维生素C治疗挽救Prelamin A诱导的软骨下骨髓间充质干细胞过早衰老

摘要

衰老是许多慢性疾病的主要危险因素。干细胞功能障碍在衰老过程中起着关键作用。据报道，核层蛋白层粘连蛋白a的异常加工形式Prelamin a可触发过早衰老。然而，驱动干细胞功能障碍的机制尚不清楚。在本研究中，我们发现当传代软骨下骨髓间充质干细胞（SCB-MSCs）时体外，prelamin A的积累伴随着衰老相关蛋白的增加β-半乳糖苷酶-β-Gal）表达。与它们的对应物不同，具有prelamin A过表达（MSC/PLA）的SCB MSC表现出增殖、成骨和脂肪生成减少，但炎症因子的产生增加。在后肢缺血模型中，MSC/PLA也显示出折衷的治疗效果。进一步的研究表明，外源性prelamin A引发核形态异常、DNA和shelterin复合物损伤、细胞周期阻滞，最终导致细胞衰老。基因表达谱的变化也通过微阵列分析得到证实。有趣的是，我们发现抗坏血酸或维生素C（VC）治疗可抑制MSC/PLA中的前拉明A表达，并部分逆转MSC/PLA中的过早老化，减少炎症因子的分泌，减少细胞周期阻滞和抗凋亡。重要的是，在VC治疗后，MSC/PLA在后肢缺血模型中显示出增强的治疗效果。总之，prelamin A可通过诱导DNA损伤加速SCB-MSC的过早衰老。VC可作为预胺a诱导的骨髓间充质干细胞老化缺陷的潜在治疗剂。

1.介绍

衰老被定义为机体生理功能的逐渐恶化。衰老是许多慢性疾病的主要风险因素，包括动脉粥样硬化、癌症、神经退行性和代谢综合征，从而增加死亡的易感性[1]．干细胞保留分化为其组成组织的细胞类型的能力，并促进再生和稳态[2].干细胞衰竭与再生潜能的下降有关，再生潜能的下降与年龄相关损伤的积累有关[3.]最近的研究表明，在动物模型中，以细胞衰老为靶点可以预防与年龄相关的疾病[4- - - - - -8]．因此，了解干细胞衰老的机制对预防衰老至关重要。

骨髓间充质干细胞由于具有良好的再生和免疫调节作用，已被广泛应用于组织和器官的修复和再生的细胞治疗中。然而，最近的研究表明，骨髓间充质干细胞的质量随着年龄的增长而下降[9，10].传代培养骨髓间充质干细胞体外在传统培养条件下获得治疗剂量，已被证明会增加细胞衰老的可能性。先前的研究表明，某些蛋白质的病理性积累会导致核组织的严重改变，阻碍细胞的正常功能，最终导致细胞过早衰老金[11]层粘连蛋白A，哺乳动物细胞核的关键组织者[12，在机械上与大多数普遍存在的衰老特征联系在一起[13]．层压蛋白A (PLA)是层压蛋白A的前体，有报道称，PLA的积累可诱导核结构缺陷，导致生理和病理性衰老中的细胞过早衰老[14- - - - - -17]．虽然有研究表明前层蛋白A可以诱导hMSCs衰老[18，19]，prelamin A在从老年供体（50-60岁）分离的MSC中的作用尚未评估。

在本研究中，我们从接受膝关节置换手术的患者（年龄在50-60岁）的废弃胫骨平台分离SCB MSC，并对其进行培养以分析其老化特征。我们发现在SCB MSC培养过程中，前白蛋白A积累体外.用含有prelamin A的腺病毒转导的SCB MSCs显示出异常的核形态和较低的多分化潜能，较高的DNA损伤，显示出大多数细胞衰老特征。重要的是，我们的数据表明，高剂量的抗坏血酸或维生素C（VC）治疗可抑制prelamin A的表达并部分逆转MSCs的过早衰老，表明VC可能是一种潜在的治疗prelamin A诱导的MSCs衰老的方法。

2.材料和方法

2．1．SCB-MSCs的分离和细胞培养

从膝关节置换术患者弃用胫骨平台的正常侧分离MSCs(年龄50-60岁，表)S1)为了分离骨髓间充质干细胞，用剪刀小心地切除废弃胫骨平台的软骨下骨碎片，并用镊子收集。软骨下骨碎片用1 毫克/毫升( ）胶原酶II (Gibco)在37°C下保存20分钟。丢弃消化培养基，将酶处理的软骨下骨碎片接种在塑料培养皿(T25)上α-MEM（Gibco），补充10%( ）胎牛血清（FBS），100 U/ml青霉素和100 μ克/毫升链霉素。培养第3天更换培养基，保留组织碎片，使更多间充质干细胞生长。细胞在3^研发部和5^th段落。

2．2.细胞转染和治疗

原代SCB-MSCs(第3代)以细胞密度为 ．在70%至80%的汇合率下，细胞感染含有前拉明A（PLA）的flag标记重组腺病毒或含有绿色荧光蛋白（GFP）的flag标记重组腺病毒，MOI为30-50。感染后五天，细胞准备好接受进一步的测试。

细胞转染后，每隔一天更换VC (sigma, A8960)培养基，连续7天。在第7天分析不同浓度SCB-MSCs(第4代)的相对细胞增殖能力。

为了进行增殖研究，将细胞接种在细胞密度为 每次传代计数三次，直到细胞停止增殖。使用公式计算群体倍增时间（PDT） [20]，其中Td是倍增时间，P1是时间T1时的单元数，P2是时间T2时的单元数。

２．３．免疫印迹

细胞在Laemmli样品缓冲液(BioRad)中裂解，并用BCA蛋白分析(BioRad)对裂解样品中的蛋白含量进行定量。用12%的SDS-PAGE凝胶溶解等量的蛋白质，并转移到PVDF膜上(生命科学)。阻断后，用一抗和二次过氧化物酶偶联抗体依次孵育膜。Immobilon Western Chemiluminescent HRP (Millipore)使用ChemiDoc (BioRad)进行蛋白质可视化。使用ImageJ软件对条带进行量化，结果相对于对照组进行表达。

用于westernblot分析或免疫荧光标记的抗体为兔抗prelamin A多克隆抗体（sc-518013 C-3，Santa Cruz），其特异性地针对靠近该区域的氨基酸580和601之间的表位映射而产生C-人类来源的层粘连蛋白A的末端，但不是SIM序列。p16（#80772）、p21（#2947）、p53（#2524）、磷光体-H2AX（#2577）和53BP1（#4937）都来自细胞信号技术和抗肿瘤药物-β-actin (sc-47778, Santa Cruz)。

2.4.RNA分离和定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

用Trizol试剂(Ambion, Life technologies)从细胞中提取总RNAμg的RNA，根据制造商说明使用Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix (Takara, Kyoto, Japan)进行逆转录。SYBR Pre-mix ExTaq (Takara, Kyoto, Japan)采用FTC-3000P (Funglyn Biotech Inc)实时PCR系统，按照制造商说明进行实时PCR;引物序列列于表中S2．

2.5.流式细胞术分析

通过CD73 (Ecto-5)染色鉴定人间充质干细胞 -CD44- (CSPG8)阳性，CD31 (PECAM1)和CD45 (PTPRC)阴性。收集SCB-MSCs, PBS洗涤2次。用PBS稀释的一抗在4°C温度下孵育细胞30分钟，并用流式细胞仪(BD FACS Aria IIIu)分析。从BioLegend中获得小鼠抗人CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD146 (MCAM)和CD31。同型匹配小鼠IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC和IgG1-percp作为阴性对照。从8000个事件中获取和处理的数据，使用FlowJo软件进行分析。

2.6。Senescence-Associatedβ牛乳糖(SA -β加)染色

SA -β-按照制造商的协议，使用X-Gal试剂盒（#9860S，细胞信号技术）进行Gal染色。简单地说，培养的细胞在PBS中洗涤并在室温下固定30分钟 固定液min。固定细胞用新鲜SA染色液染色-β-Gal活性在pH值6,37°C过夜，阳性细胞使用ImageJ软件定量。

2.7。Multidifferentiation SCB-MSCs的

在体外SCB-MSCs的多分化潜能如前所述进行了轻微修改[21]．简单地说，为了成骨分化，将第3代SCB-MSCs接种在24孔培养板上，在成骨诱导培养基中培养14天。成骨诱导培养基为培养基，0.1μM地塞米松，10 嗯β-甘油磷酸和50 μM抗坏血酸（Sigma-Aldrich）。使用商用试剂盒（Sigma-Aldrich）在第7天和茜素红（Sigma-Aldrich）在第14天通过原位碱性磷酸酶（ALP）染色检测MSCs的成骨分化。

为了脂肪分化，SCB-MSCs在成脂诱导培养基(#05412,Stemcell)中培养14天。按照标准方案对scb - msc来源的脂肪细胞进行油红O (Sigma)染色，对脂滴进行染色[22]．

2.8.免疫荧光

第3代SCB-MSCs播种在24孔培养板上的玻璃盖上，用4%多聚甲醛(PFA)固定。共聚焦荧光显微镜(Leica SP8，共聚焦显微镜)检测细胞。免疫荧光使用以下抗体:层前蛋白A (sc-518013 C-3, Santa Cruz)，磷酸组蛋白H2AX (#2577, Cell Signaling Technology)， 53BP1 (#4937, Cell Signaling Technology)， Ki67 (ab15580, Abcam)， calponin 1(ab46794, Abcam)， α平滑肌肌动蛋白(ab124964, Abcam)， mCD31(#14-0311-82, ebiosciences)，和β肌动蛋白(sc - 47778, Santa Cruz)。4 ，使用6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（zli-9557，中山）对细胞核进行复染。分析了大约100个随机选择的细胞。

2.9。细胞周期和凋亡的检测

将细胞胰蛋白酶化并在PBS中洗涤3次，然后再悬浮在含有1%FBS的PBS中，并在-20°C下在75%冰冷乙醇中过夜。添加碘化丙啶（PI）后细胞在37°C下培养30分钟，然后使用流式细胞仪对其进行分类。对于膜联蛋白V/7AAD染色，细胞按照制造商的说明进行处理（BioLegend）。

2.10.小鼠后肢缺血和细胞移植模型

C57BL/6小鼠（雄性8-12 w） 小鼠用avertin（240）麻醉 mg/kg，Sigma）腹腔注射。如前所述，通过轻微修改诱导右后肢缺血[22，23]．将股血管(动脉和静脉)与神经分离。使用6.0不可吸收聚丙烯缝合，结扎远端髂外动脉和静脉(包括股深动脉和股浅动脉)，并从股近端、股深动脉和股浅动脉切除。采用随机双盲研究设计。将小鼠随机分为PBS组、MSC/GFP组、MSC/PLA组、MSC/PLA+VC组(MSC/PLA预处理200μM VC 7天）。注射前，细胞在PBS中洗涤两次，然后计数。通过台盼蓝染色测定存活率，并高于 ．将细胞重新悬浮在PBS中 细胞(MSC/GFP、MSC/PLA、MSC/PLA+VC)或PBS (PBS)，体积为100μ将l肌肉注射到胫骨前肌的4个部位。每15-20分钟仔细观察一次动物，以确保所有动物从抗血清中恢复良好。

2.11.血流分析

如前所述，对血流灌注进行评估[23].用激光多普勒灌注成像仪（Perimed AB）评估后肢的组织灌注结扎后第0天、第7天和第14天。分析数字彩色编码图像，以量化从腹股沟韧带上方的髂外动脉到脚趾的血流。在室温26°C下使用avertin麻醉下采取措施。缺血（右）/正常（左）的比率用肢体血流量表示结果，计算各组的平均值和标准差。

临床恢复:进行生理、组织学检查和血流灌注分析。手术和结果评估由两名患者独立完成。

缺血肢体的生理状态分为三个级别：肢体丢失、保肢和足部坏死。肢体丧失被定义为膝关节或以上部位肢体丧失。保肢是指保留肢体而不发生足部坏死。足部坏死包括足部和脚趾的丧失。

2.12.组织制备和免疫组织学分析

在第14天或第21天采集每只小鼠的腓肠肌进行组织学分析。将肌肉固定在4%的PFA中，用苏木精、伊红和马森三色染色。为了免疫荧光，将组织嵌入最佳切割温度（OCT）化合物和40%的冰冻切片中μ在superfrost玻片上安装m厚度。随后，进行免疫荧光染色；玻片通过共焦荧光显微镜（Leica SP8，共焦显微镜）检查。

2.13.微阵列信息和数据分析

安捷伦人类lncRNA微阵列2018 (4本实验使用180k，设计ID: 085630)，数据由OE生物技术有限公司(中国上海)进行分析。

使用NanoDrop ND-2000（热科学）对总RNA进行定量，并使用安捷伦生物分析仪2100（安捷伦科技）对RNA完整性进行评估。根据制造商的协议进行样品标记、微阵列杂交和洗涤。简单地说，总RNA转录成双链cDNA；然后，合成cRNA并用菁-3-CTP标记。标记的cRNA在微阵列上杂交。洗涤后，通过安捷伦扫描扫描阵列ner G2505C（安捷伦科技）。

使用特征提取软件(version10.7.1.1, Agilent Technologies)对阵列图像进行分析，得到原始数据。使用genspring(14.8版，安捷伦技术)对原始数据进行基础分析。然后通过折叠变化识别差异表达基因;使用学生的测试。上调和下调基因的阈值为≥2.0和a值≤0.05。然后通过GO分析和KEGG分析来确定这些差异表达mrna的作用。最后进行层次聚类，显示样本间基因可区分的表达模式。采用基因集富集分析(GSEA)中的Signal2Noise方法对数据进行分析。

3.统计分析

定量变量表示为 ．连续变量的比较采用未配对的Student's方法进行测验对分类变量进行检验。对于多重比较，进行双向方差分析，然后进行Bonferroni多重比较。使用GraphPad软件进行统计分析。数值为 被认为具有统计学意义。

4.结果

4．1.前层蛋白A过表达引发SCB-MSC早衰表型并降低增殖能力

SCB-MSCs来自5名不同的患者(男性和女性，年龄在50 - 60岁，表S1）.原代培养后7天，成纤维细胞样细胞从SCB碎片迁移并粘附到平板上(图。S1 (a)).SCB MSC表现出成人干细胞特征，CD73、CD90、CD105和CD44呈阳性，但造血标志物CD45和CD31呈阴性[24(图。S1 (b))和多向分化潜能（图。s1d)然而，在SCB-MSCs的后期传代（第5代和第6代）中检测到prelamin A上调（图1(一)).此外，SA-β-在SCB-MSCs的后期传代中，半乳糖活性增加，增殖减少（图1 (b)和S1 (c))，提示前层蛋白a与细胞衰老有关。考虑到这些数据，我们选择第3至第5代SCB-MSCs进行以下实验。为了确定前层蛋白A是否会导致SCB-MSCs衰老，我们使用了含有gfp -前层蛋白A的标记重组腺病毒(图)。S1（e）和S1（f）)免疫染色显示，与GFP（MSC/GFP）转导的SCB-MSCs相比，这些SCB-MSCs积累了核前蛋白A并显示出异常的核形态（图1）1（c））.SA-的增加β-Gal活性在过表达前层蛋白a的SCB-MSCs (MSC/PLA)中表明细胞衰老增加(图)1（d）)间充质标记物的存在没有显著变化，包括CD73、CD90和CD44（图1 (e))在MSC/GFP和MSC/PLA之间。然而，通过Ki67染色检测，自我更新能力显著降低（图1 (f))，提示增殖减弱。

衰老细胞分泌促炎细胞因子、趋化因子和蛋白酶，称为衰老相关分泌表型(SASP)，这也在积累的SCB-MSCs中检测到。以往的研究表明，炎性因子，如IL1β、IL6、IL8和MCP-1是血管平滑肌细胞(VSMC)在应答层前蛋白a诱导的持续性DNA损伤时大量分泌的[25].如预期，IL1的mRNA水平β，IL6和IL8也随着TGF的减少而显著上调-β和CXCL 10[26)(图1（g））.

间充质干细胞具有多种分化潜能，包括成骨、成脂和成软骨谱系。首先，ALP活性和茜素红染色显著降低，提示MSC/PLA在诱导7天和14天后的成骨分化潜能较MSC/GFP弱(图)1（h）)第二，油红o染色显示脂肪生成诱导减少（图1（i））.

4.2.Prelamin A过度表达减弱了SCB-MSCs对后肢缺血的治疗作用

后肢缺血后检测SCB-MSCs前白蛋白A的功能活性体内基于骨髓间充质干细胞移植后改善血管循环的能力[27]．首先，通过结扎C57BL/6小鼠右后肢股动脉及其分支诱导小鼠右肢缺血[28]然后，将对照组（PBS）、MSC/GFP和MSC/PLA通过肌肉注射注入胫骨前肌进行移植， 每组。在术后第0天、第7天和第14天，对三组治疗效果的三个水平进行评估，即肢体挽救性、足部坏死和肢体缺失(图)2（a））.在治疗结束时，移植后14天，PBS组有8例(57.1%)肢体缺失，6例(42.8%)足部广泛坏死。MSC/GFP组有8例(71.2%)肢体残存，4例(28.4%)趾至膝轻度至中度坏死。相比之下，MSC/PLA组有4例(28.5%)肢体残存性明显下降，6例(42.8%)足部坏死，4例(28.5%)肢体缺失(图)2（b）左和右)。

在第0天（术后）、第7天和第14天对后肢进行激光多普勒血流成像，以评估细胞移植对血液灌注的影响。三组血液灌注的重复测量ANOVA分析显示有显著差异( ）第14天，激光多普勒图像显示PBS组持续14天的血液灌注率较低，表明出现严重后肢缺血（图1）2 (c)左右； ，在MSC/GFP和MSC/PLA移植组中，血液灌注在14天内逐渐恢复，无显著差异( ）.然而，与MSC/PLA不同，MSC/GFP组在第7天血液灌注显著增加( ),提示MSC/PLA组与MSC/GFP组的新生血管形成延迟且较低(图)2 (c)左和右)。

采用组织学技术对治疗效果进行进一步评价，每组7只小鼠的不连续冷冻切片共20片。移植后第14天缺血肢体的组织学分析显示大量肌肉变性，苏木精和伊红染色显示粒细胞和中性粒细胞浸润，Masson三色染色显示纤维结缔组织替换(图)2 (d)顶部和中部）。除了明显的纤维化替代外，PBS组还广泛发现大量粒细胞和中性粒细胞浸润。MSC/GFP和MSC/PLA组显示出改善的纤维化和肌肉退行性变，并且在后肢缺血中大量粒细胞和中性粒细胞浸润减少后部分获救（图1）2 (d)顶部和中部)。MSC/PLA组比MSC/GFP组纤维化更严重( ）.与PBS组相比，MSC/PLA治疗的肢体炎症明显减轻( ）.

免疫荧光图像mcd31阳性血管显示新生血管。使用ImageJ测量每个标本中四个不同解剖区域的两个不同区域的毛细血管密度。第14天，抗mcd31染色显示MSC/GFP和MSC/PLA组之间的整体新生血管没有显著差异，优于PBS组(图)2 (c)左下角)。定量测量结果显示，与PBS组相比，MSC/GFP和MSC/PLA组中mCD31细胞阳性染色百分比，后肢缺血时可见新生血管(图)2 (c)底, ）.

4．3．前层蛋白a诱导SCB-MSCs的DNA损伤和庇护蛋白复合物的不稳定表达

由于增殖和潜在功能减弱，我们研究了前层蛋白a过表达可能造成的损伤。已知异常的核形态会触发VSMCs中的DNA损伤[29]，在Ser139处磷酸化H2AX，形成γ-H2AX，导致DNA修复蛋白的招募，如53BP1和BRCA1[30]．的可视化γ-H2AX可以使用免疫荧光分析法。正如预期的那样γ与MSC/GFP相比，MSC/PLA中-H2AX病灶增加(图)3(一个)和3（b）).以前的研究使用γ-来自Zmpste 24-/-小鼠的辐射小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）缺乏层粘连蛋白A处理酶，表明泛核53BP1蛋白重新分布到不同的病灶中[31]在MSC/PLA中也检测到泛核53BP1蛋白（图3（c）)同时，生长停滞和DNA损伤诱导45（GADD45A）的mRNA水平上调（图3（d））.

哺乳动物的端粒与shelterin有关，shelterin是一种蛋白质复合物，可以保护DNA末端不被认为是双链断裂，从而限制DNA损伤反应的触发[32，33].包含shelterin复合物的蛋白质为端粒保护蛋白1（TPP1）、端粒重复因子（TERF）1、TERF2、TERF1相互作用核因子2（TINF2）、阻遏激活蛋白1A（RAP1A）和端粒保护蛋白1（POT1）[33]端粒-蛋白质复合物形成的重要作用是端粒末端融合的高频率和端粒保护蛋白缺失时发生的不适当重组[34].与端粒磨损相关的保护蛋白复合物POT1、RAP1A和TERF1中六种成分中的三种水平降低，间接表明端粒磨损（图1）3（e））.

活化DNA损伤反应，包括形成含有活化H2AX的DNA损伤灶(γ-H2AX)在无帽端粒或持续DNA链断裂是细胞衰老的主要触发因素[35]DNA损伤触发DNA修复机制、凋亡或衰老，具体取决于损伤程度和生理环境。P53及其下游靶点参与DNA损伤修复[36]与我们的预期相反，流式细胞术分析显示，与MSC/GFP相比，MSC/PLA中膜联蛋白V的阳性表达较低（图1）3（f）)在prelamin A过度表达后，SCB MSCs表现出可测量的caspase 3下调，Bcl2 mRNA水平显著升高，凋亡Bcl2/BAX比率水平升高（图3（g）)，提示抗细胞凋亡。

为了了解MSC/PLA增殖潜能降低的机制，在MSC/GFP和MSC/PLA中检测细胞周期和衰老标记物。碘化丙啶-（PI-）染色细胞的流式细胞术显示S期显著阻滞，表明细胞周期在G1/S检查点被阻断（图3 (h))SCB MSCs中prelamin A的过度表达增加了p53和p21蛋白的表达，而p16蛋白的表达没有显著变化，这也通过定量RT-PCR进行了验证（图3(我)和3 (j))细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白通过定量RT-PCR进行评估。在MSC/PLA中CDK2和CCNE均急剧下降，导致G1/S检查点的阻滞（图3（k））.

4.4。微阵列分析显示MSC/PLA基因表达谱的变化

为了研究在前层蛋白A积累过程中整个转录组的表达变化，使用了微阵列分析比较感染了对照或前层蛋白A腺病毒的SCB-MSCs。根据之前的两个主要成分，微阵列检测到386 mRNA水平发生了显著变化(193个上调，193个下调)(图)4（a）和4（b）、表S3)KEGG分析显示，MSC/PLA中的上调和下调途径在途径中富集。前3位上调富集途径脂肪细胞因子信号途径(值：0.0032），AMPK信号通路(数值：0.0043）和细胞周期(数值：0.0047）。另一方面，显示富集的前5个下调途径是不饱和脂肪酸的生物合成(值:0.002)、PPAR信号通路(pvalue:0.0108)、细胞外基质(ECM)-受体相互作用(数值：0.0168）（图4（c））.一致地，基因集富集分析(GSEA)数据显示，MSC/PLA在KEGG通路中富集，包括ECM受体、DNA复制、移植物抗宿主病和细胞周期。这些结果显示了DNA复制、细胞周期和放大的炎症因子的改变，与我们上述的发现一致(图)4（d））.热图显示了富集DNA复制、细胞衰老、ECM受体相互作用和人类衰老的基因转录水平，验证了MSC/PLA的基因组异常(图)4 (e))此外，我们发现MSC/PLA中的I型胶原和III型胶原下降，从而验证了ECM中观察到的变化（图4 (f)）.

4.5.维生素C缓解MSC/PLA的过早衰老

以前关于线虫、WRN缺乏的人类间充质干细胞和小鼠模型表明，用高剂量VC持续长期治疗WS患者是一种有希望的治疗方法[37- - - - - -39]．但VC对前层蛋白A积累引发的细胞衰老的影响尚未研究。我们研究了VC处理对层前蛋白A过表达SCB-MSCs的影响。

用VC预处理7天后，SA呈剂量依赖性下降-β-观察到半乳糖阳性细胞（图1）5（a）)VC对衰老的抑制作用在50℃时非常显著 μ摩尔/升，相对于MSC/PLA( ）(图5 (b)）.VC治疗的疗效以剂量依赖性的方式急剧增加，在200时达到饱和μmol / L。SA -β-Gal阳性细胞随着VC剂量的增加而增加，甚至超过200 μmol/L；然而，在所有治疗剂量下，记录的细胞数量均低于未经治疗的MSC/PLA中记录的细胞数量（图5（a）和5 (b)）.根据这些发现，200μ选择mol/L VC作为评价其对细胞衰老抑制作用的最佳剂量。

我们评估了VC处理后SCB MSCs细胞衰老过程中prelamin A的蛋白水平。有趣的是，VC显著降低了MSC/PLA中prelamin A的表达（图5 (c)）.为了确定VC对衰老相关参数的影响，我们用VC对MSC/PLA进行预处理，并检测了不同的细胞性质。与细胞过早衰老中观察到的变化一致，VC治疗显著减轻了SASP，包括TNF等促炎细胞因子的mRNA水平α和IL1β(图5 (d))，增加Ki67的表达(图5（e）)，在mRNA水平上逆转POT1、RAP1A和TERF1的表达，提示庇护素复合体对端粒的抢救保护作用(图)5（f）)VC还显著提高了I型胶原和III型胶原mRNA水平，重建了prelamin A过度表达引起的ECM缺陷（图5（g））.

与细胞周期相关基因相关表明，VC治疗下调了p21蛋白水平(图)5 (h))， CDK2和CCNE1 mRNA水平上调(图5(我))VC还改变了mRNA水平上Bcl2和BAX的表达，凋亡Bcl2/BAX比率降低（图5（j）)，轻微地挽救了前层蛋白A过表达引起的变化。但是，VC对GADD45A的表达没有影响(数据未显示)，这表明核层成分的恢复可能与DNA损伤反应(DDR)的缓解无关。

探讨VC能否恢复SCB-MSCs新生血管体内，将VC预处理的MSC/PLA (MSC/PLA+VC)移植于后肢缺血， 每组。第7天，MSC/PLA+VC组缺血后肢表现为肢体皮肤温度升高、肿胀，与MSC/PLA组相比，甚至高于正常肢体的血液预灌注。但在第14天，与MSC/PLA组相比，血流灌注没有显著增加，即使在第21天，MSC/GFP组仍低于MSC/PLA组(图)5（k）和5（l）)，提示MSC/PLA存在严重的功能缺陷体内．

总之，我们的研究结果表明，前层蛋白A触发SCB-MSC的过早衰老，而VC抑制MSC/PLA中前层蛋白A的表达，从而延缓细胞衰老的增加。VC治疗可部分降低MSC/PLA中的SASP，逆转其表达下降的shelter complex，部分挽救细胞周期阻滞和抗凋亡(图)6）.

5.讨论

衰老是许多慢性疾病的主要危险因素。干细胞衰老在衰老过程中起着关键作用。在本研究中，我们发现VC治疗可以挽救prelamin a诱导的SCB-MSCs过早衰老。prelamin a累积的SCB-MSCs显示出降低的多分化潜能和损害的neov后肢缺血时的血运重建。prelamin A的过度表达导致核形态异常，shelterin复合物表达减少，加速DNA损伤和细胞周期停滞，导致SCB-MSCs衰老。有趣的是，VC略微改善后肢缺血时MSC/PLA的新生血管。VC缓解衰老通过急剧降低prelamin A的表达，降低SASP，挽救由prelamin A过度表达引起的shelterin复合物和细胞周期阻滞的破坏作用。虽然VC已广泛用于保护细胞免受氧化，但我们的研究首次确定VC可作为抗prelami的基因保护剂n积累。

5．1.前层蛋白A过表达是SCB-MSC细胞衰老和功能衰竭的有力驱动因素

在Hutchinson–Gilford早衰综合征（HGPS）和正常衰老、血管平滑肌细胞和成纤维细胞中，早衰可归因于前拉明A和早衰素的毒性累积[15，40]与本研究类似，在SCB-MSCs的早期传代（p3）中，检测到少量前拉明A，但在后期传代（p6）中快速增加，随后出现生长特性受限和寿命短的现象。SA的表达增加-β-Gal活性，在后期传代中的老化标记，证实了细胞衰老。从成体组织中分离出的MSCs的下增殖是成体干细胞老化后特性的代表[41]，并从接受膝关节置换手术的患者（年龄50-60岁）的废弃胫骨平台中分离出MSC。

正如预期的那样，前层蛋白A伴随着早衰的增加而出现。层前蛋白A过表达SCB-MSCs可见核畸形，包括核分叶、核增大、形态缺陷等，与既往研究报道的VSMCs、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、内皮集落形成细胞(ECFC)的变化一致[15，29，42].Prelamin A过度表达对干细胞标记物的基本表达没有影响，包括CD73、CD90、CD105和CD44。黑色素瘤细胞粘附分子（MCAM，也称为CD146）是抗衰老和干细胞的标记物，在从人脐带血培养的MSC多次传代后逐渐减少[43]．但SCB-MSCs呈极低的阳性表达，两组间无差异(数据未显示)，提示膝关节置换术供体获得的SCB-MSCs容易衰老。

细胞衰老的主要特征，包括增殖下降和细胞周期停滞，在SCB-MSCs中观察到prelamin A。先前的研究表明prelamin A诱导VSMC中Ki67表达的减少[29]和BrdU在HUVEC和ECFC [42]类似地，我们的研究显示，在SCB-MSCs中Ki67的表达降低，这表明增殖能力降低。

大量研究表明，持续DNA损伤的细胞会产生一种特殊的SASP。在体外使用各种细胞类型的研究表明，具有极短端粒的衰老细胞的积累可能产生促炎因子，而促炎因子又可能导致炎症负荷增加[44- - - - - -47]．在我们的研究中，IL6, IL8和IL1显著增加β显示SASP，加速细胞衰老。

以前的报告显示，供体年龄不影响细胞形成骨的能力体内[41]，以及用成骨分化培养基处理的年轻和老年供体的MSC早期传代培养[48]然而，在iPS-MSC系中，成骨分化不同[17]．一些HIV蛋白酶抑制剂的长期治疗可诱导衰老和改变成骨细胞和脂肪细胞分化[49]在我们的研究中，在分化培养基中培养后，prelamin A积累的SCB MSCs的成骨和成脂潜能显著降低，表明prelamin A积累后的多分化潜能降低。这在一定程度上与先前的研究一致，研究表明，普杰林干扰了人骨髓间充质干细胞的成脂潜能[50，51]这些研究中的差异部分可能是由于MSCs的不同来源和prelamin A的积累。

使用后肢结扎小鼠模型，我们发现MSC/PLA组在挽救后肢缺血方面仅略优于PBS组，与MSC/GFP组介导的成功挽救相比。尽管SCB-MSCs组肢体残存较多，但MSC/PLA组足部坏死多于MSC/GFP组。激光多普勒血流图检测血液灌注显示MSC/PLA组的抢救效果较差。组织学分析，使用苏木精、伊红和Masson三色染色，证实与PBS组相比，SCB-MSCs中大量粒细胞和中性粒细胞浸润纤维化，肌肉退行性变减少。同样，与MSC/GFP组相比，MSC/PLA组的救援能力较差。CD31的免疫染色显示，MSC/GFP组和MSC/PLA组之间的总体新生血管形成没有显著差异，这优于PBS组，微循环重建延迟和受损可能是其原因。

5.2. Prelamin A诱导的DNA损伤扩增和Shelterin复合物损伤加速SCB-MSC细胞周期阻滞

以往的研究表明，预胺A在不同的细胞中积累，导致细胞核形态异常，并引发DNA损伤[16，19，29，42]．在DNA损伤后，双链断裂(dsb)周围的染色质被改变，组蛋白被修改以促进修复蛋白的进入[52]作为对DSB诱导的快速反应，H2AX在Ser139形成时磷酸化γ-H2AX促进DNA修复蛋白的募集，如53BP1和BRCA1[30].更多γ-在prelamin A过度表达的SCB MSCs中检测到H2AX和53BP1，表明扩增的DNA损伤更高。

端粒功能障碍是衰老过程中的关键标志之一，它是由保护复合物的临界缩短或破坏引起的，导致细胞衰老[53]．哺乳动物的端粒与庇护蛋白有关，这是一种蛋白质复合物，其功能是保护DNA末端不被识别为双链断裂，从而引发DNA损伤反应[32，33]先前的研究表明，在G1期POT1功能的丧失会导致随后的S/G2期端粒的快速侵蚀[34]．端粒磨损相关的6个组分中的3个(POT1、RAP1A和TERF1)水平下降，间接提示端粒功能障碍。

DNA损伤（单链或双链断裂）触发适应性细胞反应，触发细胞周期停滞、衰老、凋亡或增殖。这些反应通过不同的信号途径引发，激活细胞周期检查点，随后导致不同的细胞命运：细胞周期停滞促进衰老（永久性阻滞）或细胞死亡。有趣的是，流式细胞术显示，随着凋亡Bcl2/BAX比率的升高和caspase 3表达的降低，MSC/PLA中的凋亡受到抑制。在过度表达prelamin A的SCB MSC中检测到S期阻滞。衰老细胞的特征是持续的DNA损伤反应（DDR），通过激活p53/p21和p16/pRb途径最终导致细胞周期停滞和衰老[54]细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21和p53的上调有助于细胞周期停滞和增殖减少，支持这些改变（包括p53途径的慢性激活）可能是衰老表型的驱动因素的假设。正如预期的那样，CDK2和CCNE急剧下降，表明G1/Seckpoint对prelamin A的过度表达更为敏感。有报道称，prelamin A在VSMC中的积累导致有丝分裂失败[29]然而，我们在SCB MSCs中观察到G1/S期延迟，考虑到不同的细胞，需要进一步研究。

微阵列分析揭示了基因表达谱的变化，包括DNA复制、细胞周期的改变，以及前层蛋白a过表达SCB-MSCs中放大的炎症因子的改变，上述已证实。

5.3.VC治疗部分挽救了Prelamin A诱导的SCB-MSCs功能受损

高水平的VC倾向于诱导自由基，从抗氧化剂到氧化剂的表型转换。维生素C(范围从0.1μM到10 在我们的研究中，我们尝试了不同剂量的维生素C，发现200 μM是评价VC对细胞衰老抑制作用的最佳剂量。根据人体组织中抗坏血酸(VC)的含量，200μM浓度大约等于脑脊髓液中VC的浓度，即40-80 μ血浆中的M[55]我们的研究表明，高浓度的VC（即200 μmol/L）对SCB-MSCs的再生效果最好，且没有明显的细胞毒性，这意味着口服补充VC可能不足以延缓细胞衰老。因此，需要非常谨慎地对人类患者的最佳VC浓度进行滴定。

在成人衰老的干细胞模型中，我们确定了高剂量的VC作为一种有效的缓解衰老过程的药物。VC对细胞衰老有明显的抑制作用(以SA-β-Gal染色），降低prelamin A的表达，降低SASP，以及挽救由prelamin A过度表达引起的shelterin复合物损伤。

我们还发现VC降低了TNFα，IL-8和IL-1βMSC/PLA分泌，这可能有助于改善MSC/PLA在治疗后肢缺血方面的作用。这表明在老年人中使用VC来减少炎症介质的可能性。鉴于广泛报道的事实，MSC通过分泌促血管生成细胞因子支持显著的旁分泌效应，这些细胞因子提供抗细胞凋亡效应和刺激血管重建[56]VC可能通过减少PLA过度表达诱导的炎症介质表达，轻微恢复MSC/PLA的体内生存能力。

综上所述，我们已经证明，SCB-MSCs中的前拉明A积累导致MSCs的异常核形态和较低的多潜能分化体外和体内有趣的是，这些变化中的一部分是通过VC治疗得以挽救的。由于prelamin A积累广泛存在于早衰和生理性人类衰老中，VC在低剂量和高剂量下发挥着不同的作用es需要了解衰老表型和衰老相关的病理学，以制定治疗策略。此外，如何有效地提供足够的VC来抗衰老，以及VC如何协调不同的机制来缓解MSC的衰老缺陷，也需要进一步的研究。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

我们感谢所有实验室成员提供的有用反馈。这项工作得到了军事重点项目BWS12J051至XHX的支持。

补充材料

图S1。SCB-MSCs的特性和前层蛋白A转染效率。(a)原代SCB-MSCs形态。酒吧规模:500。(b) SCB-MSCs间充质标记的免疫表型特征。(c)体外传代后SCB-MSCs增殖受限。(d)茜素红染色(上，标尺:500μM)和油红染色(向下，比例尺:100μm） 分别显示SCB-MSCs的成骨和成脂分化。（e）通过免疫荧光和流式细胞术显示转染效率。比例尺：200 μm、 （f）免疫印迹证实SCB SMC中prelamin A的过度表达。表S1：供体的基本信息。表S2：引物列表。表S3：386 mRNA水平的显著变化（193个上调，193个下调）。（补充材料）

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