间充质干细胞从人类脱落乳牙和口轮匝肌的肌肉:他们如何表现当暴露于炎性刺激?

文摘

间充质干细胞(msc)研究了一种有前途的干细胞用于细胞疗法,因为他们调节免疫反应的能力。虽然他们是经典孤立于骨髓,许多研究试图分离msc的来源。本研究的目的是评估msc隔绝人类脱落乳牙牙髓(流)和片段的口轮匝肌的肌肉(OOMDSCs)的行为当炎症治疗干扰素-γ刺激,特别是关于其增殖、成骨和免疫调节的潜力。结果表明,流的扩散和抑制了OOMDSCs干扰素-γ他们的培养基,用干扰素治疗γ在更高浓度导致这些细胞增殖的抑制作用大于用干扰素治疗γ在低浓度。棚、OOMDSCs保持成骨分化潜能与干扰素刺激后γ。此外,摆脱和OOMDSCs已被证明有低免疫原性,因为他们缺乏表达HLA-DR和costimulatory分子CD40、CD80和CD86前后干扰素-γ治疗。最后,摆脱和OOMDSCs表示免疫调节分子HLA-G,干扰素-后这种抗原的表达增加γ治疗。特别是,增加细胞内观察HLA-G表达式。获得的结果表明,摆脱和OOMDSCs缺乏免疫原性和免疫调节特性增强时接受干扰素-炎症刺激γ,打开新的视角对这些细胞的治疗用途。

1。介绍

间充质干细胞(msc)多功能细胞能够分化为中胚层细胞谱系,包括内层,成骨细胞和脂肪细胞(1,2]。此外,必须存在三个基本特征分类细胞与新生儿或成人组织文化作为一种文化的msc (3]。首先,msc能坚持细胞培养瓶的塑料。此外,至少有95%的一个孤立的,培养的细胞群必须表达间充质抗原(如CD29、CD44、CD73 CD90、和CD105),不应该表达造血和免疫细胞标记(如CD14、CD19和CD34)或内皮细胞标记(如CD31)。最后,msc应该能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞在体外特定培养条件下(3]。

虽然他们更常与捐赠者的骨髓和脂肪组织,最近的研究表明,msc还可以获得其他组织类型(4,5),细胞从不同的组织存在相当大的差异,其增殖能力和分化潜能(6]。例如,有人建议从新生儿获得msc组织增殖,分化潜能较高,可以保持较长时间的文化(到达细胞衰老)比从骨髓msc孤立6]。此外,一项由巴洛et al。7)表明,msc隔绝人类胎盘具有高增殖能力和能够融入组织再生。此外,一项由Kern et al。(8]表明,msc与脂肪组织也有增殖能力优于骨髓msc孤立。此外,这项研究表明,msc与脂肪组织脂肪形成的高潜力,能够培养长时间没有经历衰老和表型特征的丧失(8]。另一种类型的MSC,目前正在调查由于其潜在的组织工程应用是人类脱落乳牙干细胞(流)。这种类型的干细胞已经显示出巨大的能力分化成神经前体细胞,成,成骨细胞和高增殖能力(9]。此外,布埃诺et al。10]表明,msc与口轮匝肌的肌肉(OOMDSCs)获得在唇腭裂患者唇成形术手术期间能够分化成chondrogenic,脂肪形成的,成骨,骨骼肌细胞和表型和行为特征类似于msc孤立于其他组织。由于其潜在的分化成多种细胞类型,msc可用于治疗一些疾病,尤其是对组织损伤的修复。

许多治疗msc的属性也被归因于其分泌的旁分泌和内分泌影响因素。值得注意的是,msc已经被证明可以支持造血细胞的成熟和增殖,迁移到一个区域的组织损伤,招聘组织祖细胞(11),调节免疫应答通过免疫调节细胞因子的分泌和微泡含有多种生物活性分子如酶、编码和非编码rna,热休克蛋白(12]。除了最低标准定义的描述msc国际社会细胞疗法(3),它提出了msc的免疫学特性也应该用作msc的描述标准之一(13]。积极的结果在临床前试验和示范的msc在体外和动物的免疫调节效应的研究导致了数量迅速增加的临床试验的治疗潜力这些细胞已经评估了多种疾病的治疗(14]。因此,大量的不同的细胞制剂msc已经测试了近350学术机构和企业进行的临床试验的安全性和有效性自体和同种异体msc被评估。疾病的治疗潜力msc的例子已经在临床和临床前试验和评估提出了有前景的结果包括急性心肌梗死[15),移植物抗宿主病(16,系统性红斑狼疮17),类风湿性关节炎17),克罗恩病(18),多发性硬化(19),肌萎缩性脊髓侧索硬化症(20.),和I型糖尿病21]。

虽然干扰素-γ促炎细胞因子,研究表明,干扰素-γ也会影响msc的成骨的潜力。阴极射线示波器等。22)表明,CD4细胞激活⁺T淋巴细胞与人类msc cocultured促进msc分化为成骨细胞,阻断后分泌干扰素-γ与抗体,抑制成骨分化的msc。此外,一项由Duque et al。23)表明,人类msc分泌干扰素-γ,通过刺激成骨分化潜能的msc通过成骨的转录因子的表达,比如Runx2。此外,比达尔进行的一项研究et al。24)表明,msc与小鼠的报废干扰素-γ受体(IFN -γR^{- - - - - -}/^{- - - - - -})比msc下级表达Runx2野生型小鼠和隔绝,因此,更有限的成骨分化潜能。在一项由刘et al。25),这是证明了从骨髓msc孤立的潜力成骨分化抑制200 ng / mL IFN -处理γ相比之下,没有刺激干扰素-γ。然而,它也表明,治疗与干扰素- mscγ50 ng / mL的浓度没有抑制作用的成骨分化潜能msc (25]。这种差异是由于SMAD6表达的增加(抑制成骨分化基因)和Runx2的表达减少,骨钙素和碱性磷酸酶在最高的msc治疗干扰素-γ浓度,而这些基因的表达保持不变的msc与干扰素治疗γ在50 ng / mL浓度(25]。此外,一项由Sonoda et al。26]表明,牙髓干细胞分离牙齿不可逆牙髓炎和用干扰素治疗γ在100 ng / mL浓度能够产生大量含钙沉积的结节茜素红染色(积极)4周后成骨分化的文化媒介。然而,这个研究表明,从牙齿牙髓干细胞不可逆牙髓炎没有以前用干扰素治疗γ产生数量更小的结节含有钙沉积后4周成骨分化的文化媒介。

关于他们的免疫调节潜力,msc,当暴露于炎性刺激会分泌分子,通过抑制抗原递呈细胞如单核细胞的成熟树突状细胞(dc)和巨噬细胞。这些分子也促进巨噬细胞的极化到M2巨噬细胞并抑制巨噬细胞的极化到M1巨噬细胞。msc还能抑制自然杀伤(NK)细胞的激活和增殖,CD8⁺T淋巴细胞(抑制细胞毒性的影响和细胞因子生产)和B淋巴细胞(抑制抗体的产生,这些细胞)促进调节性T淋巴细胞的激活和抑制DCs的激活16]。

至关重要的是,从不同组织分离msc,尤其是那些孤立的微创来源,特点和分类。此外,对促炎与干扰素刺激——的影响γ对msc的生物学性质。由于我们组与骨组织工程应用程序重建的唇腭裂患者的牙槽骨,这项研究调查了促炎与干扰素刺激——的影响γ在小屋的生物学特性和OOMDSCs。这些msc的来源被认为是侵入性唇腭裂患者因为小片段的口轮匝肌的肌肉经常丢弃在唇成形术手术(10),所有的孩子都有乳牙在剥离时6到12岁。

这项工作的主要目的是研究如何OOMDSCs和行为当炎症干扰素治疗γ刺激,特别是关于其增殖、成骨和免疫调节的潜力。具体来说,本研究旨在确定剥离的增殖能力和OOMDSCs受到与干扰素治疗——的影响γ在不同浓度来评估这些疗法的效果在OOMDSCs和剥离的成骨潜能评估特定costimulatory的表达,免疫原性和免疫调节分子的数量OOMDSCs和暴露于促炎干扰素-γ刺激或未曝光。

2。材料和方法

2.1。隔离和棚和OOMDSCs的文化

建立主行msc、纸浆乳牙和片断的口轮匝肌肌肉获得保健服务的唇腭裂患者在医院市政Infantil梅尼诺耶稣。杀人和OOMDSCs孤立从五个不同的捐赠者都是孤立的和用于描述的实验。隔离棚,牙齿手术提取和收集的果肉是立即添加到包含2毫升无菌收集器杜尔贝科的修改鹰介质/营养混合物F-12 (DMEM-F12;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)补充100国际单位/毫升青霉素和链霉素(Penicillin-Streptomycin;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。乳牙的纸浆然后洗1 x磷酸盐(PBS^{- - - - - -}pH值:7.4;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)的两倍和1毫克/毫升胰蛋白酶消化解决方案(TrypLE;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)稀释1 xpbs^{- - - - - -}(pH值7.4;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)30分钟37°C。组织消化后,样本在300 x g离心5分钟。随后,果肉切成两个或两个以上的片段,根据大小不同,和培养12-well板,最好每口井的一个片段。这个过程后二十天,msc被逐出牙髓碎片,从而建立一个主要的文化。此外,口轮匝肌肌肉碎片收集在唇成形术手术和立即添加到包含2毫升无菌收集器DMEM-F12 (Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)补充了100国际单位/毫升的青霉素和链霉素(Penicillin-Streptomycin;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。口轮匝肌肌肉片段1 xpbs然后洗两次^{- - - - - -}(pH值7.4;Gibco表达载体、大岛,纽约)和消化在溶液中含有1毫克/毫升胰蛋白酶(TrypLE-Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)在1 xpbs稀释^{- - - - - -}30分钟37°C。酶消化后,样本在300 x g离心5分钟。肌肉片段被切成三个或四个部分,根据大小不同,和培养12-well盘子,最好每口井的一个片段。这个过程后二十天,msc被逐出口轮匝肌肌肉片段,和一个文化OOMDSCs成立。

隔离棚和OOMDSCs培养在37°C / 5%的股份有限公司₂在湿润孵化器T25或T75烧瓶血压得到较好的控制5(对于T25烧瓶)或10 (T75烧瓶血压得到较好的控制)毫升DMEM-F12 (Gibco表达载体,大岛,纽约)补充15%胎牛血清(的边后卫;HyClone-GE生命科学保健、南犹他州洛根的)。培养基是每2或3天更换一次。培养的msc被转移到新的烧瓶当大约90%汇合的防止细胞衰老。为此,基底介质是吸气,细胞培养瓶和5毫升1 xpbs洗两次^{- - - - - -}删除所有残余的培养基。此后,msc,粘到细胞培养瓶从烧瓶中删除了孵化的msc 37°C / 5%的股份有限公司₂3分钟1 (T25烧瓶)或1.5 (T75烧瓶血压得到较好的控制)毫升TrypLE表达酶(1 x) (Gibco表达载体,大岛,纽约)。3分钟后,3毫升的基础培养基添加到细胞培养瓶中和TrypLE表达酶的作用。细胞培养瓶然后洗几次与基底中移除所有残余的msc的玻璃瓶,MSC-containing解决方案被转移到15毫升聚丙烯管(BD猎鹰,海德堡,德国)。这些管子是随后在300 x g离心5分钟,和上层清液吸气移除所有TrypLE表达酶存在于上清液。然后,包含msc的沉淀是resuspended 1毫升的基础培养基,细胞被转移到新的细胞培养瓶包含5(对于T25烧瓶)或10 (T75烧瓶血压得到较好的控制)毫升的基本培养基的密度5000细胞/厘米²并保持在37°C / 5%文化有限公司₂在湿润的孵化器。要长期储存,msc被保存在液氮。必要时,msc被解冻,扩展到进行实验。这里所描述的实验都是根据国家和国际标准执行的研究伦理与被研究伦理委员会批准的医院Sirio Libanes。

2.2。细胞表面标记分析

来确认他们的身份,msc、脱落和OOMDSCs都以流式细胞术对msc的典型表面标记物的表达(CD29、CD44, CD90、CD73 CD105、CD106)和内皮(CD31)和造血细胞(C34)。所有细胞都孵化与抗体(共轭荧光染料),特别有能力结合细胞内和细胞表面蛋白比较和描述细胞根据特定抗原的表达。总共 100年细胞从细胞培养和稀释μL 1 xpbs^{- - - - - -}被转移到流式细胞术管和孵化单克隆抗体15分钟后在室温下在黑暗中染色:anti-CD29-PE, anti-CD44-PE, anti-CD73-FITC, anti-CD90-FITC, anti-CD105-PE, anti-CD166-PE, anti-CD34-FITC, anti-CD31-FITC (BD生物科学,正欲富兰克林湖,NJ)。样本然后用1 xpbs洗^{- - - - - -}500年,resuspendedμL 1 xpbs^{- - - - - -}运行在一个FACSCalibur (BD,正欲富兰克林湖,NJ)流式细胞分析仪,随后分析了使用FlowJo软件(TreeStar Inc .)。无污点的细胞样本准备每个实验的影响消除任何非特异性染色和天生的自发荧光的细胞。的负控制反应,同形像控制用于每个抗体。

2.3。成骨分化分析

除了作为细胞表面标记物的表达,msc也以其成骨的潜力,脂肪形成的和chondrogenic分化。成骨分化的化验,总共 msc被播种到12-well细胞培养板(康宁®®)演对手戏。msc被允许坚持文化的表面板24小时在基础培养基37°C / 5%的股份有限公司₂在湿润孵化器启动前成骨分化的协议。骨被替换的基础培养基然后诱导培养基含有生长因子诱导成骨分化的特定msc (StemPro成骨分化设备;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。成骨的媒介改变了21天,每3 - 4天,观察成骨分化在此期间通过评估纺锤状细胞的形态改变成星形立方细胞。msc作为负成骨分化过程控制在基础培养基培养21天。评估成骨分化的过程,文化的msc与茜素红染色后21天在分化条件下。msc的文化的染色茜素红S表示一个矿化矩阵的存在提出的文化和羟磷灰石钙的存在,表明成功的成骨分化过程发生。

2.4。脂肪形成的差异化分析

msc描述的关于他们的脂肪形成的分化潜能,总共 msc被播种到12-well细胞培养板(康宁®®)演对手戏。msc被允许坚持文化的表面板24小时在基础培养基37°C / 5%的股份有限公司₂在湿润孵化器发起之前去协议。替换引起的脂肪形成当时的基础培养基培养基含有特定生长因子诱导msc分化脂肪形成的(StemPro脂肪形成分化设备;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。脂肪形成的媒介改变了18天,每3 - 4天,去观察通过评估液泡的存在在msc。msc作为负控制脂肪形成的分化过程基础培养基中培养18天。评价脂肪形成的分化过程中,MSC文化沾油红O (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)后18天的文化分化条件下。油红O染色显示存在lipid-rich液泡在msc。

2.5。Chondrogenic分化分析

msc特征也为他们chondrogenic分化潜能。评估这个潜力,总共 msc被播种在12-well细胞培养板(康宁®®)演对手戏。msc被允许坚持文化的表面板24小时在基础培养基37°C / 5%的股份有限公司₂在湿润孵化器发起之前chondrogenic差异化协议。软骨形成被替换的基础培养基诱导培养基含有生长因子特定chondrogenic分化的诱导msc (StemPro®软骨形成分化设备;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)一旦confluency MSC文化达到了至少80%。chondrogenic介质是21天改变每3 - 4天。msc作为负控制chondrogenic分化的过程在相同的基础培养基培养21天。评估chondrogenic分化的过程中,文化的msc与阿尔新蓝染色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)21天后文化在分化条件下。蓝色观察到阿尔新蓝染色显示蛋白聚糖的存在(细胞外基质)由软骨细胞分泌和显示成功chondrogenic发生分化。

2.6。分析促炎与干扰素刺激——的影响γ的增殖和生存能力和OOMDSCs

评估促炎的影响干扰素-γ刺激的细胞增殖和OOMDSCs间,两个细胞类型被播种在12-well盘子和维护在培养基有或没有干扰素-γ在不同的浓度。最初,总共 细胞被镀在每个12-well板块在培养基有或没有干扰素-γ10、25、50、100、500 ng / mL 3、5或7天。每种文化的预先制定时间达到后,分析细胞增殖和生存能力在这一时期是由确定可行的细胞和细胞总数的百分比出现在每一个。为此,摆脱和OOMDSCs都从12-well板使用的每个好,洗,resuspended在300年μL培养基。然后,10μ在10 L MSC-containing溶液的稀释μL(台盼蓝(Sigma-Aldrich),这样死去的细胞可以被识别。最后,计算过程和决心使用细胞的可行性进行了伯爵夫人(Sigma-Aldrich)。

2.7。促炎干扰素-的影响分析γ刺激成骨的潜在的和OOMDSCs

研究干扰素-促炎的效果γ刺激成骨分化潜能的剥离和OOMDSCs,两种细胞类型被播种在96 -孔板。总共 msc被播种在每个在培养基和培养有或没有干扰素-γ在不同浓度(10、25、50、100、或500 ng / mL) 21天。经过21天的分化,井与茜素红染色如前所述。随后,100μL 20%甲醇溶液和10%醋酸在1 xpbs稀释^{- - - - - -}被添加到每个所以矿化矩阵之前与茜素红染色可以溶解。最后,样本孵化暴露在室温下15分钟,和成骨分化过程量化确定溶液的光密度(OD)在每一个在480 nm波长分光光度计。

2.8。促炎干扰素-的影响分析γ刺激细胞表面和细胞内表达的标记

研究,通过流式细胞术,costimulatory的表达,免疫原性,和免疫调节分子在细胞表面OOMDSCs和因暴露于炎性刺激,细胞类型都维护在T75烧瓶血压得到较好的控制在培养基补充25 ng / mL IFN -γ(PeproTech) 48小时。此外,未经处理的细胞培养基中维护和使用的控制实验。48小时后,干细胞与干扰素-保持在中补充γ从他们的烧瓶中提取,加工成单细胞悬液,准备流仪分析。这种技术被用来评估OOMDSCs和摆脱的免疫状况保持在中补充了25 ng / mL IFN -γ或没有干扰素-γ。OOMDSCs和摆脱的免疫档案评估通过分析CD40的表达,CD80、CD86,人类白细胞抗原(HLA)博士,抗原,HLA-B HLA-C, HLA-G细胞保持在中补充了干扰素-γ或没有干扰素-γ。核或胞质蛋白的检测,细胞被固定和permeabilized允许抗体穿过细胞膜。标记细胞样本准备每一实验组消除非特异性染色和天生的自发荧光的影响结果。的负控制反应,同形像控制用于每种类型的免疫球蛋白。表达不同的标记的分析研究(CD40, CD80、CD86 HLA-DR,抗原,HLA-B, HLA-C,和HLA-G)在棚和OOMDSCs与干扰素治疗γ或左如果是由确定的平均荧光强度(MFI)每一个标记。

2.9。统计分析

定量数据进行描述性分析,给出了平均伴随着相应的标准差(±sd)。正态分布的假设和方差的同质性与Shapiro-Wilk评估测试和列文测试,分别。分析两个不同的因素,使用双向方差分析。使用一个因素分析、单因子变异数分析。当有必要执行多个比较手段,Bonferroni事后测试使用。意味着两个独立组之间的比较,一个未配对的学生 - - - - - -测试使用。所有与软件分析SigmaPlot Windows版本11.0的显著性水平 。

3所示。结果

3.1。流和OOMDSCs表达典型的MSC Immunophenotype能够脂肪形成的,成骨,Chondrogenic分化

后维持在特定条件下的分化、人口流和OOMDSCs分化成脂肪细胞,软骨细胞,骨细胞。21天后文化在成骨分化培养基,OOMDSCs和脱落是成骨分化的能力,就是明证的矿化矩阵被茜素红染色。同样,OOMDSCs和脱落,当在chondrogenic分化培养基培养,能够chondrogenic分化后21天,与阿尔新蓝染色证明了积极性。最后,摆脱和OOMDSCs能够分化成脂肪细胞脂肪形成的分化培养基后18天的文化,作为证明了脂质空泡的存在沾油红O(图1(一))。此外,流动仪分析表明,人口减少了(图1 (b))和OOMDSCs(图1 (c))是积极的间充质干细胞标记CD29、CD44, CD90、CD105, CD73,存在和消极内皮(CD31)和造血细胞标记(CD34)(表1)。

3.2。流和OOMDSCs的成骨分化潜能与干扰素治疗后,维护γ

茜素红染色后21天的成骨分化成骨分化中有或没有干扰素-γ在不同浓度(10 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL, 100 ng / mL,和500 ng / mL)表明,减少了(图2(一个))和OOMDSCs(图2 (b))维护与干扰素刺激——时其成骨分化潜力γ浓度相比之下,没有刺激。特别是,摆脱其成骨分化潜力大大刺激了添加500 ng / mL IFN -γ的成骨分化培养基相比,添加10 ng / mL IFN -γ(图2(一个))。

3.3。流和扩散OOMDSCs与干扰素-抑制治疗后γ

这一研究获得的结果表明,对于他们的细胞增殖能力和生存能力,人口流和OOMDSCs表现在类似的方式与促炎干扰素治疗γ刺激。第三天的文化之后,没有治疗相比,添加不同浓度的干扰素-γ培养基的导致细胞增殖的抑制(图3(一个))和OOMDSCs(图3 (c))。增加干扰素-γ培养基的显著抑制流的扩散和OOMDSCs在所有天的文化,在最后几天,这种抑制是更明显的文化(5至7天)比在最初的日子。此外,增加干扰素-γ在更高浓度(100 ng / mL和500 ng / mL)更强烈抑制扩散流和OOMDSCs比增加干扰素-γ在低浓度(10 ng / mL, 25 ng / mL,和50 ng / mL)。此外,显著减少的可行性(图3 (b))和OOMDSCs(图3 (d))主要是在文化和初始的日子时更明显的干细胞治疗干扰素-的浓度就越高γ。经过七天的文化中,大多数的可行性IFN -γ治疗人群流和OOMDSCs回到水平类似的未经处理的控制。由于干扰素-γ只有添加到培养基在实验的开始,它可以推测,细胞生存能力的增加观察是干扰素的结果-γ失去其生物功能或被耗尽的培养基后第三天文化。

3.4。流和OOMDSCs表示分子免疫调节特性,但没有表达Costimulatory分子或HLA与干扰素治疗后,二级分子γ

经过48小时的促炎与25 ng / mL IFN -刺激γ、流量仪分析表明,裁员和OOMDSCs HLA-DR(没有表达 小额信贷机构, 小额信贷机构)或costimulatory分子CD40 ( 小额信贷机构, 小额信贷机构)、CD80 ( 小额信贷机构, 小额信贷机构)和CD86 ( 小额信贷机构, 小额信贷机构)在细胞表面,这些表达水平类似HLA-DR的表达水平( 小额信贷机构, 小额信贷机构)、CD40 ( 小额信贷机构, 小额信贷机构)、CD80 ( 小额信贷机构, 小额信贷机构)和CD86 ( 小额信贷机构, 未经处理的控制(MFI)观察到的数字4(一)和4 (b))。然而,抗原的表达,HLA-B HLA-C检测脱落(未经处理的数量的 小额信贷机构)和OOMDSCs ( 小额信贷机构),和与干扰素治疗后γ,抗原,HLA-B, HLA-C表达在细胞表面的流( 小额信贷机构)和OOMDSCs ( 小额信贷机构)增加(图4 (c))。此外,免疫调节分子的表达HLA-G检测流(如果人口的 小额信贷机构)和OOMDSCs ( 小额信贷机构)。治疗后与25 ng / mL IFN -γ,HLA-G表达均显著增加( MF)和OOMDSCs ( 小额信贷机构)(图4 (d))。最后,细胞内和细胞表面表达的HLA-G评估流和OOMDSCs处理或没有25 ng / mL IFN -γ来验证是否增加HLA-G表达式之前观察治疗后25 ng / mL IFN -γ是由于增加HLA-G表面或细胞内表达。结果表明,而细胞内的表达HLA-G显著增加的人口流( 小额信贷机构,25 ng / mL 小额信贷机构)和OOMDSCs ( 小额信贷机构,25 ng / mL 小额信贷机构)接受25 ng / mL IFN -γ(图4 (f)),HLA-G的表达在细胞表面的流处理25 ng / mL IFN -γ并没有改变( 小额信贷机构, 小额信贷机构),但HLA-G的表达在细胞表面OOMDSCs增加,当这些细胞被接受25 ng / mL IFN -γ( 小额信贷机构,25 ng / mL 小额信贷机构);然而,这种增加并不显著(图4 (e))。

4所示。讨论

本研究的结果表明,裁员和OOMDSCs行为以类似的方式在考虑促炎的影响干扰素-γ刺激增殖能力。流和扩散OOMDSCs后被抑制的干扰素-γ使用的媒介文化。另外,干扰素治疗γ在更高浓度导致更大的抑制增殖的剥离和OOMDSCs比用干扰素治疗γ在低浓度。然而,不同的结果报告与炎性刺激对msc的增殖能力的影响。例如,在他的研究等。27),结果表明:治疗牙髓干细胞与干扰素γ在低浓度(0.05、0.5和5 ng / mL)刺激这种类型的干细胞的增殖和迁移。另一方面,陈等人。28)表明,与未经处理的msc相比,msc与干扰素治疗γ8天增殖能力下降了50%。同样,Yazid et al。29日]表明,msc与健康牙髓有增殖能力大于msc与牙髓发炎。此外,在秦等人的研究。30.),没有在统计上有显著差异的牙髓干细胞的增殖能力报告当这些干细胞治疗和促炎细胞因子TNF -α,无论培养基中的细胞因子的浓度。关于扩散的可能机制刺激与干扰素- msc治疗后γ,他et al。27]显示增殖细胞核抗原和ki - 67的发生增加干扰素-后表达γ治疗,表明高百分比的细胞进行分裂。本研究进一步表明,细胞cycle-promoting蛋白的表达,如细胞周期蛋白B1,细胞周期蛋白D1,和PCNA是增加的,而蛋白质的表达,抑制细胞周期进展后(如P21)下调的刺激与干扰素- mscγ(27]。此外,秦et al。30.]表明TNF -α能刺激人牙髓干细胞的增殖通过一种蛋白激酶/糖原合成酶激酶3β/周期蛋白D1的信号通路。机制与抑制msc的增殖也被观察到在一些研究msc与促炎细胞因子治疗后。一项由Croitoru-Lamoury et al。31日),例如,证明干扰素-γ治疗是能够激活indolamine-2 3-dioxygenase (IDO)在人类和小鼠msc,被罩的激活可能会抑制msc的增殖通过色氨酸的损耗,一个重要蛋白质生物合成所需的氨基酸。此外,色氨酸代谢产物的生产(如犬尿氨酸,3-hydroxyanthranilic酸和喹啉酸)通过msc可以通过一个负面的反馈机制,抑制这些干细胞的增殖。

目前的研究还表明,种群的成骨分化潜能棚和OOMDSCs时维持这些细胞进行了炎性刺激干扰素-γ。然而,一项由他et al。27)表明,低浓度的促炎细胞因子干扰素-γ可以抑制牙原性的和牙髓干细胞的成骨分化核因子k B (NF -κB) (p65)和MAPK信号通路(P38)。Sonoda et al。26)也表明,从牙齿牙髓干细胞分离与不可逆性牙髓炎和100 ng / mL IFN -对待γ显示osteoblast-specific基因的表达增加,如Runx2、碱性磷酸酶、骨钙素、促炎与干扰素刺激——之后γ。炎症和免疫调节细胞因子的影响在msc的成骨分化潜能也被报道在最近的研究。刘等人进行的一项研究。25)表明,MSC-mediated骨再生部分由主机控制的局部微环境,宿主的免疫细胞的作用由宿主细胞和炎性细胞因子的生产会大大影响这一过程。本研究表明,自体msc的成骨的潜在的不利影响,当这些细胞被移植到野生型小鼠,观察而丰富的骨形成当msc移植到小鼠免疫抑制。

此外,研究由冯et al。32和兴等。33)表明,igf - 1和肿瘤坏死因子-α刺激牙髓干细胞的成骨分化潜能通过哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)和NF -κB信号通路,分别。NF -κB通路是活跃在许多炎症性疾病,如关节炎、胃炎、牙髓炎(34]。以前的研究已经表明NF -κB通路信号参与调控牙原性的和成骨分化的牙髓干细胞(35,36]。此外,促炎细胞因子TNF -α可以刺激牙髓牙原性的和成骨分化的干细胞通过NF -κB信号通路(32]。他的研究等。27)表明,干扰素-γ积极监管P65磷酸化,使牙原性的抑制,在牙髓干细胞成骨分化,而pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC)的特定抑制剂NF -κB信号通路,显著抑制p-P65蛋白质的磷酸化和救了牙原性的,牙髓干细胞成骨分化能力,表明NF -κB通路扮演重要的角色在牙原性的和牙髓干细胞的成骨分化,这个途径是由干扰素-γ。此外,本研究还证明了NF -κB信号通路参与牙原性的并不是唯一途径和牙髓干细胞成骨分化诱导干扰素-γ自干扰素-γ也负调节p38蛋白质的磷酸化与MAPK信号通路有关。已经表明,p38-MAPK信号通路与odontoblastic刺激在第三期p38磷酸化和增加核易位(37]。此外,肿瘤坏死因子-α治疗可以激活p38通过p38磷酸化途径在牙髓干细胞,而p38抑制减少牙本质磷蛋白的表达(民进党)和牙本质涎蛋白(DSP)在这些细胞(37]。最后,他进行的一项研究et al。27]表明,脂多糖(LPS)可以促进牙原性的分化在人牙髓干细胞通过MAPK信号通路。此外,这项研究表明,封锁p38-MAPK信号通路通过使用特定抑制剂(SB203580)导致重大救援的牙髓干细胞成骨分化潜能诱导干扰素-γ,这表明p38-MAPK信号通路起着重要的作用在骨再生反应。

这一研究获得的结果也表明,裁员和OOMDSCs不表达HLA-DR或costimulatory分子CD40, CD80、CD86在细胞表面,即使与干扰素刺激γ在48小时内的25 ng / mL。同样,一项由Majumdar et al。38]表明,HLA二类分子,如HLA-DR,没有既定的表达的msc。HLA-DR表达的抗原递呈细胞,在免疫反应和T细胞受体结合(39]。HLA-DR不是既定的表达从骨髓msc孤立,但其表达已被证明是积极监管后炎性刺激(40]。然而,在这项研究中,我们观察到棚和OOMDSCs HLA-DR表达在细胞表面,这种蛋白质的表达保持不变甚至在两种类型的msc刺激后25 ng / mL IFN -γ48小时。相比之下,costimulatory分子CD40, CD80和CD86,表达的抗原递呈细胞(41),不表示从骨髓msc孤立即使炎性刺激(42]。因此,摆脱和OOMDSCs用于这项研究应该不能刺激淋巴细胞的激活,类似于缺乏刺激能力观察到从骨髓msc孤立43]。然而,在这项研究中观察到,摆脱和OOMDSCs表达HLA类我分子抗原,HLA-B, HLA-C与干扰素治疗——之前在细胞表面γ。经过48小时的促炎与25 ng / mL IFN -刺激γ,HLA-B抗原和HLA-C表达在细胞表面的脱落和OOMDSCs增加。HLA分子类我负责主机响应细胞内病原体和感应是重要的细胞免疫(44]。一项由陈et al。28)表明,治疗从健康的捐赠者骨髓msc孤立干扰素-γ增加的表达这些细胞表面HLA分子类我仅仅一天之后,而增加的表达HLA二类分子只能观察到与干扰素治疗后,4天γ。因此,可以假设观察到的差异的表达HLA-DR和抗原,HLA-B, HLA-C干扰素,经过两天的治疗γ是由于胞内运输慢的HLA二类细胞表面的分子流和OOMDSCs。然而,这一假设还需要确认。此外,目前的研究表明,裁员和OOMDSCs表达HLA-G在低水平。HLA-G的表达增加棚和OOMDSCs处理25 ng / mL IFN -γ48小时的价格相比相应的未经处理的控制细胞。特别是,显著增加细胞内的表达HLA-G检测治疗后脱落和OOMDSCs 25 ng / mL IFN -γ。

同样,先前的研究已经表明,骨髓msc孤立的狒狒表达HLA一级分子如抗原,HLA-B, HLA-C, HLA-G在低水平的细胞表面(43]。HLA-G,尤其是孕期免疫耐受的维护至关重要,及其表达式表明强烈的免疫抑制的发生(45]。HLA-G表达式也可以调节在几个组织“病态”的条件下,比如癌症(46]。此外,一项由Carosella et al。47)报道,HLA-G表达式是一个病人接受心脏移植耐受的预后指标,肾脏,肝脏,或造血干细胞移植。表型研究已经证明,胎儿和成人msc HLA-G表达在细胞表面和细胞(48]。这些研究发现的存在HLA-G蛋白质提取物胎儿msc,而只有HLAG信使rna中检测出成人msc。HLA-G可以表示在七个不同的亚型,根据主要的可变剪接成绩单,和这些亚型包括四个膜蛋白(HLA-G1, HLA-G2、HLA-G3 HLA-G4)和三个可溶性蛋白质(HLA-G5、HLA-G6 HLA-G7) (47]。关于HLA-G的生物活性分子,交互HLA-G分子与特定HLA-G受体KIR2DL4 ILT-2 NK细胞表达抑制NK细胞的粘附和迁移能力。的表达HLA-G也抑制激活CD8的溶细胞的潜力⁺T淋巴细胞,刺激细胞凋亡与植物凝集素(这些淋巴细胞受到刺激时49,50]。此外,同种异体antigen-induced CD4的扩散⁺抑制了T淋巴细胞HLA-G5可溶性对碘氧基苯甲醚和膜结合同种型HLA-G1绑定ILT2同源受体和ILT4细胞膜上表达。也让HLA-G1对碘氧基苯甲醚dc的成熟,呈现他们的免疫抑制的结果表达TGF -β和il - 1051,52]。

HLA-G分子通过msc的表达起着重要的作用在免疫抑制这些干细胞的潜力。这个角色的研究已经证明了绑定HLA-G分子受体被中和抗体。因此,msc刺激的能力CD4的扩张⁺CD25⁺FoxP3⁺调节性T细胞抑制T淋巴细胞的增殖,抑制NK细胞的细胞毒性作用53,54]。此外,一项由Yazid et al。29日)表明,从健康牙髓牙髓干细胞表达HLA-G,抗原,HLA-B, HLA-C数量高于牙髓干细胞与牙髓发炎。它是由成龙et al。28],干扰素的绑定γ其同源受体(IFN -γR1和干扰素-γR2)、信号传感器和转录激活1 (STAT1)由JAK1和JAK2和经历homodimerization磷酸化。化学活性STAT1然后把细胞核以及结合IFN -γ激活网站(气)元素开始干扰素刺激基因的转录(isg),包括interferon-1调节因子(IRF-1)。IRF-1反过来调节转录的isg通过IFN-stimulated响应元素(ISRE),导致我HLA类的合成分子(如HLA-G、抗原,HLA-B,和HLA-C)。IRF-1和化学活性STAT1绑定到天然气的启动子区域基因编码CIITA蛋白促进基因转录。CIITA蛋白的表达,另一方面,诱发的表达HLA二类分子(如HLA-DR) (28]。

5。最后考虑

可以得出结论,摆脱和OOMDSCs抑制增殖和成骨分化维持刺激干扰素-γ。我们还证实,这些细胞的免疫调节潜力刺激时用干扰素治疗γ。因此,我们的数据表明,裁员和OOMDSCs都有趣的干细胞数量,可以用于临床应用,这些细胞与干扰素的治疗γ能增强免疫调节潜力,进一步提高他们的治疗潜力。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

我们感谢项目Apoio ao Desenvolvimento Institucional做Sistema整合de Saude (PROADI-SUS)和Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)提供资助这项研究。我们也感谢所有患者和家长组织片段捐赠建立MSC菌株和相信我们的研究小组推进科学的发展。

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