文摘
背景。本研究的目的是探讨人类脐带间充质干细胞的影响由姜黄素激活(hUC-MSCs-CUR)在帕金森病(PD)。hUC-MSCs可以分化成许多类型的成人组织细胞包括多巴胺(DA)神经元。坏蛋可以保护DA神经元细胞凋亡诱导6-hydroxydopamine (6-OHDA)。因此,我们使用了hUC-MSCs激活CUR治疗PD动物模型。方法。hUC-MSCs-CUR被移植到MPTP-induced PD小鼠模型通过尾静脉。我们发现hUC-MSCs-CUR显著提高运动能力,增加了酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺(DA)和bcl - 2的水平,并降低一氧化氮合酶,伯灵顿,裂解半胱天冬酶3表达PD小鼠。的上层清液hUC-MSCs-CUR (CM-CUR)被用来刺激SH-SY5Y PD的细胞模型;细胞增殖、分化、TH和neuronal-specific microtubular-associated标志蛋白2 (MAP2)表达式。结果。我们的数据表明,CM-CUR显著促进细胞增殖,逐步增加TH和MAP2 SH-SY5Y PD细胞中表达。相关的有益作用可以显著增加hUC-MSCs-CUR,粗面内质网的分泌许多细胞因子和生长因子有利于PD治疗。结论。hUC-MSCs-CUR移植可以改善帕金森病的运动康复。
1。介绍
帕金森病(PD)的病理特性包括多巴胺(DA)神经元的进步的损失有选择地在黑质致密部的(SN)和纹状体(CS)和嗜酸性路易小体的存在残余DA神经元。在这种情况下,DA在CS的数量减少和患者出现临床症状如地震、刚度,动作迟缓1- - - - - -3]。目前,可用的治疗帕金森病的药物和手术4- - - - - -6]。尽管左旋多巴能改善PD患者的早期症状,不能阻止DA神经元的逐步减少在PD的后期阶段;此外,逐渐撤回等并发症,开关现象,药物引起的运动障碍可能发生(4]。手术提高了地震和刚度在某种程度上,但它无法阻止帕金森病的发展,手术风险相对较高(5,6]。
众所周知,干细胞自我更新的独特特点和multipotential分化。在合适的条件下或适当的感应,他们可以分化成许多类型的成人组织细胞,包括DA神经元(7,8]。这个multipotential分化能力提供了伟大的希望治疗神经退行性疾病,如帕金森病(9]。目前,可用干细胞主要包括神经干细胞(nsc),胚胎干细胞(ESCs),间充质干细胞(msc) [10- - - - - -16]。msc多功能细胞能够分化为多巴胺(DA)神经元,这是一个主要的细胞类型在PD受损。msc包括骨髓间充质基质细胞(BM-MSCs)和人脐带间充质基质细胞(hUC-MSCs) [17- - - - - -20.]。mptp缺陷型系统性BM-MSC移植可以防止神经损伤大鼠和被认为是一个潜在的治疗帕金森病在早期阶段疾病的发展。另一方面,骨髓单核细胞(BMMCs)加速DA损害和引起的运动障碍和静止的行为(17]。临床试验表明,MSC与进行性核上的麻痹受试者的管理是可行的(PSP),一种罕见的,严重的,不能形成PD (18]。MSC移植的常见方法包括静脉注射,鞘内注射,和当地的大脑注入。此外,鼻内的路线也验证作为一个潜在的安全,简单,廉价的替代路线MSC治疗神经退行性疾病(19]。hUC-MSCs原始的、拥有多种优势包括道德接受,微创程序隔离,低免疫原性、高增殖能力,multilineage分化能力(21- - - - - -23]。因此,hUC-MSCs已经成为一个重要的细胞治疗疾病的来源。最近的研究表明,激活hUC-MSCs移植前可能产生更好的效果22,23]。在活的有机体内实验由诱导hUC-MSCs TH-positive细胞并移植到CS的PD大鼠;这些细胞存活4个多月,细胞迁移尾和喙的大约1.4毫米。更重要的是,这些老鼠的行为有所改善。因此,如果hUC-MSCs适当刺激,他们应该有能力治疗PD的至关重要。
在目前的研究中,姜黄素(坏蛋)选择激活hUC-MSCs。坏蛋有广泛的药理作用,如抗氧化、抗炎、降低血脂。研究治疗PD的坏蛋已经发表(24,25]。在PD的PC12细胞模型用1-methyl-4-phenylpyridine (MPP +),这是证实CUR免受MPP +全身的细胞凋亡(26]。PD动物模型表明,坏蛋DA神经元免受6-hydroxydopamine诱导细胞凋亡(6-OHDA) [27,28]。2012年,研究人员还发现,坏蛋结合α-核蛋白(αsyn)阻止了积累αsyn的神经元。这些结果治疗PD(可能有重要影响29日]。一些研究人员指出,坏蛋不能通过血脑屏障(BBB),但许多坏蛋分子的疏水性的研究报告表明BBB的可能性在大脑中渗透和积累。无论CUR可以透过BBB,它表现出极低的生物利用度,主要是由于其水溶性差,稳定性差的解决方案,和快速肠道营业额和肝的新陈代谢。hUC-MSCs可以通过BBB和有很强的分化潜能21- - - - - -23]。
因此,基于hUC-MSCs和坏蛋的优点和缺点,本研究的目的是审查的影响hUC-MSCs激活坏蛋(hUC-MSCs-CUR)治疗PD的,相比之下,hUC-MSCs没有任何治疗的影响。
2。材料和方法
2.1。材料
脐带组织获得健康孕妇交付我们的医院。这些女性签署书面知情同意。C57BL小鼠(6 - 8周)被命令从北京重要河流实验动物科技有限公司(中国)。耗材如F12培养基和吸量管被命令从σ(圣路易斯,美国)。坏蛋,1-methyl-4-phenyl-1, 2、3、6-tetrahydropyridine注射(MPTP药物),和MPP +被命令从σ(圣路易斯,美国)。胎牛血清来自HyClone(美国沃尔瑟姆)。ELISA试剂盒都从IBL(德国)。所有抗体都购自Abcam(英国),BD生物科学(CA)圣何塞,BD(富兰克林湖,新泽西),BioLegend(英国剑桥)。显色包被命令从上海到Ruicheng生物技术有限公司(上海,中国)。SH-SY5Y细胞系是来自上海细胞生物学研究所中国科学院。
2.2。道德的声明
在这项研究中描述的所有动物实验和脐带组织收集经伦理委员会批准的148医院,郑州大学第二附属医院。
2.3。隔离和hUC-MSCs的识别
hUC-MSCs人类脐带中分离培养如前所述[22]。培养细胞的表型特征fluorescence-activated细胞表面抗原表达的排序。细胞通过3收获0.05%胰蛋白酶/ EDTA, resuspended磷酸盐,统计。然后, CD19和CD34细胞染色(BD生物科学,圣何塞,CA), CD11b和CD73 (BD Immunocytometry系统,富兰克林湖,新泽西),CD90、CD105、CD45、HLA-DR (BioLegend,剑桥,英国)。样本分析与光敏电阻二流式细胞分析仪(BD生物科学)和至少10000事件是对每个样本。使用流式细胞仪进行数据采集和分析女主角软件(BD生物科学)。
2.4。脂肪形成的分化
hUC-MSCs通道3被播种在完全培养基six-well盘子一式三份的最终密度5000细胞/厘米2根据以前的报告做了一些调整(30.0]48小时后,指定为天,分化开始使用脂肪形成的诱导培养基(AdvanceSTEM脂肪形成的分化培养基补充补充AdvanceSTEM干细胞增长10%,热科学、罗克福德,IL),根据制造商的指示。媒介是改变每3 - 4天,实验3周后终止。分化hUC-MSCs被固定为4%多聚甲醛(PFA)和沾oil-red-O(包含IHC世界,伍德斯托克,MD)可视化细胞质lipid-rich液泡。
2.5。成骨分化
成骨分化被治疗subconfluent诱导MSC文化与成骨诱导介质通道2 (AdvanceSTEM成骨分化中,补充补充AdvanceSTEM干细胞增长10%,热科学)21天,根据制造商的指示和以前的报告30.]。实验进行了一式三份。成骨的潜力被冯Kossa检查对细胞外基质钙化的方法使用商用设备(包含IHC世界)。文化是在室温下用硝酸银治疗60分钟在紫外线照射下,接着用硫代硫酸钠为5分钟。核的细胞复染色快红,然后使用相差显微镜拍照。ImageJ软件被用于矿化的量化矩阵。
2.6。Chondrogenic分化
软骨形成诱导micromass颗粒文化中根据以前的报告做了一些调整(30.]。Micromass颗粒文化准备 hUC-MSCs(3)通过15毫升聚丙烯管,在150 g离心10分钟在完全培养基。细胞颗粒孵化与感应介质(AdvanceSTEM chondrogenic分化中,热科学)为3周。每个颗粒石蜡包埋后脱水和切成薄片(4 - 5μ米),分析了部分chondrogenic分化使用商用阿尔新蓝装备(包含IHC世界,伍德斯托克)。染色,部分被固定为4% PFA和用蒸馏水洗净之后,治疗阿尔新蓝了20分钟。21天之后,micromass文化与甲醇和固定与阿尔新蓝染色。阿尔新蓝提取6 M盐酸胍和吸光度是阅读在620海里。所有实验进行了一式三份。
2.7。制备hUC-MSCs-CUR
hUC-MSCs激活时使用不同浓度的坏蛋(0、1、2.5、5、10、15、20、25μmol / L)。细胞增殖检测使用CCK-8分析工具(每组一式三份,执行三次)。DMSO溶液的浓度一样CUR组被用作控制来检测是否DMSO对细胞有毒性作用。
2.8。制备PD动物模型
女性C57BL小鼠(6 - 8周)重约 克被用于PD动物模型的制备,如前所述[31日]。二十个老鼠被随机选择控件。剩余的80小鼠腹腔注射250毫克/公斤丙磺舒和注射了MPTP药物(皮下,25毫克/公斤)30分钟后,每周两次为5周。三注射后,小鼠出现症状,比如严重的震动,不愿动,不协调的步态,竖起尾巴,头发脱落,偶尔seizure-like攻击。然而,2 h后注入,这些反应慢慢恢复正常,但注射与越来越多的MPTP药物注射,症状持续时间逐渐变得更长,帕金森病的症状逐渐变得稳定。五周后,开放现场试验(北京金元科创科技有限公司,中国)和rotarod测试(美国尤格Basile)是用于验证PD小鼠模型是否被成功建立。
2.9。开放的现场试验
一个 玻璃的塑料箱, 网格底部的盒子。执行的测试是在一个安静的、昏暗的环境。10分钟后小鼠适应环境,饲养的数量和移动计算在5分钟之内。5进行了测量,采用平均值进行分析。
2.10。Rotarod测试
老鼠pretrained rotarod 3天。老鼠不协调运动被排除在外。老鼠被放置在旋转rotarod (16 rpm),和时间计算。延迟下降被定义为时间的老鼠rotarod住,也就是说,老鼠的首次下降。的次数从2分钟内杆(频率下降)代表运动和协调的能力。每个老鼠都评价三次30分钟的间隔。中值被用于分析。根据文献[22,32],在开放的现场试验,饲养的数量小于15次/ 5分钟,步行不到55次/ 5分钟。在rotarod测试中,一个成功的建立帕金森病小鼠模型的验证是少于30年代的延迟和超过20滴/ 2分钟。五周之后,意外死老鼠被排除在外,老鼠的总数符合规定的标准,60岁以上。
这些老鼠被随机分配到四组:(1)模型组(老鼠注射了MPTP药物和丙磺舒没有任何治疗),(2)MSC集团(通过尾静脉注射hUC-MSC悬架),(3)MSC-CUR集团(通过尾静脉注射hUC-MSCs-CUR悬架),和(4)F12集团(注射等量的F12培养基)。在注射之前,细胞悬液洗了PBS去除血清和200年resuspended三倍μL的F12培养基(通过4,大约107/细胞/公斤)。hUC-MSCs和hUC-MSCs-CUR悬挂注入PD小鼠每周8周。为了充分展示MSC函数的有效性,老鼠不接受任何材料在未来8周后MSC注入。在八周后,小鼠与开放的现场试验和测试rotarod再次测试,牺牲了整个大脑的快速解剖,PFA固定在4%。
2.11。的表达在SN和CS
免疫组织化学是用来检测TH SN和CS的表达。石蜡切片(4μ米)deparaffinized直到脱水,然后孵化3% H2O210分钟。部分在蒸馏水洗涤,浸泡在磷酸盐(PBS) 5分钟,然后用兔子孵化anti-TH抗体溶液(Abcam 1: 300年,剑桥,英国)在一夜之间在4°C。HRP-conjugated二级抗体被用来可视化染色(金桥国际1:2000年,北京,中国)。十个串行CS部分(50的间隔μ从每个动物(m为每个部分) 为每个组)被用来量化的表达TH。分析了染色Image-Pro + 5.0软件(美国媒体控制论)。
2.12。bcl - 2表达TH、NADPH-d,伯灵顿,裂解半胱天冬酶3
CS从一个半球是隔绝PD小鼠行为测试后的每组(每组5老鼠)。冰冷的CS样本均质里帕裂解缓冲(Beyotime、上海、中国)。均质样品在12000 g离心20分钟在4°C。免疫印迹的上层清液收集。sds - page电泳的蛋白质分离和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。膜被封锁的脱脂奶粉5% Tris-buffered盐水(TBS)与渐变(TBST;TBS + 0.1%渐变20)1 h和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。以下主要抗体被用于:TH, NADPH-d, bcl - 2,伯灵顿,裂解半胱天冬酶3 (Abcam兔免疫球蛋白g, 1: 1000年,剑桥郡,英国)。以下二次抗体被用于:山羊anti-rabbit免疫球蛋白/合(金桥国际1:5000年,北京,中国)和兔抗体免疫球蛋白/合(金桥国际1:5000年,北京,中国)。乐队的强度是量化使用ImageJ软件。 The level of expression for the target protein was calculated as the ratio of the band intensity of the target protein over that ofβ肌动蛋白。
2.13。检测DA水平PD CS的老鼠
五个老鼠的CS存储在液氮中。DA测量如前所述[33]。短暂,样本解冻向新的1.5毫升0°C和分布式微型离心机管(125μL /管);500年μL(乙腈(一个)/ 0.4%冰醋酸在-20°C (HAc)添加到每个管。管是涡20年代和离心机15分钟在12000 g 2°C。浮在表面的蒸发在真空CentriVap™集中器(Labconco)。干燥是在100年被解散μL的流动相,放置在autosampler瓶。量化的DA进行使用PowerChrom软件(eDAQ Pty Ltd .) Deniston东部,澳大利亚)与标准曲线和峰面积的方法。ISO作为内部标准来弥补在净化过程中回收率的变化。测定了一式三份。
2.14。MSC跟踪
MSC被贴上DiI(美国圣路易斯σ),通过尾静脉接种MSC组和MSC-CUR组老鼠。一天后,老鼠灌注intracardially PFA PBS紧随其后的是4%。固定的大脑被cryoprotected蔗糖梯度(15%其次是30%的隔夜)和嵌入在10月化合物(VWR BDH Prolab, Boxmeer,荷兰)。日冕cryosections(8毫米)与DAPI染色(表达载体)核复染色。与绿色荧光蛋白染色。荧光图像捕获利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM、奥林巴斯、日本)和Volocity演示6.2.1软件(美国弗里蒙特PerkinElmer)。
2.15。条件培养基的制备
LCUR (5μ摩尔)添加到hUC-MSC介质24 h与无菌PBS和清洗三次。的细胞在无血清培养基培养48 h。浮在表面的吸引,离心机在4°C和3000 r / min使用超滤管1.5 h,三次,浓度被证实原来的上层的10倍。然后低温贮藏在-80°C。的hUC-MSC上层清液集中使用相同的方法。
2.16。增殖和凋亡的SH-SY5Y CCK-8化验和流式细胞术检测到
在这项研究中,SH-SY5Y细胞治疗MPP +(1000年的最终浓度μmol / L)被用作一个帕金森病细胞模型。SH-SY5Y细胞( ,100年μL)在96 -孔板和镀分为六组:对照组(1):细胞如果不治疗,(2)控制+ CM-MSC (CM-MSC + C)组:SH-SY5Y后细胞培养12 h和10μL CM-MSC被添加到媒体,(3)控制+ CM-CUR + C (CM-CUR + C): SH-SY5Y后细胞培养12 h和10μL CM-CUR被添加到介质,(4)模型组:SH-SY5Y后细胞培养12 h和MPP +添加额外的24小时孵化的媒介,(5)模型组+ CM-MSC (CM-MSC + M):模型组+ 10μL CM-MSC,(6)模型组+ CM-CUR (CM-CUR + M):模型组+ 10μL CM-CUR。这些细胞被孵化24和48 h,和10μL CCK8的解决方案是添加到每个。盘子被孵化2 h,吸光度测量使用标在450海里。
SH-SY5Y细胞治疗和0.25%胰蛋白酶消化离心10分钟,每分钟1000转,上层的移除。细胞被洗两次与PBS和70%乙醇固定。细胞在1000转离心10分钟,在PBS洗两次,调整浓度 在0.5毫升;0.5毫升的核糖核酸酶在PBS(1毫克/毫升)被添加到细胞中。5毫升的膜联蛋白V-FITC补充道,轻轻混合,孵化在黑暗中在室温下15分钟。温和的混合后propidium碘(PI)(在最后50 mg / L)的浓度,细胞被过滤和孵化在黑暗中在4°C流式细胞术之前30分钟。
2.17。表达TH和MAP2 SH-SY5Y细胞免疫荧光和免疫印迹
孵化后48 h,浮在表面的被丢弃。这些细胞被固定在4% PFA 10分钟。在PBS两次洗涤后,每5分钟一次,1%的牛血清白蛋白(BSA)是用于阻止了30分钟。细胞培养和兔子anti-TH MAP2主要抗体(Abcam兔免疫球蛋白g, 1: 500年,剑桥,英国)稀释1% BSA在一夜之间在4°C。细胞与PBS冲洗两次,每次5分钟。细胞治疗与二次抗体(37°C 1 h, Abcam,剑桥,英国)。这些细胞被沾染了5μ美国DAPI g / mL(σ)2分钟和荧光显微镜下观察。与CM-CUR或CM-MSC 96 h孵化后,这些细胞被收集到溶解溶液和免疫印迹进行如上所述。
2.18。超微结构的观察
hUC-MSCs与坏蛋被激活,PBS三次,清洗和离心机。浮在表面的丢弃,和细胞转移到1.5毫升埃普多夫管和固定在4°C甲醛3天。后脱水、包埋和染色。透射电子显微镜下观察超微结构的变化。
2.19。检测ELISA的上层清液中细胞因子的表达
上层清液和涂层缓冲区(0.5 mol / L NaHCO3缓冲区,pH值9.6)涨跌互现的比率1:1。ELISA试剂盒都从IBL(德国)。所有抗体都购自Abcam(英国),BD生物科学(CA)圣何塞,BD(富兰克林湖,新泽西),BioLegend(英国剑桥)。化验进行根据制造商的指示。
2.20。统计分析
使用SPSS 10.0统计分析(SPSS Inc .)、美国)。数据了 和测试使用的学生 - - - - - -测试或单向方差分析(方差分析)其次是Newman-Keuls或Bonferroni作为事后的多个比较测试测试。 被认为是具有统计学意义。在这项研究中,所有实验进行三次,意味着值被用于分析。结果免疫细胞化学和免疫印迹分析Image-Pro + 5.0图像分析仪(美国媒体控制论)。集成光密度(IOD)和相对丰度是评价统计分析。
3所示。结果
3.1。hUC-MSC隔离、表型鉴定和分化
流式细胞仪显示hUC-MSCs造血标记CD19呈阴性,CD34、CD45和淋巴细胞表面标记HLA-DR,虽然他们高度表达间充质标记CD73 CD90、CD105。图1(一)显示每个标记流式细胞术数据代表。我们下一个调查能力分化成多种间充质血统(图1 (b)),我们发现hUC-MSCs可以诱导成脂肪(a),骨(b)和(c)软骨细胞。hUC-MSC准备之前进行微生物和内毒素检测被用于动物(表1)。
(一)
(b)
3.2。制备hUC-MSCs-CUR
CCK-8并未改变与坏蛋在0 - 5的范围μmol / L,这表明增殖和凋亡发生在hUC-MSCs这些浓度。坏蛋浓度进一步增加,CCK-8 hUC-MSCs开始减少,出现了显著下降当坏蛋浓度> 10μmol / L(所有 )(图2)。DMSO没有影响CCK-8表达式(数据未显示)。根据这些结果,5μmol / L的坏蛋了hUC-MSC介质24 h。hUC-MSCs被洗了三次无菌PBS和孵化F12培养基有10%血清48 h。
3.3。hUC-MSCs-CUR移植改善PD小鼠的行为
图3(一个)提出了一种模式详细PD小鼠模型的建立方法和注入msc、与动物的数量。与控制的老鼠相比,小鼠与PD呈现典型的症状,比如步态蹒跚,自发活动减少,容易愤怒,直竖起尾巴,肢体僵硬和缓慢和不协调的肢体运动。这些症状在治疗后缓解hUC-MSCs和hUC-MSCs-CUR。确定hUC-MSC的影响和hUC-MSCs-CUR PD小鼠上移植,空旷的田野和rotarod测试用于检查汽车的能力。
(一)
(b)
(c)
(d)
在开放的现场试验,饲养的平均数量在5分钟内对照组 ,相比之下, 模型组( 和控制), F12组( 与控制)。干细胞治疗后,饲养的数量 和 分别MSC和MSC-CUR组明显高于模型和F12组( )。MSC和MSC-CUR团体之间的差异是重要的( )(图3 (b))。此外,移动的变化类似于饲养(图3 (b))。
如图3 (c),延迟的变化类似于饲养,而下降的一般模式相反频率在2分钟的延迟。与控制(5滴)相比,下降的频率模型(24)下降和F12组(22滴)增加( )。频率下降明显改善MSC组(12滴),MSC-CUR集团(7滴) )。有一个MSC和MSC-CUR团体之间的显著差异( )。
msc贴上DiI(红色荧光)和TH蛋白质(绿色荧光)LSCM下观察。如图3 (d),MSC贴上DiI在场PD小鼠大脑的纹状体区域的MSC和MSC-CUR,对待变化的表达式(见箭头)。这意味着msc可以进入PD小鼠的大脑通过BBB和可以分化成细胞。
3.4。hUC-MSCs-CUR增加表达式在SN和CS
如数据所示4(一)和4 (b)免疫组织化学显示,SN TH-positive细胞的数量大大降低模型和F12组与对照组相比。TH-positive细胞结构的排列不规则;轴突和树突是薄和破碎,纠结的胶质细胞的渗透可以观察到(箭头)。Brown-yellowish CS的神经纤维明显较轻。控制和模型之间有显著差异,F12组( )。
(一)
(b)
(c)
(d)
治疗后与hUC-MSCs hUC-MSCs-CUR TH-positive细胞染色黑暗和细胞的数量明显增加。出现组织细胞结构。轴突变得越来越密集。与模型组相比有显著差异( )。此外,在表达显著差异被发现在MSC和MSC-CUR组( )。TH-positive细胞长和深色染色观察轴突在CS MSC-CUR组,与MSC。因为老鼠的SN很小、隔离的基底神经节是非常困难的。为了检测TH表达,蛋白质提取为西方墨点法(图整个基底神经节4 (c)),结果显示趋势相似,通过免疫组织化学方法检测(图4 (d))。
3.5。hUC-MSCs-CUR增加DA在CS的水平
高效液相色谱(HPLC)的结果显示,与对照组相比,模型和纹状体DA水平F12组显著降低( ),虽然DA含量增加hUC-MSC和hUC-MSCs-CUR治疗后( );DA水平MSC-CUR组高于MSC集团( )(图5(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。hUC-MSCs-CUR减少烟酰胺腺嘌呤磷酸Dinuleotide硫辛酰胺脱氢酶的水平在CS (NADPH-d)
免疫印迹显示NADPH-d表达式在CS模型中增加和F12组与对照组相比 )。相比之下,MSC NADPH-d表达减少,MSC-CUR组( 和 )( )(数据5 (b)和5 (c))。
3.7。表达的CS PD小鼠凋亡因素
与控制相比,bcl - 2表达antiapoptosis因素在CS模型和F12组降低,而表达proapoptotic因子伯灵顿和裂解半胱天冬酶3增加( )。MSC和MSC-CUR组、bcl - 2表达调节和伯灵顿,裂解半胱天冬酶3表达下调(数字5 (d)和5 (e))( 与模型和F12组),效果强MSC-CUR组与MSC集团( )。
3.8。超微结构的hUC-MSCs-CUR
进一步理解机制CUR-activated hUC-MSCs,我们用透射电子显微镜观察细胞的超微结构变化。大量的粗面内质网(r,箭头, )增加相比,hUC-MSCs-CUR hUC-MSCs(图6(一))。r是一个重要的细胞器在真核细胞中,通常与蛋白质的合成和运输有关。因此,我们可以推断,坏蛋明显增强hUC-MSCs的分泌功能。在此,多种细胞因子和生长因子的上层清液hUC-MSCs-CUR被ELISA检测。HGF水平的il - 10,神经生长因子,VEGF明显调节hUC-MSCs-CUR组相比hUC-MSCs组(所有 )。g - csf表达更高的上层清液hUC-MSCs-CUR集团与hUC-MSCs组相比,肿瘤坏死因子-但没有差异α,il - 1β和il - 6(图6 (b))。
(一)
(b)
3.9。CM-CUR提升PD模型细胞的增殖
与1000年孵化后μmol / L的MPP + 24 h, SH-SY5Y细胞增殖的拒绝,但在治疗后增加和CM-MSC CM-CUR 24和48 h ( 和 )。在24 h, CM-MSC CM-CUR团体并没有显示任何显著差异。在48 h,扩散CM-CUR组显著超过CM-MSC集团( )(图7(一))。
(一)
(b)
(c)
细胞凋亡是利用膜联蛋白V / PI双染色检查。SH-SY5Y细胞的凋亡率的流式细胞术检测48 h。结果表明,细胞凋亡率 在正常SH-SY5Y细胞, CM-MSC + C组 CM-CUR + C组,相比之下 模型组, CM-MSC + M组, CM-CUR + M组(数字7 (b)和7 (c))。正常和模型细胞之间有显著差异( )。接受治疗CM-MSC和CM-CUR SH-SY5Y细胞的凋亡率显著下降( ),特别是CM-CUR CM-MSC组有差异和CM-CUR组( )(图7 (c))。
3.10。CM-CUR和CM-MSC TH和MAP2的表达增加
表达TH和MAP2 SH-SY5Y细胞下降由于MPP +伤害与正常细胞相比,( )。治疗后48 h CM-MSC和CM-CUR,免疫荧光和免疫印迹显示重要的upregulation TH MAP2 CM-MSC + M和CM-CUR + M组( 与模型组)。之间的显著差异在MAP2表达式被发现CM-MSC和CM-CUR组( )(图8)。TH和MAP2调节SH-SY5Y细胞治疗CM-CUR CM-MSC,表明SH-SY5Y细胞逐渐分化成DA神经元。
(一)
(b)
(c)
(d)
有SH-SY5Y细胞的形态学变化。正常SH-SY5Y细胞的纺锤形状类似成纤维细胞;他们通常有2 - 3过程相对较短。另一方面,SH-SY5Y边缘的细胞治疗与上层清液变得暗淡和许多长流程的长度超过两个胞体长度。这些过程的形态类似于轴突(如箭头所示)。这种现象是CM-CUR组最为明显(图8)。
后正常SH-SY5Y细胞治疗CM-MSC和CM-CUR TH CM-MSC + C表达式并没有改变,CM-CUR + C组,而MAP2表达增加。细胞CM-MSC + M组和CM-CUR + M组有很强MAP2表达和形态变化,但没有显著区别CM-MSC + M和CM-CUR + M组观察(图8)。这些结果表明,CM-MSC CM-CUR可以在一定程度上促进正常细胞的分化。
4所示。讨论
我们的研究小组一直在研究CUR多年来,特别是坏蛋的影响治疗阿尔茨海默病(AD) [34,35]。近年来,关于相似性AD和PD中枢神经系统退化性疾病,我们假设坏蛋也可以用于治疗帕金森病。在我们之前的工作中,我们发现,姜黄素是很难专心于小鼠的腹腔,由于其极低的生物利用度。因此,我们推测hUC-MSCs和坏蛋能否作为PD治疗有更好的效果。在初步实验中,我们发现5μmol / L的坏蛋没有任何治疗效果,而抗氧化和抗凋亡的影响在25μ在PD小鼠mol / L的坏蛋,这是符合文献[24]。然而,在细胞实验中,一些细胞存活25μmol / L的坏蛋。因此,治疗浓度的坏蛋是不一样的在细胞和动物实验和比较两个模型之间的不能。因此,没有坏蛋治疗组,我们专注于研究hUC-MSCs的影响和CUR-activated hUC-MSCs治疗PD的。
首先,我们检查的影响CUR-activated hUC-MSCs注射引起的PD动物模型MPTP药物/丙磺舒,这是最常见的PD动物模型(36,37]。我们发现hUC-MSCs-CUR移植明显改善PD小鼠的运动能力,如肢体僵硬和缓慢和不协调的肢体运动。此外,DA神经元的数量和TH表达式MSC-CUR组高于在MSC。
我们还研究了PD小鼠氧化应激水平,没有细胞治疗。尽管PD的发病机制仍然知之甚少,相信通过氧自由基氧化应激扮演重要的角色。众所周知,至少有三种亚型的一氧化氮合酶(NOS):诱导(间接宾语),内皮(以挪士)和神经元(nNOS)。没有合成过程中,需要NADPH-d作为电子传递的辅酶。许多作者认为NADPH-d水平的神经系统可以用作代理NOS表达(38]。在目前的研究中,NADPH-d表达式在纹状体是细胞治疗后明显下降,表明NOS表达减少,特别是在CUR-activated hUC-MSCs。NOS表达的差别,对这些,CUR-activated hUC-MSCs有更好的抗氧化应激,从而促进DA神经元的存活。检测bcl - 2显示凋亡因子的细胞凋亡因子的显著调节MSC-CUR组与MSC组相比,而伯灵顿proapoptosis因素的表达和裂解半胱天冬酶3明显减少。因此,这些研究结果有力地表明,hUC-MSCs-CUR有很强的分化和修复潜力,以及抗氧化作用和antiapoptosis能力。这样的结果是符合我们的假设基于我们以前的工作在广告34,35),即。,CUR and hUC-MSC could be used for PD treatment.
随后,实验进行观察的保护作用hUC-MSCs-CUR上层清液在SH-SY5Y PD的细胞模型。CCK-8化验的结果和流式细胞术显示,hUC-MSCs-CUR上层清液显著促进了PD模型细胞的增殖。显然,这效果优于hUC-MSCs没有坏蛋。
此外,使用免疫荧光,我们发现SH-SY5Y细胞变得暗淡,与许多长过程类似于轴突的形态当暴露于hUC-MSC hUC-MSCs-CUR上层清液48 h。这一现象CM-CUR组更明显。免疫印迹结果证实MAP2 CM-CUR组的表达。MAP2是一种特异性神经元蛋白稳定微管在postmitotic神经元的树突。同时,TH CM-MSC和CM-CUR组的水平也增加了。TH是DA的生物合成的关键酶,被认为是DA神经元的标记(11]。因此,免疫荧光显示,CM-CUR可以促进SH-SY5Y PD分化成DA神经元的细胞模型在某种程度上。这些数据也许支持动物模型结果,强烈建议CUR-activated hUC-MSCs可以用来治疗帕金森病。
进一步检查治疗效果的机制CUR-activated hUC-MSCs,我们观察到的超微结构变化CUR-activated hUC-MSCs。我们发现r CUR-activated hUC-MSCs hUC-MSCs更丰富的比。r是复杂的功能结构的制备工艺平sac-like核糖体、内质网和与原子核的外膜。r的主要功能是合成大的蛋白质分子(39]。因此,与丰富的蛋白质合成细胞通常有相对发达的r (40]。ELISA表明,il - 10的表达,HGF,神经生长因子,VEGF是调节相比hUC-MSCs hUC-MSCs-CUR的上层清液中。只增加了g - csf表达hUC-MSC上层清液。最近的研究表明,免疫反应和炎症参与帕金森病的发病机理,和注意力都给了角色的进展和治疗PD的细胞因子(41- - - - - -44]。il - 10可以减轻炎症反应和抑制生产和释放等促炎因子TNF -α,il - 1β,il - 6 (41- - - - - -43]。il - 4也抗炎因子,但没有观察il - 4的重大变化。胶质瘤是一种多功能生长因子参与的生理病理学PD (45- - - - - -47]。VEGF是缺氧引起的血管生长因子;这是表示在大脑。它有广泛的生物效应,如神经营养,神经保护,antiapoptosis,细胞增殖,增加毛细血管的渗透性。最近的研究表明,VEGF与许多中枢神经系统疾病,如缺血性疾病,AD和PD (48]。神经生长因子是一种重要的神经营养因子,在PD治疗中起着重要作用49]。预处理与g - csf能保护DA神经元对6-OHDA[导致的神经毒性50- - - - - -52]。然而,我们的研究结果与这些报告矛盾,即。,hUC-MSCs-CUR生成一个相对少量的g - csf。总之,与hUC-MSCs相比,移植hUC-MSCs-CUR可以改善帕金森病的运动康复。这些好处可以与组合的影响hUC-MSCs和坏蛋。
近年来,许多作家提供了新的视角,应用msc PD治疗。王等人表明,缺氧能促进MSC增殖和DA神经元分化,可用于intrastriatal移植(32]。特谢拉等人试图注入检查参与组成分泌腺MSC SN和CS。检查参与组成分泌腺结果表明,强的增加DA神经元和神经终端在SNC和STR。质谱分析和Bio-Plex化验显示,检查参与组成分泌腺MSC的重要neuroregulatory分子主要是半胱氨酸蛋白酶抑制物C, glia-derived nexin, galectin-1,色素epithelium-derived因子,血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子、白细胞介素- 6和胶质细胞line-derived神经营养因子(53]。在一项由姚明et al ., nsc使用冻干MSC培养基培养和移植到PD大鼠模型。结果表明,nsc移植候选人拥有巨大的潜力治疗PD的(54]。有趣的是,据桑德琳,老鼠与猪成神经细胞移植(pNb)和MSC表现出健康的猪striata并显示神经元移植pNF70 +和TH + 120天posttransplantation神经元,而未发现猪神经元在大鼠只有pNb 63天(55]。
5。结论
我们仍然有很多工作要做在未来使用msc治疗PD的之前。灵感来自于优秀的先前的研究,未来的步骤将检测的重要分子neuroregulatory MSC-CUR使用质谱分析和Bio-Plex化验,比较MSC-CUR不同的移植方法的影响,探讨细胞MSC-CUR可以结合。更多的研究是必要的临床试验之前进行。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Yun-Liang Wang Xin-Shan Liu Hai-Tao王,郭商,和李进锋导致概念和设计;彭Yun-Liang Wang Xin-Shan Liu,鄯善王天雪,Zhi-Lei曾庆红,小鹏杨Si-Miao张魏郑,灵灵,张致词,Hai-Tao Wang和李进锋导致数据采集和数据分析和解释;Yun-Liang Wang Xin-Shan刘、王Hai-Tao和李进锋手稿参与起草或修订它至关重要的知识内容。所有作者最后批准出版的版本。Yun-Liang王、刘Xin-Shan这项研究同样起到了推波助澜的作用。
确认
这项工作是在山东省自然科学基金的支持下,中国(批准号:H0912)。我们真诚地感谢王教授宏伟(上海Realgen生物技术有限公司)项目的建议。我们还要感谢博士Jian-min兴(北京协和医学院)贡献的统计数据。