架tendon-to-bone治疗体内。方法。在体外,hAMSCs转染慢病毒携带FGF-2基因,以及潜在的chondrogenic hAMSCs诱导的分化FGF-2基因是评估使用免疫荧光和甲苯胺蓝(TB)染色。HAAM支架制备,苏木精和伊红染色(他)和扫描电子显微镜(SEM)观察HAAM支架的微观结构。hAMSCs转染有或没有FGF-2被播种在HAAM脚手架的密度 细胞/。波形蛋白免疫荧光染色和phalloidin染色被用来证实细胞粘附和生长在HAAM脚手架。体内,兔子关节外tendon-to-bone愈合模型创建使用正确的后肢40新西兰白兔。移植模仿tendon-to-bone接口(创伤性脑损伤)受伤了和接受治疗HAAM支架装载FGF-2-induced hAMSCs, HAAM支架装载hAMSCs, HAAM支架,没有特殊待遇。肉眼观察,imageological分析,组织学评估,进行了生物力学分析来评估tendon-to-bone愈合后3个月。结果。在体外,cartilage-specific标记染色呈阳性FGF-2超表达组。HAAM脚手架显示一个网状结构,大量细胞外基质的结构。hAMSCs或hAMSCs转染FGF-2幸存在HAAM支架和生长良好。体内,HAAM支架治疗组加载FGF-2全身hAMSCs有狭隘的骨隧道三个月后与其他组相比。此外,宏观和组织学为这组分数高于其他群体,以及最好的机械强度。结论。hAMSCs转染与FGF-2结合HAAM支架可能会加速tendon-to-bone治疗兔关节外模型。

1。介绍

Tendon-to-bone接口(创伤性脑损伤)——关键锚高度韧带/肌腱bones-plays缓解高应力传播中一个重要的角色从韧带/肌腱骨(1]。创伤性脑损伤是一种特殊的韧带/肌腱和骨之间的结构,组成四个过渡层:韧带/肌腱,uncalcified纤维软骨,钙化纤维软骨和骨组织(2,3]。纤维软骨是一种机械承载组织,和创伤性脑损伤的损伤经常发生在纤维软骨区。伤害,创伤性脑损伤的愈合缓慢,不恢复原来的结构和力学性能由于愈合不良纤维软骨的能力(4]。纤维软骨的再生能力是穷人和相当有限的由于其相对无血管,导致受伤的缓慢复苏创伤性脑损伤(5]。最近,许多策略来增加创伤性脑损伤的治疗已经设计了基础科学研究和临床治疗,包括使用仿生支架、生长因子、干细胞(6,7]。

组织工程技术的发展,包括三个关键elements-seed细胞、生长因子、脚手架急剧增强的几种疾病的治疗8]。间充质干细胞(msc)是最常用的种子细胞在组织工程技术,包括脂肪msc (9- - - - - -11),外围血液msc (12,13),和骨髓msc(综合)14,15]。由于其独特的优势,bmsc已经成为最受欢迎的种子细胞,已经在许多领域得到广泛应用。bmsc然而,也有一些缺点,比如潜在出血的风险,在收获过程中感染,免疫排斥反应(16,17]。

因此,有必要探索新的种子细胞,可应用于组织工程技术。人羊膜间充质干细胞(hAMSCs),收获健康puerperant丢弃胎盘的女性,已经成功地孤立和用于许多研究[18,19]。与其他msc相比,hAMSCs有很多优势,包括一致的和广泛的可用性,操作简单,没有伦理争议(18,19]。杜等人报道,hAMSCs增殖能力大于bmsc [20.),使他们的潜能作为种子细胞。然而,有限的研究使用hAMSCs加速创伤性脑损伤的治疗(21]。

支架材料是组织工程技术的其他至关重要的因素。他们不仅促进粘附和增殖的细胞也有可能促进细胞分化的方向。人类羊膜膜(火腿),胎膜的最里面的一层,是一个半透明的薄膜,有丰富的细胞外基质(ECM),包括纤连蛋白,透明质酸和胶原蛋白,III, IV, V,七世(22- - - - - -26]。人类非细胞羊膜(HAAM)支架是一个生物支架由decellularizing火腿的组织。HAAM支架已广泛用作支架构建工程组织和器官由于其优越的特性,如抗菌、抗炎和nonantigenic属性(22- - - - - -26]。

许多生长因子被发现并应用于组织工程技术,包括转化生长因子-β(TGF -β)[27)、表皮生长因子(EGF) [28),血管内皮生长因子(VEGF) [29日,纤维母细胞生长因子(FGF) [30.]。其中,FGF-2(基本成纤维细胞生长因子)已广泛应用于组织工程技术由于其独特的优势31日]。FGF-2是一个有效的多种细胞的有丝分裂原,能够促进细胞增殖和分化32]。最近,许多研究发现FGF-2能够加速tendon-to-bone治疗(33,34]。

因此,在当前的研究中,我们假设(一)FGF-2可以促进chondrogenic hAMSCs体外分化和(b) hAMSCs加载在HAAM脚手架和诱导FGF-2有潜力增加tendon-to-bone治疗体内的能力。

2。材料和方法

2.1。隔离、文化、以及hAMSCs的表征

在这项研究中,得到了胎盘的产科部门遵义医科大学的附属医院从每个病人术前知情同意。符合一个先前的研究(35],hAMSCs用于本研究从人类胎盘羊膜分离5健康足月puerperant女性对酶(Solarbio,中国)消化两次,其次是胶原酶II型(美国Gibco)消化。总之,孤立的羊膜剁碎成碎片,用0.05%胰蛋白酶消化两次/ 0.01%乙二胺四乙酸(EDTA) 30分钟37°C,紧随其后的是洗组织与磷酸缓冲溶液(PBS)和消化0.75%胶原酶II型1 h在37°C。第三代(P3) hAMSCs良好状态通过这种方法被用于后续的实验。根据既定的协议(35),具备干细胞的hAMSCs从胎盘羊膜分离测试通过疣状干细胞标记和人类羊膜上皮细胞标记,波形蛋白(1:300年,ab92547 Abcam)和细胞角蛋白19 (ab52625 CK-19, 1: 200年,Abcam),分别。

2.2。转染hAMSCs携带FGF-2基因的慢病毒载体

慢病毒包含FGF-2从上海Jikai获得基因基因化学技术有限公司根据制造商的指示,P3 hAMSCs被播种在96孔板和感染感染复数(MOI) 0, 25、50、75100和150。这些细胞被分为三组:FGF-2转染组,untransfected组和空病毒群。所有三组培养L-DMEM / F12培养基含有10% ( )胎牛血清(美国Gibco的边后卫),1% ( )青霉素、链霉素(P / S, Solarbio,中国),1% ( )谷氨酰胺(Solarbio、中国)和1% ( )不必要的氨基酸(Solarbio,中国)。培养基是改变后12 h, hAMSCs倒置的荧光显微镜下观察。最优莫伊价值通过观察成立的表达绿色荧光蛋白(GFP)的感染hAMSCs生活,之后进行正式实验根据上述方法,使用最优莫伊。72 h后,观察GFP的表达在倒置荧光显微镜下观察测量转染效率。此外,转染效率检测使用定量实时反向transcriptase-polymerase连锁反应(存在)。总之,总RNA提取使用RNAiso +执行试剂盒(豆类生物有限公司、志贺、日本),并使用PrimeScript RT互补脱氧核糖核酸合成试剂工具包(豆类生物Inc .)。FGF-2的表达是通过定量实时PCR检测使用结核病绿色预混料交货Taq工具包(豆类生物Inc .)。人类使用FGF-2基因。中使用的引物中存在提供了表1。相对基因表达水平标准化人类glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)和计算使用2^{- - - - - -ΔΔCt}方法。

2.3。免疫荧光检查和甲苯胺蓝(TB)染色

免疫荧光法用于检测胶原蛋白II在每组的表达转染有或没有FGF-2基因。P3 hAMSCs被播种到无菌盖10 6-well板的密度⁵细胞/毫升(每组3井),其次是增加慢病毒的最佳莫伊。14天之后,强烈的荧光在倒置荧光显微镜下观察,观察hAMSCs被固定为4%多聚甲醛在室温下15分钟。井被封锁山羊血清60分钟,5%和hAMSCs孵化一夜之间在4°C的主要抗体胶原蛋白II型(1:200年,ab34712 Abcam)。第二天,hAMSCs孵化了Alexa萤石®594共轭anti-rabbit(美国Abcam)二级抗体室温1小时,和细胞核染色使用2 - (4-amidinophenyl) 6-indolecarbamidine盐酸盐(DAPI)。使用一个倒置荧光显微镜观察的结果。FGF-2基因转染后14天,hAMSCs每组与4%多聚甲醛固定15分钟在室温下与PBS洗涤三次紧随其后。美国结核病(σ)染色,执行和结果一个倒置显微镜下观察。

2.4。HAAM支架的制备

火腿被隔离在无菌条件下从胎盘HAAM支架(图做准备1(一))。孤立的火腿是用无菌PBS包含P / S解决单独的血凝块,碎片,死细胞和粘液。火腿切成适当的块,然后放置在盘子的羊膜上皮细胞层朝上。此后,碎片被孵化0.25%胰蛋白酶EDTA 30分钟在一个孵化器(图37°C1 (b))。接下来,落叶上皮细胞被小心地用刮刀与PBS,洗了三次,彻底消除残留上皮细胞和碎片(图1 (c))。的是大约的然后再切成更小的部分 厘米大小,放入6-well文化板块仔细(图1 (d))。块然后用紫外线消毒,P / S和两性霉素大约30分钟。

2.5。苏木精和伊红染色(他)和扫描电镜(SEM)分析

他染色进行验证的效率去细胞的过程。新鲜火腿和准备HAAM支架是用4%多聚甲醛溶液固定24小时,脱水,把嵌入到石蜡,因为他染色。SEM分析,HAAM脚手架使用3%戊二醛固定在0.1 M PBS 2 h在4°C,其次是1%锇酸固定60分钟在室温和脱水用70%,80%,90%,100%乙醇为10分钟。HAAM脚手架然后风干,安装,溅射镀黄金,和测试使用日立SU8100 SEM(日立、东京、日本)。

2.6。养殖hAMSCs和FGF-2-Induced hAMSCs HAAM脚手架

hAMSCs和hAMSCs转染FGF-2被播种在完成消毒HAAM脚手架的密度 细胞/。细胞的生长状态是每天在倒置显微镜下观察。此外,hAMSCs的粘附和生长监测后1^圣和7^th天通过波形蛋白免疫荧光染色。接下来,在HAAM hAMSCs支架与PBS和4%多聚甲醛固定,洗。hAMSCs被封锁使用5%山羊血清一小时和孵化一夜之间在4°C主要波形蛋白抗体,其次是孵化与荧光二次抗体在室温下1 h。细胞核是用DAPI染色,荧光显微镜下观察结果。hAMSCs转染的FGF-2基因与phalloidin染色观察细胞粘附和生长后1^圣和7^th天。随后,这些细胞被洗PBS和4%多聚甲醛固定。后permeabilizing细胞膜有0.5%聚乙二醇octylphenol醚(Triton x - 100) 5分钟,TRITC-labeled phalloidin解决方案(Solarbio,中国)添加和孵化30分钟。DAPI用于细胞核染色,荧光显微镜下观察结果。

2.7。外科手术和创建包含Tendon-to-Bone愈合模型

共有48个健康新西兰白兔(年龄5 - 6个月;体重2.5 - -2.7公斤)购买的重庆,中国。动物提供许可证是医疗用动物(词)2017 - 0010。动物研究伦理委员会批准遵义医学院的附属医院,和所有程序依法进行了机构照顾动物的指南。试运行进行x光检查排除相关的疾病可能会影响实验结果。八只兔子(48)被排除在外:两只兔子有骨折在运输期间,三个关节脱位,和三个关节畸形。20每组5只兔子,兔子被用于组织学评估和20个兔子用于影像学分析和生物力学测试。关节外tendon-bone愈合模型是根据既定的协议(36,37)(图2)。简单地说,0.75毫升/公斤的3%的戊巴比妥钠注射静脉注射麻醉动物,其次是中间切口沿左后肢跟腱。2厘米长度的partial-thickness肌腱收获贪污。2.5毫米直径的骨隧道是由近端胫骨的右后肢跟腱和四种不同的治疗方法是通过骨隧道(表2)。

接下来,植入的两端肌腱缝合周围的软组织,和0.5厘米的一端保留后进行生物力学测试。此后,伤口缝合一层一层地,动物没有任何被允许自由移动的障碍手术后在笼子里。青霉素(100000 U /公斤)是肌内注射预防伤口感染,术后连续三天。兔子是牺牲在手术后3个月,和graft-tibia复合物(gtc)准备后续的测试。

2.8。肉眼观察、形态学分级和Imageological分析

手术三个月后,没有观察到感染或其他并发症的任何动物。宏观评价GTC的图像采集标本tendon-to-bone愈合。愈合tendon-bone接口的状态评估使用Yamakado界面形态年级,由直接类型的插入,胶原纤维连续性,界面没有胶原纤维的连续性,和骨头和肌腱之间的分离37]。每组有5个标本。另外,x线检查是用来评估骨隧道区域;GTC样本扫描轴垂直于长骨的骨隧道的入口和出口的放射学,遵义医科大学的附属医院。

2.9。组织学评估

的GTC样本在4%多聚甲醛溶液固定24小时,用EDTA脱钙除去石灰质的解决方案(Solarbio,中国)大约2周,并嵌入到常规组织学切片石蜡。Five-micrometer-thick部分被削减的纵轴垂直于胫骨隧道,沾着他,结核病,番红精O /快速绿色,和马森的三色的染色。

2.10。生物力学分析

生物力学分析是由南京BiaoPu测试技术服务有限公司样品吸收的生物力学分析后立即准备牺牲依照之前报道协议(33]。短暂,所有残余软组织,除了周围的肌腱移植骨隧道,被小心地删除。移植肌腱端骨隧道外缝合为牵引,和胫骨被牢固地固定。与1 N的固定负荷预加载后5分钟,进行生物力学分析。最终的破坏载荷进行了延伸率的2毫米/分钟。刚度和极限破坏载荷测量使用载荷变形曲线。对于每一个样品,测试终止贪污或破裂时退出了骨隧道。

2.11。统计分析

数据表示为 。方差分析(方差分析)和图基的多重比较被用来确定显著差异。 被认为是有统计上的显著差异。SPSS软件(version18.0;IBM)是用于数据分析。

3所示。结果

3.1。文化以及hAMSCs的表征

在主文化(P0), 48 h后的形态学hAMSCs展出一个倒置显微镜下的纺锤状外观。经过多次亚文化,hAMSCs渐渐的漩涡的形态学和长梭状(图3(一个))。“具备干细胞”的hAMSCs验证了通过免疫染色确定细胞用于这项研究确实是干细胞。免疫荧光结果显示P3 hAMSCs高度表达波形蛋白(msc标记),但几乎没有表达细胞角蛋白19(一个典型的人类羊膜上皮细胞表型的分子),确认细胞用于实验确实hAMSCs(图3 (b))。

3.2。成功转染FGF-2 hAMSCs基因

转染后FGF-2使用最优莫伊值( ),细胞形态和表达荧光倒置显微镜和荧光显微镜下观察,分别。hAMSCs慢病毒感染的细胞形态没有改变,和无关紧要的荧光表达12 h后在荧光显微镜下观察。随着时间经过,荧光的表达增加,最强的荧光观察72 h(图4(一))。接下来,存在被用来评估转染效率,结果表明,mRNA的表达FGF-2转染组在统计学上高于空病毒组和untransfected集团( )。没有显著区别空病毒组和untransfected集团( ,图4 (b))。

3.3。免疫荧光检测

与慢病毒转染后包含FGF-2基因免疫荧光试验用于检测胶原蛋白II在每组的表达,和结核病染色进一步用于检测软骨形成。免疫荧光结果显示转染组、胶原蛋白II是分布在细胞核内的细胞核而难以表达。然而,没有观察到的荧光表达胶原蛋白II空病毒组和untransfected组(图5(一个))。这些结果表明,FGF-2可能促进和引导hAMSCs成软骨分化。结核病染色结果表明,有质量blue-dyed地区;然而,小blue-dyed地区观察到空病毒和untransfected组。这些结果表明FGF-2有可能诱导hAMSCs分化成软骨细胞(图的能力5 (b))。

3.4。他染色和扫描电镜

他染色显示的表皮层新鲜火腿完整,细胞核清晰可见(图6(一),我)。然而,没有细胞核在HAAM脚手架和表皮层胰蛋白酶处理后消失(图6(一)、(二)。此外,HAAM脚手架的基底膜仍完好无损,尽管经历去细胞治疗,这表明HAAM支架保持ECM结构有利于细胞的粘附和生长。SEM结果表明,HAAM脚手架的网络空间结构和有质量ECM组件和胶原蛋白组件(数字6(b)和6(c))。

3.5。播种hAMSCs和hAMSCs与FGF-2基因转染HAAM脚手架

一天之后hAMSCs被播种在HAAM脚手架,只有几个hAMSCs HAAM支架的表面。不断培养7天后,hAMSCs融合到补丁覆盖HAAM支架的表面。这表明HAAM支架对细胞增殖(图没有不利的影响7(一))。同样,hAMSCs转染的FGF-2基因显示良好的粘附和生长在HAAM脚手架,phalloidin染色(图证明了这一点7 (b))。

3.6。肉眼观察、形态学分级和Imageological考试

术后三个月,没有眼泪或撤离骨隧道的移植。愈合不良tendon-bone界面的观察组1,由明显证明贪污和骨头之间的差距。相比之下,组2和组3表现出更好的愈合略窄的缺口。组4显示最好的治疗手术后与其他组相比,有几乎没有任何差距和表面的色泽与正常组织(图相似8(a))。此外,形态学评分界面显示的结果直接类型的插入观察组4组4只显示最好的疗愈与其他组相比(表3)。x线检查结果显示有新骨形成创伤性脑损伤的观察到的所有组。组4演示了新骨形成的最高金额。此外,4组的平均骨隧道区域显著低于其他组。虽然,组1相比,更高的新骨形成和较小的平均骨隧道区域观察组2和组3(图8(b))。

3.7。组织学评估

他染色组1总会发现许多炎症细胞tendon-to-bone接口和广泛的移植和骨之间的缝隙,这表明tendon-to-bone接口的愈合较差。相比之下,组2和组3组1相比表现出更好的治疗结果,但缺乏任何fibrocartilage-like结构。组4显示最好的治疗,就是缺乏炎症细胞,不显眼的差距,和大规模fibrocartilage-like结构(图9(a))。进行进一步的组织化学染色使用结核病染色。在组1中,有一些炎症细胞和明显的差距,与他染色的结果一致。虽然减少炎症细胞和窄的缺陷被发现在组2和组3中,没有观察到位于细胞。相比之下,大面积彩色积极与结核病在4组,表明纤维软骨的形成(图9(b))。番红精O /快速绿色染色用于进一步检测创伤性脑损伤的纤维软骨形成。这些结果还显示质量在4组纤维软骨的形成而在其他组没有纤维软骨形成,就是积极的番红精O /快速绿色染色结果(图9(c))。马森的三色的染色结果显示大量胶原纤维分布于植入跟腱的4组,而只有很少或根本没有观察到其他组胶原纤维,建议增加胶原纤维形成集团4(图9(d))。

3.8。生物力学分析

生物力学分析是用来研究移植手术三个月后的机械性能(图10 ())。组4显示最高的最终破坏载荷。尽管组2和组3的最终失效载荷高于第1组,两组之间没有统计学差异被发现(图10 (b))。按照最终的破坏载荷的结果,组4的刚度测试的结果明显高于其他组。类似地,组2和组3显示刚度高于组1,但之间没有统计上的显著差异组2和组3(图10 (c))。

4所示。讨论

创伤性脑损伤是关键附件韧带/肌腱的骨头;它不仅使肌肉骨骼运动也有显著的抗高压能力产生的收缩肌肉(38]。然而,它容易受到伤害是由于外伤、过度使用,和慢性炎性疾病。受伤之后,它慢慢地愈合,和原结构不会完全恢复,因为专业纤维软骨区,在再生能力差(39]。纤维软骨是正常的创伤性脑损伤的特殊结构,在保护中扮演着关键角色的创伤性脑损伤的损伤使逐渐过渡的机械力从肌腱/韧带。纤维软骨的再生能力是有限的由于其相对无血管。虽然手术治疗已经被用来协助纤维软骨形成和加速tendon-to-bone愈合,结果已经不满足。因此,关键在于寻找促进纤维软骨形成的基础研究和临床设置。

FGF-2是一个有力的有丝分裂原,各种类型的细胞,并能促进迁移,增殖,分化msc (40]。由于各种类型的细胞系的重要作用,它被广泛应用于恢复受损组织通过促进细胞增殖,刺激其他生长因子的释放以及促进胶原蛋白的生产。一些研究发现FGF-2促进tendon-to-bone补偿过程,如韧带和肌腱重建治疗,虽然确切的机制尚不清楚(41,42]。此外,据报道,FGF-2积极的影响软骨形成和促进修复软骨损伤(43]。

HAAM脚手架是一种天然的生物支架,已被广泛用作细胞外基质加载细胞工程建设的组织和器官(44]。与其他支架相比,HAAM脚手架具有以下优点:广泛的可用性、低成本、低免疫原性,没有道德争议。到目前为止,HAAM支架已被应用在许多领域,尤其是在修复皮肤缺损(45]。近年来,越来越多的研究发现,在HAAM支架对骨科疾病有积极影响,如促进骨再生和修复关节软骨缺损46,47]。

在这项研究中,我们成功地孤立hAMSCs和msc的属性被验证使用免疫荧光染色。结果表明,hAMSCs MSCs-greatly vimentin-a标记,但很难表达细胞角蛋白19(一个典型的人类羊膜上皮细胞表型的分子)。虽然波形蛋白作为唯一hAMSC标记,其他属性hAMSCs被证实在我们之前实验中(35),如塑料依从性、特定的表面抗原(Ag)表达式,和多能干细胞分化为成骨细胞的能力,脂肪细胞,软骨细胞。后确认MSC属性P3 hAMSC文化线路,我们使用了一个包含人类的慢病毒FGF-2基因转染的hAMSCs转染效率是决定通过荧光的表达和存在。后FGF-2基因被成功转染hAMSCs,影响软骨分化是利用免疫荧光染色检测胶原蛋白II和结核病染色。结果表明,FGF-2能促进软骨细胞的形成,表明FGF-2 hAMSCs有可能诱导分化为软骨细胞。我们的结果与先前的结果是一致的,FGF-2可以促进msc分化成软骨细胞(48,49]。

我们使用一个简单而廉价的方法来创建一个HAAM脚手架使用酶消化。与其他方法相比,该方法提供了许多优点,如更快的结果,简单的过程,降低成本。虽然这种方法准备HAAM脚手架被用于其他研究[47,50),我们减少酶消化所花费的时间,提高细胞外基质的完整性和减少时间和成本。他染色进行新鲜火腿和HAAM支架以确认彻底的去细胞火腿。结果表明,上皮细胞存在于上皮细胞层的新鲜火腿而没有发现这些细胞在HAAM脚手架。此外,细胞外基质保持完好无损的新鲜火腿和HAAM支架。这些结果表明,去细胞完整,符合先前的研究[44,50]。HAAM支架的显微组织观察使用扫描电镜,揭示多孔,适合细胞的生长。接下来,hAMSCs和hAMSCs转染的FGF-2基因被播种在HAAM脚手架。HAAM脚手架上的粘附和生长的细胞是通过免疫荧光染色检测和phalloidin染色,分别。结果表明,hAMSCs和hAMSCs转染的FGF-2基因可能生存和增殖在HAAM脚手架,暗示HAAM脚手架有无毒的属性。

兔子体内的检查中,我们使用一个包含模型来探索HAAM支架的影响结合hAMSCs转染的FGF-2基因在tendon-to-bone愈合。手术三个月后,GTC标本被收集和检查。组织学检查显示,4组表现出更好的tendon-to-bone愈合。我们推测,以下原因可以解释结果。首先,FGF-2转染到hAMSCs可能促进了纤维软骨形成创伤性脑损伤的体内,这可以协助tendon-to-bone愈合。我们可以推测这因为我们发现FGF-2有能力推动hAMSCs体外软骨分化。创伤性脑损伤(纤维软骨是一个关键组成部分51,52];因此,纤维软骨的形成有一个重要的角色在促进tendon-to-bone愈合。第二,FGF-2可能充当了招聘人员或刺激物激活释放额外的重要因素,因此加速tendon-to-bone愈合。这种猜测被证实结论FGF-2愈合过程是一个重要的生长因子的受伤组织和韧带/肌腱损伤后观察到的数量增加(52]。第三,HAAM脚手架可能有可能促进tendon-to-bone愈合的能力。一些研究发现HAAM支架有一个积极的影响在骨再生和骨矿化46,50]。新骨形成的最重要的因素之一是tendon-to-bone愈合。因此,HAAM脚手架可能加速tendon-to-bone愈合通过促进新骨形成。在实践中,最大的测量tendon-to-bone愈合恢复原来的机械强度与正常的承载能力。在这项研究中,最高的最终破坏载荷和刚度检测在4组,展示了增强机械强度和更好的tendon-to-bone愈合。

这项研究有一些局限性。首先,本研究中使用的模型不同于临床tendon-to-bone治疗情况下,虽然这动物模型被用在许多先前的研究[36,37]。尽管这是一个没有临床相关的损伤模型并没有加载环境tendon-to-bone治疗发挥了重要作用,我们使用这个简单的模型来模拟tendon-to-bone愈合的影响,探索FGF-2-induced hAMSCs结合HAAM脚手架tendon-to-bone愈合。前交叉韧带重建(ACLR)和肌腱套(RC)撕裂模型是进一步研究tendon-to-bone愈合所必需的。第二,只有一个时间间隔(三个月)将评估tendon-to-bone愈合在这项研究中,尽管一些研究人员也只有一个时间点选择探索tendon-to-bone治疗(51,52]。tendon-to-bone康复是一个循序渐进的过程,因此,不同时间点应选择在进一步的研究探索治疗过程。第三,本研究只在动物模型上进行的。需要相当大的努力来实现这个方法在临床实践。第四,我们没有使用mic-CT定量评估骨隧道和创伤性脑损伤的愈合状况。在未来,mic-CT和其他类型的定量检测将被用来进一步评估tendon-to-bone愈合。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

张小君和刘梓鸣co-first作者。

的利益冲突

所有的特约作者声明没有利益冲突。

确认

这项工作是财务支持的贵州科技部门(批准号LH[2017] 7015年,邹帮派)和钱魏霁禁止汉族2017 - 24。

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版权©2020年6月Zhang et al。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。