文摘

Cd14和Alpk1编码病原体识别受体和已知的候选基因影响炎性肠道疾病的严重程度。CD14充当coreceptor对细菌脂多糖(LPS),虽然ALPK1感官ADP-D-glycero-beta-D-manno-heptose,有限合伙人生物合成的代谢中间物。可以受到CD14肠道屏障的完整性,而到目前为止,ALPK1维持屏障功能的作用仍然是未知的。我们使用colon-derived 3 d瀑样,第一次增长特征,增殖,干细胞标记,和表达的紧密连接(TJ)组件使用qPCR和免疫组织化学。他们表现出特征隐窝干细胞,顶端脱落的死细胞,TJ的形成。后来,瀑样不同的基因型(WT、Il10^{- / -},Cd14^{- / -},Alpk1^{- / -})然后用有限合伙人或刺激大肠杆菌Nissle 1917 (电子商务N)基因表达和蛋白质水平的细胞因子和TJ组件进行分析。WT瀑样的表达增加Tnfα和紧密连接组件。Cd14^{- / -}瀑样表达显著减少Tnfα和Ocln比WT瀑样但LPS刺激后的反应类似于WT瀑样电子商务N刺激。相比之下,与WT相比,Alpk1^{- / -}瀑样显示不同的TJ和细胞因子基因的表达减少的反应电子商务N但不是有限合伙人。然而,免疫印迹显示ALPK1对TJ蛋白水平的影响。这些发现表明Cd14,但不Alpk1,改变了LPS刺激结肠上皮细胞,而Alpk1参与的反应在细菌的挑战。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)发病涉及微生物群之间的相互作用,环境条件、遗传因素,破坏了肠道屏障(1]。几位IBD已建立的小鼠模型2),包括研究Il10(白细胞介素- 10”)缺陷模型。该模型的特点是一个特异表达的免疫反应肠道微生物区系通过中断导致结肠炎的发病屏障由于增加干扰素γ的水平和肿瘤坏死因子-α(TNFα)[3]。使用Il10^{- / -}小鼠模型和数量性状位点(QTL)定位分析,研究已经确定了几个基因位点与对炎症性肠病的易感性有关。这些研究揭示了十细胞因子deficiency-induced结肠炎易感性(疾病预防控制中心)位点和候选基因和潜在影响结肠炎发病(4- - - - - -9]。这些基因中的一个Cd14(集群分化14)Cdcs6轨迹位于染色体18 (7]。CD14充当coreceptor toll样受体(TLR) 4,直接参与检测脂多糖(LPS)和激活NF -κB (10]。在以前的研究中,我们的团队表明,CD14对屏障完整性保护功能在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎小鼠模型(11]。我们还表明,野生型(WT)而不是Cd14^{- / -}老鼠,monoassociation大肠杆菌Nissle 1917 (电子商务N)会导致增加的表达紧密连接(TJ)组件,与防止细菌易位(12]。

另一个候选基因揭示了这些QTL研究Alpk1(alpha-protein激酶1)位于3号染色体上Cdcs1轨迹(4,5]。基因敲除的Alpk1基因在小鼠身上最近被证明当感染导致严重的结肠炎幽门螺杆菌hepaticus(13]。ALPK1函数作为腺苷diphosphate-heptose模式识别受体(ADP-Hep),有限合伙人的前体(14]。革兰氏阴性细菌的人类上皮细胞,ADP-Hep激活NF -κ通过ALPK1-TIFA-TRAF6 B-dependent炎症interleukin-8(引发)分泌轴(15]。老鼠缺乏功能引发基因,趋化因子处于受控,CXCL2, CXCL5被视为功能性同系物(16]。

研究的具体影响Il10,Cd14,Alpk1在肠道上皮细胞(IEC)细菌刺激,我们使用结肠瀑样文化源于孤立肠道干细胞(isc) [17]。这些isc可以分化成所有结肠上皮细胞系包括colonocytes,杯状细胞和一些enteroendocrine细胞类型(18]。在目前的研究中,不同的基因敲除小鼠结肠瀑样株与有限合伙人或刺激电子商务N和促炎介质的表达和紧密连接组件。在这里,我们报告,IECCd14和Alpk1影响细胞因子和TJ分量表达式在细菌的挑战。

2。材料和方法

2.1。老鼠

本研究按照德国动物保护法律和欧盟指令2010/63 /欧盟。当地机构批准的所有实验动物保健(文件:2015/78)。表型健康的女性和男性,8 - 18周大,C57BL / 6 j (WT)、C57BL / 6 j.129p2 -Il10^tm1Cgn(B6 -Il10^{- / -})、C57BL / 6 j.129s1 -Cd14^tm1Smg(B6 -Cd14^{- / -})、C57BL / 6 n (Alpk1^{+ / +}),C57BL / 6 n -Alpk1^em2Wtsi(Alpk1^{- / -}),B6.129P2 -Lgr5就^{tm1 (cre / ERT2)蜡烛}/ J (Lgr5-eGFP^{+ / -})获得的老鼠从中央动物设施(汉诺威医学院,汉诺威,德国)。所有的老鼠被安置在特定的无菌条件下单独通风笼。

2.2。瀑样的准备

协议是基于马希et al。18]。老鼠被公司牺牲₂吸入后颈椎脱臼的年龄10 - 14周。整个结肠清洗和清洗消毒,冰冷的杜尔贝科的磷酸盐(DPBS)在一个无菌的环境。所有进一步的步骤进行冰。组织了纵向切成小块,洗几次DPBS,转移到地下室螯合缓冲(CCB)(包含0.5 EDTA DPBS)和孵化摇摆平台上30分钟。与建行洗涤后,结肠部分被转移到离解缓冲区(DB)山梨糖醇(DPBS包含54.9毫米和43.4毫米蔗糖)和混合。细胞悬浮液过滤和离心细胞resuspended适当体积的基底膜基质®膜矩阵(美国纽约康宁™)(基底膜基质®)产量约1000隐窝/毫升。五十μl的cell-Matrigel®混合物是被仔细地用移液器吸取到中心的每个好24-well板、孵化30分钟凝固在37°C,并与500年覆盖μl瀑样生长媒体(DMEM、高葡萄糖,GlutaMAX™,丙酮酸(美国马萨诸塞州热费希尔科学))补充50% L-WRN-supernatant(写明ATCC®CRL3276™在DMEM高葡萄糖,GlutaMAX™,丙酮酸+ 10%胎牛血清),1 x N2(美国卡尔斯巴德表达载体),1 x B27(美国卡尔斯巴德表达载体),50 ng /μl重组鼠表皮生长因子(美国圣路易斯Sigma-Aldrich) 10μy - 27632 (Tocris,英国布里斯托尔),和1 x Cellshield (Biochrom,柏林,德国)。瀑样培养在37°C公司为5%₂。媒体交换每3 - 4天。

2.3。瀑样动力学

基底膜基质®使用冰冷的DPBS溶解,隐窝分离通过暂停了一次通过一个注射器使用27 g 1/2针。细胞被洗和播种到新鲜的基底膜基质®,它被允许巩固30分钟37°C,然后与500年覆盖μl瀑样增长媒体。照片拍摄于天1,3,5,7,9,11,13后播种。在每个时间点,三个样本获得的RNA隔离池的两个井24-well板为每个样本。

2.4。苏木精和伊红染色())

基底膜基质®嵌入式瀑样是嵌入在4%琼脂糖,一夜之间有4%福尔马林固定,脱水,切成4μ米的部分。一个标准的圆)染色。

2.5。免疫荧光染色

基底膜基质®嵌入整个彩色山瀑样。因此,他们是1 h和4%福尔马林固定。通过孵化与NH自体荧光就熄了₄Cl 1 h。Permeabilisation和阻塞表现为1.5 h马血清在DPBS Triton-X100 0.5%和10%。瀑样都沾染了老鼠anti-EpCAM / CD326-FITC,兔兔anti-occludin, anti-tight结蛋白1 (TJP1;也称为zonula occludens ZO-1),兔子anti-claudin 8(所有表达载体,卡尔斯巴德,美国),或兔子anti-Ki67 (Abcam,剑桥,英国)。非结合的抗体被一只山羊观想在第二步anti-rabbit DyLight 488抗体(美国圣地亚哥BioLegend)。中小学Triton-X100抗体稀释在0.1%,10%在DPBS马血清,孵化一夜之间在4°C。使用共焦图像获得TCS SP5显微镜系统(徕卡,位于德国)。

2.6。TUNEL染色

制备的基底膜基质®嵌入式瀑样按免疫荧光染色法进行。TUNEL染色进行使用原位细胞死亡检测装备,荧光素(罗氏、巴塞尔、瑞士),根据制造商的指示。

2.7。与LPS刺激

当我们想要激活CD14-dependent信号,低剂量的有限合伙人是必要的,因为它是已知的,更高浓度的有限合伙人导致CD14-independent TLR4信号(19,20.]。在以前的实验中使用鼠标CMT93上皮细胞系,我们测试了不同LPS浓度和时间点11]。在我们的手中,0.1μg / ml, 6个小时是最好的衡量CD14-dependent细胞因子诱导浓度和培养时间。经过10天的增长,结肠瀑样与LPS刺激(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)如前所述[11]。简单地说,媒体被删除,取而代之的是500年增长μl新的增长媒体没有Cellshield和包含0.1μg / ml有限合伙人或任何有限合伙人作为控制。后6小时37°C和5%的孵化有限公司₂,媒体被基底膜基质溶解在冰冷的DPBS®。2 - 6井池,细胞离心,在RNA resuspended Quick-RNA™微准备工具包裂解缓冲(美国欧文Zymo研究),并将其存储在-80°C以后RNA隔离。

2.8。刺激与大肠杆菌Nissle 1917

一个ampicillin-resistant GFP-expressing大肠杆菌Nissle 1917株(电子商务N)生长在37°C摇溶原性肉汤(磅)媒体包含100μg / ml氨苄青霉素,直到一个OD_600年1.0了。当我们想比较有限合伙人,电子商务N-stimulated瀑样,我们选择相同培养时间的治疗。此外,在初步实验与WT瀑样,6小时电子商务N刺激可再生产地导致肿瘤坏死因子显著增加α如果细胞基因表达和蛋白质产量相比。细菌悬液稀释1:25 Cellshield-free瀑样增长媒体。媒体瀑样增长了10天了,取而代之的是媒体和孵化bacteria-containing增长6小时37°C和5%的公司₂。媒体被免职,瀑样细胞收获了RNA隔离根据LPS刺激协议。

2.9。RNA隔离

与RNA RNA进行隔离Quick-RNA™微准备工具包(Zymo研究、美国)根据制造商的指示。

2.10。实时定量PCR (qPCR)

为量化刺激后的基因表达,1μg RNA用于互补脱氧核糖核酸合成使用QuantiTect®逆转录工具包(试剂盒®、希尔登,德国)根据制造商的指示。qPCR分析,QuantStudio™6 Flex实时PCR系统(美国应用生物系统公司™,福斯特)使用。qPCR执行使用一个TaqMan®的试验(Actb:Mm00607939_s1;Tnfα:Mm00443258_m1;Mki67:Mm01278617;LgR5就:Mm00438890_m1;Smoc2:Mm00491553_m1;Clca4b:Mm01616360_m1;美国应用生物系统公司®,培养)或SYBR™Green-Based QuantiTect®底漆化验(Actb:Mm_Actb_2_SG;Cldn4:Mm_Cldn4_1_SG;Cldn8:Mm_Cldn8_1_SG;Ocln:Mm_Ocln_1_SG;Tjp1:Mm_Tjp1_1_SG;处于受控:Mx_Cxcl1_1_SG;Cxcl2:Mx_Cxcl2_1_SG;Cxcl5:Mm_Cxcl5_2_SG;试剂盒®、希尔登,德国)。每个样本测量一式三份。Actb作为内生参考控制基因。使用2相对基因表达进行了计算^−ΔCt方法。

2.11。免疫测定

肿瘤坏死因子α在有限合伙人的上层清液——量化,电子商务N-stimulated瀑样使用ELISA马克斯™豪华组小鼠肿瘤坏死因子α(美国圣地亚哥BioLegend),根据制造商的指示。样品和标准准备一式两份,以450海里板读者(VICTOR™X3, PerkinElmer沃尔瑟姆,妈,美国)。处于受控,CXCL2, CXCL5量化使用多路复用免疫测定(美国ProcartaPlex,生活技术,卡尔斯巴德)根据制造商的指示。平行测定浓度标准曲线为每个参数。

2.12。免疫印迹分析

瀑样分析了TJ表达的免疫印迹分析和有限合伙人或治疗后电子商务n瀑样均质homogenisator用纸巾(超Turrax, IKA®-Werke GmbH & Co .公斤)。蛋白质提取和利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到硝酸纤维素,并使用主occludin的抗体,免疫印迹claudin8, zonula occludens-1(表达载体),和claudin4 (Abcam)。GAPDH免疫印迹(美国新泽西州GenScript USA Inc .)是作为内部控制。孵化后二次抗体(驴anti-rabbit免疫球蛋白(合);Abcam),膜的开发与化学发光的解决方案(美国加州Bio-Rad实验室、大力神)和图像是用一个ChemiDoc™触摸成像系统(Bio-Rad)。通过ImageJ污点分析软件(开源)。

2.13。统计分析

所有统计分析使用GraphPad Prism6®软件(美国圣地亚哥)。值代表的95%置信区间或扫描电镜。所有值都是归一化到相应的如果控制在每一个独立的实验。因此,如果控制值计算值为1。当两个条件比较,未配对 - - - - - -测试执行。在其他情况下,单向方差分析Dunnett紧随其后的多重比较刺激的测试是用来比较值这三个基因敲除基因型WT瀑样样品。在不平等的方差的情况下,一个Brown-Forsythe和韦尔奇方差分析测试。 被认为是显著的。表明 , 表明 , 表明 ,和表明 。

3所示。结果

3.1。结肠瀑样扩张和区分,直到第十天前降低

使用注射器瀑样分离后,照片被增长的文档(图1(一))。已经在第一天,我们观察到小colonospheres直到第三天的规模增长。在第五天,大多数colonospheres开始循环中心周围形成隐窝,表明colonoid状态。死细胞脱落进入腔内。7天,只有微小的变化被观察到的第五天。9天,结肠瀑样基底膜基质中均匀分布和发展®。11天开始,瀑样开始打开,导致死细胞和碎片坐落在结肠瀑样。最后,13天,大多数瀑样都瓦解。在每个时间点,从瀑样后分离出RNA基因表达分析。RNA浓度增加,直到第五天,保持稳定,直到天11日之后,他们迅速下降到13天。

在瀑样描述细胞增殖,Ki67表达式被qPCR在mRNA水平决定。的增加Ki67基因表达发生与表达下降到第五天第七天。媒体改变后7天,Ki67表达增加,一直增加,直到另一个媒体变化在10天之后,表情变得相当变量。这导致广泛分布表达式值在11天。13天,Ki67 mRNA不再是在任何瀑样检测。IEC的基因表达的基因Smoc2和LgR5就分析和显示一个类似的表达式模式Ki67。相比之下,增殖抑制剂和上皮分化的基因表达标记Clca4b(21)很低,主要是稳定了9天,之后表达增加,直到13天。此外,基因表达TJ组件等Ocln,Tjp1,Cldn4,Cldn8分析了。类似的表达水平检测在1和13天Ocln和Tjp1,而Cldn4增加,Cldn8在(图13天下降迅速1 (d))。因此,我们决定执行所有进一步的实验使用瀑样增长10天后,形态学显示隐窝和增殖水平还高。

3.2。结肠瀑样代表完全分化结肠上皮细胞

我们在10天大的瀑样)进行染色部分分析iec的分化和生长状态(图2(一个))。在环形腔,一个完全分化与隐窝上皮细胞形成,主要由肠上皮细胞和mucus-containing杯状细胞。几个LGR5-positive细胞(图2 (b))出席隐窝的底部,而大量的Ki67-positive细胞(图2 (c))是位于基础和地下室,没有发现其他瀑样。死细胞腔中收集证实了整个山TUNEL染色(图2 (d))。瀑样细胞层呈阳性上皮细胞粘附分子(EPCAM或CD326)证实了这些细胞为上皮细胞(图2 (e))。这些细胞也呈阳性细胞内TJ蛋白occludin (OCLN)(图2 (f)),紧密连接蛋白1 (TJP1)(图2 (g)(图)和claudin-8 (CLDN8)2 (h))。

3.3。减少的表达紧密连接组件和炎性反应Cd14^{- / -}上皮细胞在LPS刺激

6小时LPS刺激后,核糖核酸或蛋白质从瀑样采集标本,不同基因的表达水平在紧密连接(Ocln,Tjp1,Cldn4,Cldn8)(图3并补充图1)和免疫反应(Tnfα,处于受控,Cxcl2,Cxcl5(图)进行分析4)。调整批处理效果,所有值归一化到相应的如果控制在每一个独立的实验。WT瀑样相比,Ocln表达显著增加Il10^{- / -}瀑样后暴露在有限合伙人,但明显减少Cd14^{- / -}瀑样LPS刺激后(图3(一个))。免疫印迹分析OCLN后没有显示出所有瀑样的差异(图6 h LPS刺激3 (b))。基因和蛋白的表达Tjp1不是任何有限合伙人后瀑样改变的挑战(数据吗3(一个)和3 (b))。有限合伙人风险显著增加Cldn4表达在WT和Il10^{- / -}和略Alpk1^{- / -}瀑样(图3(一个))。在Cd14^{- / -}瀑样,Cldn4表情略下降在有限合伙人曝光。这些差异是在蛋白质水平(图无法察觉3 (b))。至于Cldn8所有基因型(图,表达水平保持不变3(一个));然而,CLDN8表达增加Alpk1^{- / -}瀑样LPS刺激后(图3 (b))。

LPS刺激后,促炎的基因表达Tnfα增加在所有瀑样,但这增加明显少Cd14^{- / -}瀑样而WT瀑样(图4(一))。蛋白质水平的TNFa瀑样尤其是蛋白质也增加了Il10^{- / -}上皮细胞。相反,肿瘤坏死因子α分泌并不增加Cd14^{- / -}LPS刺激后上皮细胞(图4(一))。趋化因子处于受控,Cxcl2,Cxcl5增加LPS刺激后的调查瀑样基因型、WT和Alpk1^{- / -}(数据4 (b)- - - - - -4 (d))。然而,多元分析处于受控,CXCL2, CXCL5透露只WT瀑样的增加。Alpk1^{- / -}上皮细胞显示趋化因子表达仅有小幅上升。因此,有限合伙人触发促炎效应在所有观察到的瀑样,但效果较低Cd14^{- / -}和Alpk1^{- / -}上皮细胞。此外,TJ组件的表达式Ocln和Cldn4受有限合伙人在吗Cd14^{- / -}瀑样和CLDN8似乎改变了Alpk1^{- / -}上皮细胞。

3.4。Alpk1缺乏影响表达式后紧密连接组件大肠杆菌Nissle 1917感染的结肠瀑样

6小时后电子商务N刺激,基因和蛋白质表达紧密连接和炎性细胞因子的测定(数字5和6并补充图1)。WT和Il10^{- / -}瀑样没有变化Ocln和Tjp1表达式比未感染的控制(数字5(一个)和5 (b));Ocln表达显著增加Cd14^{- / -}瀑样(图5(一个))。在电子商务N感染,Alpk1^{- / -}瀑样有轻微但不显著下降Ocln表达式(图5(一个))。然而,免疫印迹分析显示OCLN水平增加而WT瀑样(图5 (b))。

显著降低Tjp1表达式是用Alpk1^{- / -}上皮细胞,但没有差异探测TJP1水平在所有基因型(数字5(一个)和5 (b))。Cldn4表达显著增加在电子商务N暴露在所有基因型虽然只有增加CLDN4表达决心Alpk1^{- / -}瀑样(图5(一个)和5 (b))。Cldn8在WT表达显著升高,Il10^{- / -},Cd14^{- / -}瀑样上电子商务N刺激但明显不是Alpk1^{- / -}瀑样(图5(一个)和5 (b))。然而,增加蛋白表达测定Alpk1^{- / -}上皮细胞(图5 (b))。

后电子商务N刺激,Tnfα/肿瘤坏死因子α对所有瀑样表达升高,但这增加显著降低Cd14^{- / -}而WT瀑样(图6(一))。的表达处于受控,Cxcl2,Cxcl5增加在电子商务N暴露在WT和Alpk1^{- / -}瀑样,但增加处于受控和Cxcl5表达明显降低Alpk1^{- / -}瀑样相比WT瀑样(数字6 (b)- - - - - -6 (d))。

在趋化因子的分泌没有区别Alpk1^{- / -}瀑样和WT浮在表面的上皮细胞中观察到的多路复用分析(数据6 (b)- - - - - -6 (d))。

在一起,我们的数据显示(我)下降Ocln和Tnfα基因表达在LPS-stimulatedCd14^{- / -}瀑样相比WT上皮细胞;(2)增加CLDN8 LPS刺激后蛋白表达Alpk1^{- / -}细胞;(3)减少Cldn8,处于受控,Cxcl5基因表达和蛋白表达增加TJ组件如CLDN4 CLDN8, OCLN电子商务N-stimulatedAlpk1^{- / -}瀑样相比刺激WT瀑样;,少(iv)Tnfα/肿瘤坏死因子α生产Cd14^{- / -}细胞与WT上皮细胞相比。总之,这些数据表明Cd14,但不Alpk1,改变了LPS刺激结肠上皮细胞,而Alpk1更参与炎性反应的细菌的挑战。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们利用colon-derived 3 d瀑样来自WT,Il10^{- /- - - - - -},Cd14^{- / -},Alpk1^{- / -}基因敲除小鼠来研究整个反应纯化有限合伙人或革兰氏阴性细菌。我们首次展示了一个角色在TJ组件监管ALPK1感染革兰氏阴性细菌电子商务n .此外,我们的研究结果证实CD14在LPS-triggered促炎和TJ组件响应11]。尽管有报道Il10在iec(表示22),IL10本身主要是由免疫细胞产生的,它的功能调节肠道内稳态和屏障完整性通过其抗炎作用[23,24]。在我们的研究中,缺乏IL10没有改变结肠瀑样的反应电子商务N WT细胞相比。

有几种变化描述文化、独立,通过3 d瀑样导致不同时期的生长和分化18,25,26]。我们分离的隐窝干细胞发展成colonospheres在24小时内。观察到的增长与RNA浓度的增加,扩散,干细胞基因的表达在第一个5天。瀑样生长和分化是高度依赖于媒体提供的组件。我们假设的下降Ki67,Lgr5就,Smoc2表达后第五天了从消费分化抑制剂的y - 27632。媒体交换后,瀑样数量激增,形成更多的隐窝。十一天后播种,瀑样开始打开,13天,他们几乎一致中断。在另一项研究通过Thalheim et al。27]调查肠瀑样的增长模式,不同的上皮细胞类型的平衡分数后达到10天。当我们观察到瀑样后10天,LGR5就和KI67-positive iec在隐窝的底部显示增殖干细胞数量。肠上皮细胞和食用人口被)染色观察,杯状细胞,免疫荧光染色和细胞结,肠道脱皮和细胞营业额是可见的。因此,我们选择第十天开始以来我们的刺激和感染实验在这个时间点结肠瀑样是可行的,分化,并演示了成熟细胞连接和crypt-villus结构。

IEC主要是暴露在细菌和有限合伙人在顶端表面;然而,基底外侧表面也暴露当屏障受损或入侵病原体感染。几项研究已经观察到影响生理浓度的基底和水应用LPS IEC TJ渗透率(28- - - - - -30.]。感染的3 d瀑样依赖于被认为应变(31日]。在人力等人在2016年的一项研究中,极化T84细胞被感染电子商务N [32]。顶端电子商务N感染引发的轻微upregulation处于受控Il8的差别,对这些基因的表达。当基底外侧的感染,电子商务N极大地增强了的表情Il8和处于受控(32]。在我们瀑样系统,刺激和感染在基底外侧表面上执行电子商务N感染引起上皮细胞活化在这个网站。

有限合伙人是其被TLR4 / CD14分子模式。信号通过TLR4 / CD14导致NF -κB基因表达激活和随后的促炎(33]。在我们的研究中,我们使用LPS浓度为0.1μg / ml,这是为了诱导上皮反应在体外(11]。经过6个小时的LPS刺激或电子商务N感染,所有瀑样线(WT,Cd14^{- / -},Il10^{- / -},Alpk1^{- / -})的表达增加Tnfα,证明一个积极的对刺激的反应。然而,增加的Tnfα/肿瘤坏死因子α表达的Cd14^{- / -}瀑样低WT瀑样相比,验证CD14在LPS-triggered炎性信号的作用20.]。

ALPK1不承认有限合伙人本身而是参与有限合伙人生物合成代谢中间物。因此,我们的研究结果证实,缺乏ALPK1几乎影响了IEC促炎反应有限合伙人单独接触,如肿瘤坏死因子α表达相似而LPS-stimulated WT细胞。在iec的细菌感染,ALPK1已被证明通过TRIF / TRAF6 NF -信号κB,引发促炎细胞因子的分泌IL8和肿瘤坏死因子α(34]。然而,upregulation趋化因子处于受控和Cxcl5明显少Alpk1^{- / -}瀑样感染电子商务N WT瀑样相比,但一个Alpk1淘汰赛不导致减少促炎介质的水平浮在表面的细菌刺激结肠瀑样。因此,在我们的实验装置中,缺乏ALPK1并未导致减少促炎介质的水平显示一个小的角色ALPK1在上皮细胞信号通路。

WT瀑样LPS刺激后,我们没有观察到TJ组件基因的表达变化Ocln,Tjp1,或Cldn8但记录显著增加Cldn4表达式。电子商务N感染WT瀑样增加Cldn4和Cldn8表达,暗示这些细菌的积极影响IEC障碍。WT occludin的蛋白质含量没有差异Il10^{- / -},Cd14^{- / -}瀑样建议推迟TJ监管。然而,Ocln表达显著降低Cd14^{- / -}瀑样在有限合伙人曝光。此外,Cd14^{- / -}瀑样较低水平的表达Cldn4在LPS刺激。作为occludin紧密连接的稳定性中起着重要的作用,这些基因表达数据支持早期的发现我们组展示CD14肠道屏障功能的保护作用[11]。类似的减少基因表达未见在TJ组件Cd14^{- / -}瀑样用电子商务N感染,暗示可能上下文有限合伙人表示TLR4 / CD14的差异。我们已经说明了在活的有机体内所需,epithelial-immune细胞相声可以CD14-dependent肠道屏障的损伤电子商务N感染(12,35]。另外,等PRRs TLR2可以补偿缺乏CD14 [36]。

此外,感染整个革兰氏阴性细菌显示在所有分析TJ蛋白显著增加Alpk1^{- / -}瀑样,而RNA表达水平Tjp1和Cldn8下降。这些结果表明,ALPK1调节紧密连接组件表达式中扮演一个重要的角色在IEC这可能,反过来,导致改变IEC障碍。相比之下,ALPK1并不影响nonhematopoietic隔间h . hepaticus全身的结肠炎小鼠模型。相反,ALPK1 IL12生产骨骨髓来源的规定影响巨噬细胞(13]。

我们组之前描述的Alpk1作为一个Cdcs1轨迹的候选基因IL10 deficiency-induced小鼠结肠炎严重程度(4),最近被一个T cell-dependent角色ALPK1结肠炎进展(5]。我们目前的研究显示的影响Alpk1在应对上皮屏障组件电子商务N和因此可能容忍共生的细菌。一个缺陷Alpk1可能因此导致屏障功能的破坏细菌感染和colitogenic炎症的恶化的原因。未来的研究关于炎症性肠病和肠道屏障完整性应调查Alpk1端依赖信号参与疾病进展。

数据可用性

原始数据支持这个手稿的结论可从相应的作者合理请求任何合格的研究人员。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

帕斯卡尔•布鲁克斯苏珥Bruegge说说话,安德烈·布莱西,和曼布特尼同样起到了推波助澜的作用。

确认

我们感谢安雅Siebert优秀的技术援助和史蒂文·塔尔博特支持统计分析。这项工作是由R2N,下萨克森州的联邦国家。

补充材料

补充图1:检测的TJ蛋白免疫印迹分析溶菌产物从瀑样后6 h (LPS刺激(A)和(B) EcN刺激。(A)样本加载在一个随机的顺序为从左到右:膜1:WT控制,Il10^{- / -}+ LPS、WT + LPS, Il10^{- / -}控制、Cd14^{- / -}控制,Il10^{- / -}控制、Cd14^{- / -}控制、Cd14^{- / -}控制,Il10^{- / -}控制;膜2:WT + LPS、WT + LPS、WT控制、WT控制,Cd14^{- / -}+ LPS, Il10^{- / -}+ LPS, Il10^{- / -}+ LPS, Cd14^{- / -}+ LPS, Cd14^{- / -}+有限合伙人;膜3:occludin: WT控制,Cd14 WT有限合伙人^{- / -}控制、Cd14^{- / -}+ LPS, Il10^{- / -}控制,Il10^{- / -}+ LPS, Alpk1^{- / -}控制,Alpk1^{- / -}+ LPS、WT +有限合伙人;TJP1 claudin 4和GAPDH: Alpk1 claudin 8日^{- / -}控制,Alpk1^{- / -}控制,Alpk1^{- / -}控制,Alpk1^{- / -}+ LPS, Alpk1^{- / -}+ LPS, Alpk1^{- / -}+有限合伙人。(B)样本加载如下从左到右:WT控制、WT + EcN, Cd14^{- / -}控制、Cd14^{- / -}+ EcN, Il10^{- / -}控制,Il10^{- / -}+ EcN, Alpk1^{- / -}控制,Alpk1^{- / -}+ EcN, WT + EcN。(补充材料)