间充质干细胞增强肺部抗菌免疫预防继发性细菌感染

抽象的

出身背景．免疫抑制剂例如环磷酰胺（CTX）已被用于治疗各种自身免疫疾病的阵列。这些药物的最不利的副作用是它们对抗菌免疫力抑制，增加感染的风险。作为有希望的替代/辅助，间充质干细胞（MSC）当前正在几个临床试验中进行测试。然而，他们对接受者抗菌免疫力的影响尚不清楚。方法. 在这项研究中，C57BL/6小鼠用CTX或MSCs处理，然后测定肺的固有免疫和适应性免疫。为了研究CTX和MSCs对感染免疫防御的影响，将经治疗的小鼠鼻内感染机会性病原体流感嗜血杆菌（嗨）．分析细菌清除率和抗菌免疫反应。结果我们的数据显示CTX强烈抑制肺免疫细胞的增殖，包括肺泡巨噬细胞（AMs）和T细胞，而MSCs增加了这些细胞的数量。CTX抑制了AMs的吞噬活性；相反，MSCs增强了AMs的吞噬活性。值得注意的是，MSCs的输注导致肺中调节性T细胞和Th1细胞的显著增加。当感染Hi时，CTX并没有显著损害侵入细菌的清除。但是MSC处理的小鼠表现出加速的细菌清除和中度炎症和组织损伤。结论我们的研究表明，与传统的免疫抑制剂不同，骨髓间充质干细胞对受体免疫反应的调节更为优雅。它可以保护甚至增强抗菌防御，这表明骨髓间充质干细胞是感染高危患者或需要长期免疫抑制方案的患者的更好选择。

1.背景

环磷酰胺（CTX）是一种常用的免疫抑制剂，用于治疗多种自身免疫性疾病，包括但不限于系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬化、某些形式的血管炎、类风湿性关节炎和严重再生障碍性贫血[1.]作为氮芥前体药物，CTX经过肝脏转化形成活性代谢物，随后通过导致链间和链内DNA交联导致细胞死亡。快速增殖的细胞对CTX更敏感[2.]因此，正常的免疫细胞也会受到不成比例的影响，这反过来可能会增加患者对感染的易感性[3.,4.]。事实上，它已被广泛的临床研究报道，严重感染死亡的患者的自身免疫性疾病的主要原因，这部分是由于免疫抑制药物的长期使用[5.–7.]。因此，新的药物或疗法是对患者的正常免疫反应较少有害的迫切需要。

间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）是一种非造血、成体干细胞样细胞，可从多种组织中分离[8.]除了具有组织修复潜能外，骨髓间充质干细胞还具有强大的免疫抑制能力。因此，它们作为一种新的治疗工具已被广泛研究和测试，用于多种临床应用，包括不同的风湿性疾病[9].对激活的免疫细胞（即IFN）释放的炎症介质作出反应-γ肿瘤坏死因子-α)间充质干细胞可调节多种免疫细胞的功能[9]。参与其免疫调节活性的机制尚在探索中，但通过分泌可溶性因子包括肝细胞生长因子，前列腺素E2（PGE2），转化生长因子依靠两个细胞间接触和旁分泌作用βHLA-G5或吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）[10]除了这些可溶性因子的直接作用外，MSCs还可以通过将免疫细胞培养成调节表型来调节免疫反应，包括调节性T细胞（Treg）或抗炎性巨噬细胞（M2）[11,12].持续使用免疫抑制药物将抑制患者的抗感染免疫反应；然而，对于骨髓间充质干细胞，我们知之甚少。值得注意的是，在一项长期回顾性研究中，Liang等人报告，7.7%接受骨髓间充质干细胞治疗的患者在输注后呼吸道感染的发生率和/或持续时间显著降低骨髓间充质干细胞n与输注前比较[13]，提示MSC可以提高收件人的抗微生物免疫。因此，访问MSCs的安全，看看他们是否对患者的高感染的易感性更好的选择是很重要的。

考虑到大多数骨髓间充质干细胞进入肺部并在静脉注射后被捕获[14,15]在本研究中，我们选择肺部感染模型来比较CTX和MSCs对受体抗感染免疫的直接影响。流感嗜血杆菌（Hi）是一种革兰氏阴性球菌，无症状地在健康人的上呼吸道定植。当宿主免疫失调时，它可以传播到特殊的解剖部位，并导致包括肺炎在内的多种疾病[16]此外，Hi经常从接受免疫抑制药物的患者中分离出来。因此，我们选择这种机会细菌来评估受体的抗菌免疫。

2.方法

2.1.动物

所有实验均采用年龄匹配的雌性C57BL/6小鼠（6~8周龄，南京医科大学动物中心），动物饲养在南京鼓楼医院的动物设施内。

2.2. 道德认同

动物实验方案由附属鼓楼医院动物研究伦理委员会批准。所有动物实验程序均由附属鼓楼医院动物研究伦理委员会根据批准的实验方案代码20160802批准。本研究在《动物实验指南》的指导下进行他关心和使用实验动物。

2.3.骨髓间充质干细胞的制备

如我们之前的研究所述，分离MSC[17]简单地说，从计划的健康剖腹产中收集脐带，并将其切割成1条 厘米长的碎片，切碎，用CDH缓冲液（250 U/ml胶原酶II（西格玛），100 U/ml dispase和100 在37°C条件下，在眼眶振动筛上放置U/ml透明质酸酶（DMEM/F12培养基）4小时 H然后将悬浮液稀释至1 : 5在室温下加入PBS，并在840 g下离心10分钟 细胞在MSC培养基中以每立方厘米4000–6000个细胞的速度进行电镀，48小时后去除非粘附细胞和碎片 H培养贴壁细胞，并在所有实验中使用第6-8代细胞。通过表面染色确定产生的MSC的表型（图1）S1) [18]。

2.4.使用CTX和MSC进行治疗

对于CTX治疗，给小鼠注射CTX（40 mg/kg，i.p.）两次，间隔五天。对于MSC输注，每只小鼠接受 细胞通过静脉途径注射一次。详细方案如图所示。

2.5.细菌的制备

流感嗜血杆菌菌株86-028NP在添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（5）的脑心灌注琼脂平板上生长 μg/ml）和氯化血红素（10 μ在37°C条件下，在CO_2.培养箱过夜。然后，将菌落接种到sBHI肉汤中并进行摇动以达到目的 ．然后收集、清洗细菌，并将其重新悬浮在PBS中，浓度为  CFU/ml。

2.6.肺动脉流感嗜血杆菌感染模型

小鼠腹腔注射100%葡萄糖进行麻醉 μ氯胺酮/甲苯噻嗪（150 mg/10 mg/kg），并接种 在50制备的细菌的CFU μl PBS鼻内注射。为了计数肺部细菌，24小时后处死小鼠。收集支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺部。将肺部左叶在1小时内均质化 ml无菌PBS。在PBS中制备10倍连续稀释的匀浆和BALF，并将其置于sBHI平板上。在37°C下过夜培养后计数菌落。

2.7.BALF和肺细胞的分离

气管用20号导管插管，然后用1.0号导管冲洗肺部 ml冷PBS两次；总回报率平均为1.4-1.8 BALF在400℃下离心 g代表5 将最小上清液等分并储存在-80°C下。将细胞颗粒重新悬浮在500°C中 μl PBS。使用自动细胞计数器（上海瑞宇生物科技有限公司）处理20微升的细胞悬浮液进行细胞计数。为了分离肺细胞，将肺切碎并在消化缓冲液（含3.5%的Isocove DMEM）中培养 mg/ml胶原酶A（罗氏）和2.5 mg/ml DNA酶I（Sigma））在37°C下持续1小时，然后通过40°C的培养基捣碎 μm细胞过滤器（BD Falcon）。然后碎片被压过过滤器，其柱塞端为5 用溶解液（BD Pharmingen）去除红细胞。

2.8.BALF细胞因子测量

BALF中的细胞因子通过ELISA试剂盒（Biolegend或研发系统）检测TNF-αMCP-1的检测限为30 pg/ml，而TNF-α，IL-6，KC为7.5 pg/ml。

2.9. 肺形态计量分析

肺用10%福尔马林固定，石蜡包埋的肺切成5块 μ米厚的切片，随后用苏木精和曙红（H＆E）用于组织学分析染色。从每个样品的相同裂片五个切片随机选择，并且如先前所描述的平均线性截距（MLI）然后计算值[19].简单地说，每个检查切片的图像都是以×40的放大倍数进行数字捕获的。10 厘米水平线在2 然后使用cm间隔计算肺泡表面交叉点。MLI通过以下公式计算：所有计数线的长度之和除以肺泡间隔的计数截距总数。

2.10.吞噬活性测定

肺泡巨噬细胞的吞噬活性通过Vybrant细胞吞噬™测定试剂盒（赛默飞世）测定。根据制造商的说明书，BALF细胞从肺部收集并在存在在96高原底孔板中培养荧光素标记的大肠杆菌K-12生物微粒。一小时后，通过真空抽吸去除所有微孔板孔中的生物微粒装载悬浮液。然后用台盼蓝熄灭细胞外荧光探针。用荧光板读取器（Spark®多模微孔板读取器，Tecan）读取微孔板。

2.11.细胞内细胞因子染色和流式细胞术

Fc后，BALF细胞在4°C下在含有1%FBS的PBS中染色γ用抗小鼠CD16/CD32（克隆93；eBioscience）进行RII/III阻断。用从eBioscience购买的抗体（抗CD45，克隆30-F11；抗CD11b，克隆M1/70；抗CD11c，克隆N418；抗Ly6G（Gr-1），克隆RB6-8C5；抗CD3，克隆145-2C11；抗CD4，克隆RM4-5；抗CD44，克隆IM7）进行表面染色.对于Treg染色，用抗CD4和抗CD25（克隆PC61.5）对细胞进行表面染色，然后用Foxp3/转录因子缓冲液染色集（eBiosciences）渗透。然后用抗Foxp3（克隆FJK16s）对细胞进行染色抗体。对于细胞内染色，用抗CD4和抗CD44对细胞进行表面染色，然后用固定/渗透溶液试剂盒（BD）进行渗透。然后用抗IFN对细胞进行染色-γ(克隆XMG1.2)、抗il -17(克隆eBio17B7)和抗il -4(克隆11B11)。使用凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen)按照厂家说明检测肺细胞凋亡状态。该方法通过Annexin V/7-AAD双染色检测细胞凋亡。所有样本均采用FACSCalibur和FACSFortessa进行分析。使用FlowJo分析数据。

2.12. 统计分析

所有分析均采用GraphPad进行。数据采用非配对分析测验Kruskal-Wallis检验用于评估各组之间的差异。如果发现显著差异，则使用Mann-Whitney检验确定各组之间的显著差异。 被认为代表了统计上的显著差异。

3.结果

3.1. CTX减少了肺中的细胞，而MSC增加了它们

为了比较对肺免疫力CTX的直接影响和MSCS，我们处理与CTX小鼠或MSC如图所描绘的1（a）．CTX的剂量是等于用于脉冲治疗SLE患者，而MSC的是一样的，以前报道20].PBS处理的小鼠被设为对照组。由于CTX对增殖细胞有毒，我们首先比较了CTX处理引起的肺细胞总数的变化。在CTX处理的小鼠的BALF和肺中都观察到超过一半的细胞减少。然而，在接受MSC的小鼠中观察到相反的现象。在骨髓间充质干细胞移植后，肺细胞显著增加，尤其是肺泡腔（BALF）（图1（b）)接下来，我们证实细胞减少是由细胞死亡增加引起的，因为CTX处理的小鼠凋亡细胞增加了2倍（膜联蛋白V）⁺)在肺部（数字1（c）和1（d）).大多数发生凋亡的细胞是T细胞和巨噬细胞（图S2)细胞死亡增加的观察结果使我们确定CTX是否会对肺的正常结构产生有害影响。H&E染色显示，两个治疗组均未发现明显异常（图1）1（e）)。外周肺泡大小的变化也通过平均线性截距（MLI）的形态计量学测量进行量化。各组之间的MLI无显著差异（图1）1（f））.

3.2.骨髓间充质干细胞增加肺泡巨噬细胞的数量和吞噬活性

接下来，我们分析了肺部的免疫细胞，以确定受治疗影响最大的细胞亚群。FACS数据显示，在所有三组中，超过90%的BALF细胞是肺泡巨噬细胞（AMs）（图2（a）); 几乎没有检测到中性粒细胞（图2（c）和2（d））.然而，当观察AMs的绝对数量时，在接受CTX的小鼠中检测到AMs显著减少，而MSCs则增加了AMs(图)2（b）)。AMs通过直接吞噬作用在清除入侵病原体方面发挥着重要作用。因此，我们接下来检查了AMs的吞噬活性是否受到CTX或MSCs的影响。数据显示，CTX强烈抑制AMs对细菌的吞噬作用，而MSCs增强了它（图1）2（e）)这意味着输注骨髓间充质干细胞可以增强受体的抗感染能力。

3.3.骨髓间充质干细胞治疗显著增加了肺中的Treg

除了固有细胞外，T细胞也是抵抗感染所必需的。我们观察到MSCs显著增加了肺中的CD4 T细胞，而CTX抑制了CD4 T细胞的增殖（图3（a）–3（c）)接下来，我们比较了不同组的CD4 T细胞的功能。FACS数据显示，MSC治疗小鼠肺中的大多数CD4 T细胞具有活化的CD44^你好表型。对于那些用CTX治疗的小鼠，只有一小部分CD4 T细胞表达CD44，这与对照小鼠相当（图3（d）和3（e））.根据以前的研究的基础上，细胞因子产生，CD4 + T细胞一般可以subgrouped为Th1（IFN-γ），Th2细胞（IL-4），和Th17（IL-17）细胞。因此，我们接下来检查上的CD4 T细胞的功能的MSC和CTX的影响。我们发现，大多数从生产的所有三组的CD4 + T细胞的IFN-γγ骨髓间充质干细胞输注显著增加Th1细胞的百分比，而CTX抑制Th1细胞的百分比（图4（a）和数字S3).在所有小鼠中均检测到少量Th2细胞。MSCs和CTX均不影响Th2细胞（图4（b）)对于Th17细胞，MSC对其没有影响，但CTX对其有抑制作用（图1）4（c）)。据广泛报道，MSC通过诱导调节性T细胞（Treg）发挥其免疫抑制功能。与这些研究一致，仅在MSC治疗的肺中观察到Treg显著增加（图4（d）).与FACS数据一致，我们检测到IFN增加-γ和转化生长因子-β，这是由Th1和Treg细胞在MSC治疗小鼠的BALF产生（图S4）.

3.4.骨髓间充质干细胞对肺部细菌感染具有保护作用

接下来，我们评估了改良肺免疫系统抵抗感染的能力。所有小鼠均经鼻内感染Hi，24小时后处死（图1）5（a）)然后，测定细菌清除率和炎症反应。我们的数据显示，骨髓间充质干细胞强烈抑制Hi在肺中的生长，但CTX没有（图1）5（b））.根据H＆E染色数据，感染诱发的在对照和CTX处理的​​小鼠的肺细胞的显着增加;然而，MSC治疗的小鼠具有更少的浸润细胞（图5（c）)此外，仅在CTX组和PBS组中观察到肺泡壁增厚。然后，我们测定了导致免疫细胞向肺部募集的趋化因子和促炎细胞因子。我们发现炎性细胞因子TNF的产生-αCTX和MSCs显著抑制IL-6（图5（d）)单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）在单核细胞向损伤和感染部位募集中起作用。在这里，我们发现CTX和MSCs都可以下调肺细胞的分泌，但MSCs表现出更强的抑制作用，这可能解释了细胞浸润减少的原因。KC是一种主要的中性粒细胞趋化剂。只有CTX对其有轻微的抑制作用。因此，CTX和MSCs都可以抑制感染诱导的炎性细胞因子的产生。这些数据表明，与CTX不同，MSCs可以降低感染的严重程度。

3.5.感染后，经骨髓间充质干细胞处理的小鼠肺部中性粒细胞较少，但肺泡巨噬细胞较多

与H&E染色数据一致，在Hi感染后，在所有三组中观察到肺中白细胞的增加（与未感染小鼠相比，图1）1（a）).在BALF中，CTX和MSC治疗组的白细胞数量均显著降低，而MSC治疗组的白细胞数量下降幅度最大（图1）6（a）)感染后，所有三组小鼠的AMs百分比均显著下降。大量中性粒细胞浸润到肺部并取代AMs，成为大多数肺细胞，尤其是在对照组和CTX治疗组小鼠中（分别约80%和95%）（图6（b）和6（c）)与未感染的小鼠相同，CTX小鼠的AMs显著降低。然而，在MSC治疗的小鼠中，中性粒细胞的频率和绝对数量都较低（图6（d）和6（e）)，表明MSCs可以抑制中性粒细胞的募集，并可能防止过度激活的炎症反应引起的组织损伤。当观察Treg时，我们发现MSC处理的小鼠仍有较高比例的这些细胞，这可能是抑制炎症的原因（图6（f）和6（g）).对于其他Th细胞，未观察到显著差异（图S5）.

4.讨论

免疫抑制药物如环磷酰胺、甲氨蝶呤和糖皮质激素在改善自身免疫性疾病方面发挥了巨大作用[1.]然而，这些药物与不良的非靶向效应相关，可导致感染率的惊人增加。由于其强大的免疫抑制能力，间充质干细胞（MSCs）目前被认为是常规治疗的新辅助或治疗自身免疫性疾病的独立疗法[8.]然而，对其对抗菌免疫的影响知之甚少。在本研究中，我们采用肺部细菌感染模型，检查并比较了高剂量CTX和MSC处理对小鼠抗菌免疫的影响。我们发现，高剂量CTX显著抑制免疫细胞的增殖并且抑制了它们的功能，包括吞噬能力和细胞因子的产生，但这并没有损害受体杀死入侵细菌的能力。有趣的是，对于MSC来说，我们的数据显示它们可以增强免疫防御以抵抗感染。我们观察到MSC显著增强了细菌的吞噬能力通过肺泡巨噬细胞。此外，MSC治疗可诱导肺中的Treg增加，并抑制感染诱导的炎症，从而减少组织损伤。因此，我们的数据表明，与传统的细胞抑制免疫抑制药物不同，MSC不会对正常免疫系统产生任何有害影响；相反，MSC治疗可减少组织损伤可以提供保护。

先天性细胞是抵抗入侵病原体的第一道免疫防线。在肺部，通过直接吞噬和杀灭，肺泡巨噬细胞（AM）是早期抵抗感染的主要力量。Santosuosso等人的一项优雅研究表明，在接受150%剂量的治疗后 mg-CTX/kg体重时，AMs数量逐渐减少，治疗2周后开始恢复[21]CTX显著抑制AMs的增殖，但不影响其TNF的产生-α在我们的研究中，虽然我们使用了更温和的治疗，但我们仍然观察到AMs的显著减少。此外，CTX削弱了AMs对细菌的吞噬作用。这些数据与体外Yang等人的观察。他们用RAW264.7巨噬细胞评估CTX的细胞毒性[22]大量研究表明，注射CTX后，CTX均匀分布于血液中，并消耗淋巴细胞。CTX可减少B淋巴细胞和T淋巴细胞，但优先影响CD4 T细胞[2.]在我们的研究中，我们观察到腹腔注射CTX也减少了肺中CD4 T细胞的数量（图1）3.).根据从多发性硬化症研究中收集的免疫学数据，CTX可能使免疫系统远离在MS中有害的辅助性T细胞1型（Th1）免疫，而向更有利的辅助性T细胞2型（Th2）方向发展[23,24]。而且，随着Th2应答相关的细胞因子在CTX治疗的患者[增大24]CTX也被证明能促进Th2表型并逆转增加的IFN-γ继发性进行性MS患者CD8 T细胞的产生[25]然而，在这项研究中，我们使用健康小鼠评估CTX的安全性，得出的数据是不同的。我们发现CTX既不影响Th2反应，也不影响肺中的Treg（图1）4.)对Th1和Th17反应有抑制作用，提示其可能削弱粘膜免疫。我们的数据显示，腹腔注射CTX可显著抑制先天性和适应性免疫反应，但并不显著影响机会性免疫反应的清除流感嗜血杆菌．这可能是由于招募的中性粒细胞从循环中迅速迁移到肺部，并进行细菌吞噬和杀灭，因为感染后，CTX只略微减少了中性粒细胞的数量。

静脉注射后，MSC的肺部积聚已被广泛报道。他们的存活时间短且分布仅限于其他网站的建议，MSC迅速传递他们的固有细胞，随后可以通过调解MSC给药引起的免疫调节和再生的作用效果[14,26]在此，我们发现MSC治疗可诱导肺泡巨噬细胞和T细胞增加。在一些疾病模型中已经显示，MSCs可以通过分泌组将巨噬细胞极化为免疫抑制表型（M2）[27–29]然而，与Mei等人用骨髓间充质干细胞治疗脓毒症的研究一致，我们发现，当将骨髓间充质干细胞转移到正常小鼠时，可增强AMs的吞噬能力（图1）2（e）)提示骨髓间充质干细胞具有促进抗菌免疫的作用[30]间充质干细胞对巨噬细胞的不同作用可以用环境的不同来解释。有人认为间充质干细胞可以极化体外针对抗炎或促炎表型，取决于用于激活的TLR配体时间/浓度[31,32]。

treg的诱导是MSCs发挥免疫抑制功能的关键机制。MSCs诱导Treg的机制已经深入研究[33,34]Akiyama等人的研究表明，将小鼠骨髓间充质干细胞静脉移植到未成年小鼠体内可诱导外周血和骨髓中的T细胞凋亡。凋亡的T细胞随后触发脾脏中的巨噬细胞产生TGF-β这随后导致外周血中Treg的上调[35]Braza等人提出，在吞噬MSCs后，单核细胞表现出免疫抑制表型，并能分泌IL-10或TGF-β诱导树突分化[36]。在这项研究中，我们的确观察到MSC输注后肺调节性T细胞（图中的显着增加4.)以前的研究表明，在急性感染期间，Treg可以在允许有效的抗致病性免疫反应和预防免疫病理之间保持微妙的平衡。然而，肺中先前存在的Treg是朋友还是敌人仍然未知。我们的数据显示，MSC治疗显著抑制这可能归因于Tregs的调节，但也可能是巨噬细胞快速清除细菌的结果，从而防止引发严重炎症。

5.结论

综上所述，我们的数据表明，与传统的免疫抑制剂不同，MSCs对受体免疫反应的调节更为优雅。它可以通过增强巨噬细胞的吞噬能力来保护甚至增强宿主的抗菌防御。此外，通过诱导Treg，MSCs还有助于防止受体的过度激活因此，我们的数据表明，骨髓间充质干细胞是感染高危患者的更好选择。

数据可用性

本研究期间生成和/或分析的数据集包含在本文中，并可根据合理要求从相应作者处获得。

利益冲突

作者指出没有潜在的冲突。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金青年基金（批准号81601413）和江苏省人才高峰工程（批准号：SWYY-167）的支持。

补充材料

图S1：分离的脐带间充质干细胞的表型。按照方法中所述分离间充质干细胞。通过流式细胞术测定间充质干细胞标记物的表达。图S2：CTX诱导的肺白细胞凋亡。图S3：用间充质干细胞治疗显著增加BALF中的Treg和Th1细胞。图S4：间充质干细胞增加IFN的产生-γ和转化生长因子-β图S5：感染小鼠的肺Th反应。(补充材料)

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