结合创新Bioink和低细胞密度的生产3 d-bioprinted软骨替代品:一个试点研究

文摘

3 d印刷为3 d生物打印提供有趣的机会组织通过提供活细胞与适当的支架专用的结构。生物细胞封装bioinks目前承诺的进步,特别的间充质干细胞(msc)。我们现在这里软骨移植的发展,3 d生物打印交付msc封装在一个原始bioink在低浓度。3 d-bioprinted构造( )印刷使用海藻酸/明胶/纤维蛋白原bioink混入人类骨髓msc。生物打印的影响过程和chondrogenic代谢MSC分化,基因档案,和细胞外基质(ECM)生产两种不同的MSC浓度(100万或200万个细胞/毫升)是评估在28天(D28)通过使用MTT测试,实时rt - pcr、组织学和免疫组织化学,分别。然后,环境的影响(TGF -等生长因子β1/3和/或BMP2和氧张力)chondrogenicity评估在1 M细胞/毫升浓度D28和D56线粒体活动,通过测量chondrogenic基因表达,软骨基质合成的质量。我们确认的安全bioextrusion和凝胶浓度的100万年和200万年MSC /毫升细胞新陈代谢。TGF - chondrogenic效应β1代内验证了D28通过测量chondrogenic基因表达和ECM合成D28(葡糖氨基葡聚糖和II型胶原蛋白)。1米的浓度代表最好的妥协。然后我们评估各种环境因素的影响的替代品D28(分化)和D56(合成)。Chondrogenic基因表达是最大的影响下D28 TGF -β1或TGF -β3单独或结合BMP-2。缺氧抑制肥厚性和成骨的基因的表达。ECM合成是最大D56葡糖氨基葡聚糖和II型胶原蛋白,特别是结合TGF -的存在β1和BMP-2。持续低氧不影响矩阵合成但显著降低微钙化物质在细胞外基质的外观。描述的策略是为3 d生物打印非常有前途的bioextrusion原始bioink含有低浓度的msc紧随其后的文化替代品在缺氧条件下的综合影响下TGF -β1和BMP-2。

1。介绍

运动创伤和过度使用很大程度上有助于软骨的病变的发生在负重地区的年轻患者。软骨缺陷报告非常常见的病变,63%的患者接受关节镜检查(1]。软骨是一种分层无血管的组织修复能力很有限。其再生修复透明软骨,从而将可能减少其退化为了防止骨关节炎的发展。

软骨的局灶性病变的临床外科参考治疗仍然mosaicplasty,它使用骨软骨切片是从non-weight-bearing区域外围的联合正在修理。mosaicplasty相对满意的结果第一2年但经验陡峭的失败率在接下来的两年。高失败率通常记录(大约55%)(2),和收集从膝关节骨软骨插头往往导致相当大的施主能级发病率为knee-to-knee(6%)和knee-to-ankle(17%)移植后mosaicplasty程序(3]。

目前,软骨修复策略主要集中在组织工程(4),包括创建一个功能化材料,模仿当地的组织。为此,3 d生物打印是一种迅速的新兴技术,它使用同时活细胞内部的三维沉积支持专用的生物相容性的生物材料(5]。这种技术允许获得一个定义良好的,往往复杂,形式的定制的尺寸使用一层获得生物制造策略。软骨组织工程,最常用的3 d印刷过程是extrusion-based生物打印,这是众所周知的能够产生可行的几厘米大小的结构(6,7]。

大多数发表的3 d生物打印研究利用高细胞密度,这并不代表本地软骨。事实上,软骨细胞代表只有2%的透明软骨体积(8]。候选人对这些细胞,软骨细胞最初研究作为软骨组织工程的“神奇子弹”。然而,他们可怜的可用性在软骨和成纤维细胞的去分化仍在单层扩张阶段至关重要的制约因素。有鉴于此,研究人员现在使用间充质干细胞(msc)是一个强大的选择:他们足够强大的生存生物打印过程固有的剪切应力和压力(9)和潜力发挥良好的增殖能力,一个优秀的TGF -β借chondrogenicity在专门设计的专用的3 d环境中(10]。msc可以提取多个组织,如骨髓、脂肪组织,滑膜,骨膜,和肌肉,通过细胞分裂,能够更新自己,可以分化成multilineage细胞,包括关节细胞(11),典型的辅助关节软骨细胞外基质2型胶原和蛋白聚糖的生产。

的优化3 d生物打印过程(即。、挤压、液滴或激光12])和良好的印刷适性bioink的配方是生产的关键几厘米大小的3 d软骨替代含有活细胞(13,14]。extrusion-based生物打印(低潮)过程是最合适的技术,用于软骨组织工程的要求。的脱细胞细胞外基质相结合bioink和msc使3 d的生产组织的沉积过程,与专门设计的层(15- - - - - -19]。bioink用于软骨替代品通常是水凝胶促进均匀的细胞三维结构封装,允许足够的抵抗力。它是一种很有前途的一个用于软骨组织工程和再生医学应用程序由于生物化学和物理特性的平衡20.- - - - - -22]。

自然水凝胶被广泛用于软骨组织工程和bioink配方消退。藻朊酸盐是一种低成本从褐藻中提取的生物材料具有良好的印刷适性和良好的生物相容性12,23,24]。明胶,丰富和廉价的材料从变性提取胶原蛋白在动物皮肤和骨骼,显示一个可逆热敏的凝胶机理和产生较低的抗原性和更好的生物相容性与胶原蛋白(12]。纤维蛋白原是一种糖蛋白,通过蛋白水解反应与凝血酶形成纤维蛋白,从而使快速凝胶保持3 d形状的3 d打印的构造25]。基于这三种生物材料,Pourchet et al。26)最近开发了一种复合bioink保证cytocompatibility生物打印后在3 d生物打印和细胞增殖,使生产的全层皮肤组织细胞浓度较低(1 M细胞/毫升)对比与之前用于软骨组织工程(4米到50米/毫升)27]。

在目前的试点研究,此处bioink开发验证和应用在体外生产的组织工程化软骨替代品软骨的局部损伤的再生治疗。我们的方法利用使用MSC密度低,更具代表性的本土软骨。尽管msc并不常用于软骨生物打印(28- - - - - -32软骨组织工程),他们非常有前途,因为chondrogenic潜力和优秀的可用性(例如,从骨髓)自体或同种异体移植。为此,我们首先评估了生物相容性bioink和3 d bioextrusion过程对MSC代谢的影响及其基因表达谱和ECM生产,在两个不同的细胞浓度,模拟天然软骨的细胞密度。然后我们决定最好的分化/成熟条件(压力生长因子和缺氧)的MSC-driven chondrogenic软骨的分化替代品(Suppl1)。

2。材料和方法

2.1。干细胞体外分离和扩张

间充质干细胞(msc)与人工全髋关节置换术后骨髓(先进的骨关节炎(OA)、3 - 4年级Kellgren-Lawrence登台,60 - 80岁)患者知情同意后,与当地伦理委员会批准,授权文件直流2014 - 2148年,2014年7月,10^th)。为此,肝素化骨髓在PBS稀释(磷酸盐,pH值7.4)解决方案,然后在1600转离心5分钟。球是在培养基稀释,然后被播种在直径100毫米的培养皿 细胞/盘在37°C在湿润的气氛中含有5% ( )有限公司₂。媒介是第一个3天没有改变。不依从细胞被移除在连续媒体的变化。

在单层的扩张,msc被培养在低葡萄糖水平杜尔贝科的修改鹰中1 g / L的葡萄糖(31885年DMEM-LG Gibco)补充10% ( )胎牛血清(的边后卫,σ),1 ng / mL的bFGF (Miltenyi), 2毫米的谷氨酰胺(Gibco)和1% ( )青霉素链霉素(Gibco)。媒介改变了每周2次,直到细胞汇合的。一旦获得了80%的融合,msc使胰蛋白酶化镀的密度 细胞/瓶。在最后一段(P3)和在水凝胶播种之前,一个chondrogenic predifferentiation步骤执行。为此,msc是完全分化培养基培养(33)组成的DMEM和4.5 g / L的葡萄糖补充的边后卫,丙酮酸钠(110μg / mL, Gibco)、bFGF (1 ng / mL, Miltenyi), 1%青霉素链霉素(Gibco)和chondrogenic补充剂:脯氨酸(40μg / mL,σ),L-ascorbic acid-2-phosphate (50μg / mL,σ)和地塞米松(0.1μ米,σ)。msc在单层可以扩大到通道5没有失去他们的未分化表型和细胞造血的污染(34]。三个段落必须获得可比纯度> 90% (35]。

2.2。3 d生物打印工程软骨的替代品

所选的打印机是由作者和完全兼容实验室安全标准(26]。生物打印模式(GCode)使用Repetier主机软件生成®(Knickelsdorf Hot-World GmbH & Co . KG, 4247877 Willich德国),以生成一个矩形软骨替代长1厘米,宽1厘米,厚4毫米。bioink被制定为10%(的混合物 )牛明胶(Sigma-Aldrich、法国),1% ( )非常低的粘度海藻酸(分子量:216.121克/摩尔;阿尔法蛇丘、法国)和2% ( )纤维蛋白原(Sigma-Aldrich、法国)37°C (26]。的流变特性bioink已经发表(26]。所有的解决方案(纤维蛋白原、藻酸盐和明胶)前一天准备在无菌条件下印刷。他们被放置在37°C的良好溶解粉末。明胶是获得的生理盐水(20%)。纤维蛋白原准备在培养基(160毫克/毫升),海藻酸和准备在生理盐水(4%)。细胞了2毫升的纤维蛋白原4毫升的明胶添加海藻酸和2毫升(共8毫升)。

前生物打印(D0),人类bioink msc使胰蛋白酶化和播种,之后他们在无菌均质和加载10毫升注射器配备了450μm tronconical生物打印喷嘴直径。这些细胞被使胰蛋白酶化、计算和resuspended 2毫升的纤维蛋白原溶液中(160 mg 2毫升培养基)。4毫升的凝胶(20%氯化钠)和2毫升的海藻酸(4%氯化钠)。8毫升以这种方式获得均相使用Microman“特殊粘性媒体”吸管,然后在10毫升注射器。包含bioink的注射器在室温下保持30分钟,这是获得所需的时间的bioink粘度兼容优质逐层打印,避免泡沫。这30分钟时间以前由Pourchet等人在他们以前的工作。

bioink含有msc是打印的一层一层地构建组织工程软骨的替代品。生物打印后,软骨替代品被放置在培养皿中包含CaCl聚合溶液组成的4%₂( )凝血酶(25 U /毫升)和同时孵化和动摇了1小时在孵化器37°C加热装置(Heidolph®1000型)。与PBS溶液聚合和洗涤后,打印的替代品在各种成分的培养基培养。媒介改变了每周3次。Suppl2过程得到的照片。

2.3。线粒体活性测定

软骨3中的线粒体活动d-bioprinted替代品评价了MTT (3 (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)检测在不同的时间对所有研究条件(36]。一百毫升的培养基和25μL MTT的解决方案(5毫克/毫升)被添加到每个包含一个打印的替代品,和盘子在黑暗中孵化有限公司37°C的5%₂3小时。强烈的紫色甲瓒导数中形成活跃的细胞代谢,筛选了和稀释溶液含有十二烷基硫酸钠80克和200毫升的二甲基甲酰胺和200毫升的水(pH值4.7)。吸光度测量在580 nm分光光度计(Multiskan前,热Labsystems)在以下时间点:D0有或没有bioextrusion,有或没有聚合,D3, D7, D14 D21, D28。

2.4。实时rt - pcr分析

3 d-bioprinted软骨替代品被冻结在-80°C到分析。进行RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒),根据制造商的指示。提取后,进行逆转录500 ng RNA通过使用Omniscript RT工具包(试剂盒)。实时聚合酶链反应(PCR)进行使用QuantiTect™SYBR绿色PCR(试剂盒)。相对量化进行了使用标准曲线生成的纯化PCR产品为每个测试基因,在浓度范围从10³到10⁶ng /μl .标准化的基因表达水平,结果表示为每个基因的mRNA水平的比率和兴趣RPS29基因。这个基因(RPS29)被称为管家基因,这通常是一个本构独立的基因表达水平相对稳定的实验条件。基因检测在这项研究是那些编码II型胶原蛋白(COL2A1)、X型胶原蛋白(COL10A1),aggrecan (能),versican (VCAN性别决定地区),SRY (Y)盒9 (SOX9)、软骨寡聚基质蛋白(电脑及相关知识)、碱性磷酸酶(高山)、骨钙素(BGLAP)和osterix (OSX)。中给出的序列和产品尺寸表1。

2.5。Bioextrusion和聚合过程对线粒体的影响的活动

学习的效果bioextrusion 3 d生物打印过程中聚合的影响,需要维护的替代品由alginate-based bioinks,我们设计了两种类型的替代品是聚合或不为4%(一个小时 )CaCl₂。第一代是用3 d生物打印,另一个是直接与文化微量吸液管。对于后一种情况,因为它是一个不可印刷控制,alginate-based bioink直接放入培养皿中贯穿文化微量吸液管(Microman)模仿的形状和体积的3 d打印替代不使用低潮的过程。两个浓度的msc bioink测试:100万(1米)和200万个细胞每毫升bioink(2米)。线粒体活动在所有这些替代品的存在是评估生物打印过程评估后的各自影响bioextrusion和/或聚合过程。

2.6。的影响在Bioink TGF - MSC密度β1-Driven分化

评估的最佳细胞浓度用于以下实验,3 d-bioprinted软骨替代品在最低培养基培养包含只有1%(+预混料,BD生物科学)或一个富集培养基补充了TGF -β1 (10 ng / mL, Miltenyi)诱导msc和软骨基质合成的chondrogenic分化为28天。它的使用是为了避免胎牛血清,已经包含了生长因子。媒介改变了每周3次在替代品的成熟。D28 chondrogenic的基因表达,肥厚性和成骨的标记进行了分析。

2.7。环境的影响在Chondrogenicity(生长因子和氧张力)

后chondrogenic predifferentiation诱导的单层膜,与msc bioink准备预定义的100万细胞/毫升的浓度。3 d-bioprinted软骨替代品生产和养殖没有chondrogenic介质含有1%作为控制或与不同的文化媒体富含以下生长因子组合:TGF -β1 (10 ng / mL), TGF -β3 (10 ng / mL), BMP-2 (100 ng / mL), TGF -β1 (10 ng / mL) + BMP-2 (100 ng / mL),和TGF -β3 (10 ng / mL) + BMP-2 (100 ng / mL);替代品是培养在常氧(21%啊₂)或低氧(5% O₂28岁,56天)条件。媒介改变了每周3次。D28 D56,分析确定线粒体活动,chondrogenic基因表达,肥厚性,质量和成骨的标记,最后3 d内的软骨基质合成软骨组织学及免疫组织化学替代品。

2.8。组织学评价ECM合成3 d-bioprinted软骨替代品

软骨ECM的合成是通过组织学评估D28 D56。3 d-bioprinted软骨替代品和4%多聚甲醛溶液固定包含除了CaCl 10毫米₂和0.1钠甲次砷酸盐(pH值7.4)24小时在4°C。然后,一夜之间,替代品被洗在4°C 0.1钠甲次砷酸盐(pH值7.4)包含BaCl 50毫米₂在乙醇脱水,石蜡和嵌入。Five-micrometer部分被削减和染色用苏木精伊红番红花(细胞计数和形态),阿尔新蓝(pH值1.3)(硫酸粘多糖(GAG)内容可视化),和茜素红(pH值4.2)(钙沉积可视化)。组织学的研究是基于每个实验条件观察4 - 6部分。单个图像代表的每个实验条件了。

2.9。内部的II型胶原免疫组织化学3 d-bioprinted软骨替代品

II型胶原蛋白被选为透明软骨表型特征标记的评估chondrogenic MSC分化的程度3 d-bioprinted软骨替代品。用LSAB免疫组织化学分析®+工具包(合,Dako)使用II型胶原蛋白单克隆抗体(Labvision、法国)。石蜡包埋组织(5μ米)deparaffinized,胃蛋白酶处理(0.4% ,σ)30分钟在室温下,过氧化氢和孵化屏蔽解决方案5分钟阻止内生氧化酵素,精确地描述在我们以前的工作(37]。的部分与苏木精复染色和树脂安装。

2.10。微的笑料和胶原蛋白II型使用ImageJ染色

组织学和免疫组织化学的组织是由使用DMD 108光学显微镜成像(徕卡®、法国)4 x放大和评估与ImageJ软件(美国国家卫生研究院,美国马里兰州贝塞斯达,美国)。传输光的图像阿尔新蓝染色和胶原蛋白II型免疫组织化学记录和评估通过一种半定量的方法使用我们先前描述的图像分析软件ImageJ [37]。短暂,透射光图像记录和评估一种半定量的定义方法计算染色面积百分比(阿尔新蓝染色和免疫组织化学标记的胶原蛋白II型)。微密度分析进行图像提取的6个不同部分在4 x放大可视化整个建筑和由两个不同的实验与观测结果之间的误差不到2%。评估的微钙化物质识别用茜素红染色,我们评估了意味着每个图像的钙沉积数量4 x放大,

2.11。数据分析

分析一式三份(3到4例)为每个实验条件。然后提出的数据 描述内部和个人间的变化。基因表达的标准化水平,结果表示为每个基因的mRNA水平的比例的利息和D28和D56 RPS29基因。意义是由单向方差分析比较与Dunnett事后测试来比较每一批控制实验(的条件)。必要时,互动的意义与双向方差分析评估Bonferroni紧随其后的测试来评估细胞浓度的影响为每个条件或环境因素。三方方差分析终于同时执行评估各自的生长因子的影响,血氧定量法,和时间点。提供的细节是在每一个传奇。统计分析与GraphPad棱镜®V8。

3所示。结果

3.1。Bioextrusion过程的影响,聚合步骤,和细胞浓度

bioextrusion的影响过程和bioink聚合一步线粒体细胞MTT检测活动进行评估的替代品产生通过生物打印或手动。两种替代类型被分为2组根据他们是否有或没有产生小时CaCl聚合一步₂。结果如图所示1(一)。没有bioextrusion效果观察,无论细胞密度。同样,没有注意到差异之间的聚合和unpolymerized 3 d-bioprinted软骨替代品,不管播种密度(100万/毫升或200万/毫升)。此外,看来衡量线粒体活动直接与细胞的密度成正比的播种bioink(图1(一))。这些结果证实了DNA分析显示更大数量的DNA倍2 M的密度比在1 M D3 (Suppl3)。

3.2。TGF -细胞密度的影响β1-Driven MSC分化

3.2.1之上。线粒体活动

D3,结果显示不同的替代品的整体线粒体活动包含1米或2 M细胞/毫升(图1 (b))。事实上,对于包含2 M细胞的替代/毫升,吸光度而不是做在580 nm 2倍大于替代含1 M细胞/毫升,这完全与最初的细胞的数量。D7,我们观察到线粒体活动略有等效增加浓度在细胞内固有细胞增殖的头几天的替代品。D7,线粒体活动后保持稳定,直到D28在细胞浓度没有显著区别两个培养条件(或TGF -β1)增殖和分化减少增加(图1 (b))。

3.2.2。基因表达

chondrogenic研究基因表达与打印的替代品进行了28天后文化在最低中含有1%或中等富含TGF -β1,作为chondrogenic诱导物。结果呈现在图1 (c)。在每个密度(1米或2米),TGF -的影响β1相比,它的影响。正如预测的那样,TGF -β1诱导msc的典型chondrogenic分化播种在3 d-bioprinted替代品的重要过度COL2A1,COL10A1,能,SOX9,电脑及相关知识。相比之下,TGF -β1补充诱导成骨的标记,如没有明显的过度BGLAP(骨钙素)。在纤维化的标记中,只有COL1A1显著的过表达,而VCAN表达式保持稳定。此外,值得注意的是,典型的chondrogenic基因的表达(即COL2A1,能,SOX91米内)更增强替代品。

3.2.3。组织学和免疫组织化学

分析3 d-bioprinted软骨替代品D28首先证明密度分层结构能保持至少4周在不改变居民的细胞。事实上,他染色(4)没有透露任何改变的细胞无论培养条件(无细胞死亡)。此外,细胞均匀分布和缺乏细胞死亡率(紫色)观察,并没有明显的差异在1米和2米之间的细胞密度条件。

软骨替代了它唯一的特点是低水平的合成和劣质ECM,和没有显著区别1米和2米的条件。相比之下,与TGF -细胞培养β1展出是圆形的,它反映了一个厚的合成和更丰富的矩阵。此外,阿尔新蓝染色和II型胶原immunolabeling(图1 (d))表明,TGF -β1能够引发重大的笑料和II型胶原蛋白的合成,分布在整个3 d-bioprinted替代品。此外,ECM合成1 M条件更加明显,所评估的微密度分析(图1 (d))。我们只选择1 M以下的3 d生物打印条件实验。

3.3。纵向研究的结合生长因子和缺氧的影响

3.3.1。线粒体活动

D28,生长因子和缺氧影响细胞代谢,除了TGF -β3 /缺氧组合,有点刺激(图2(一个))。在D56 TGF -β1单独或结合BMP-2诱导线粒体活动显著增加,在normoxia和缺氧。在缺氧,TGF -β3单独或结合BMP-2 D56线粒体活动的显著增加。BMP-2独自没有显著影响线粒体的活动。最后,所有的实验条件是不利于细胞代谢与各自的控制。

3.3.2。基因表达

D28,在这个阶段分化、TGF -β1、TGF -β3内诱导msc的典型chondrogenic分化3 d-bioprinted软骨替代品(图2 (b))。的重要过度COL2A1,COL10A1,能,SOX9,电脑及相关知识是观察,支持假设TGF -没有区别β1、TGF -β3治疗,除了能的表达,在TGF -的存在大大增加β3只。此外,有趣的是,OSX,BGLAP,VCAN基因表达仍然是微不足道的。BMP-2就不能引起任何研究基因的过度表达,但是当它是结合TGF -β1或TGF -β3,BMP-2显著疗效COL2A1表达式(TGF - 2倍β1 + BMP-2 vs。TGF -β1和3年来TGF -β3 + BMP-2 vs。TGF -β3)。在全球范围内,缺氧抑制基因表达COL2A1,能,电脑及相关知识表达强烈降低D28和D56之间的表达SOX9(作为“chondromaster”基因)保持稳定。此外,肥厚性和纤维发生的基因的表达,也就是说,COL10A1和COL1A1缺氧下,大幅降低了D28和D56之间。

3.3.3。细胞外基质生产

normoxia之下,一个非常低的水平的蛋白多糖和II型胶原合成观察D28和D56 BMP-2文化条件(图3)。相比之下,TGF -β1、TGF -β3单独或结合BMP-2诱导显著进步的蛋白多糖和II型胶原蛋白的积累。然而,TGF -β1和BMP-2组合被证明诱导呕吐引起的生产相比,高TGF -β1一个人。最后,缺氧不影响ECM生产D28或D56(数据没有显示为了清晰图3见5 5 a和5 b),但显著降低钙沉积的形成在D28 normoxia条件下软骨替代品,D56(图4)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们证实有用的extrusion-based 3 d生物打印生产的复合bioink TGF -β诱导MSC软骨替代品。我们首先建立了缺乏挤压生物打印和聚合过程对MSC的影响新陈代谢。然后,我们验证了MSC浓度较低的存在(1米),发现在本地健康的透明软骨。这个浓度被证明导致可行的替代品与激活chondrogenic基因的影响下TGF -β1。独自的文化环境中,缺氧使钙化的发生和TGF -β1/3结合BMP-2导致显著增强chondrogenicity TGF -β1或TGF -β3。

MSC三维(3 d)生物打印是一种新兴技术,有望彻底改变再生医学领域(6,20.,38- - - - - -40),包括透明关节软骨工程(41- - - - - -52]。以前的软骨组织工程方法修复通常未能生成功能组织概括带状组织,细胞外基质(ECM)的内容,和对当地的软骨生物力学性质。各种支架和打印机已经使用了软骨再生。extrusion-based 3 d生物打印,bioink粘弹性被证实是一个至关重要的因素时,细胞存活率生物打印速度和挤压通量是常数(53]。此外,它的成分是其中一个关键因素,因为它直接影响设计的印刷适性和细胞软骨替代品。我们创新bioink,以前用于打印的皮肤(26),似乎是一个不错的候选人软骨再生医学。

天然生物材料是容易处理,是可生物降解的没有任何浪费,与聚合物,和拥有化学相似性与ECM组件的优点。在我们的实验条件下,复合bioink的海藻酸凝胶和纤维蛋白原允许我们设计在体外软骨替代品和获得优质合成ECM 56天后文化在鸡尾酒TGF -的存在β1和BMP-2。藻酸盐和明胶原作为3 d系统促进hyaline-like软骨组织的发展从chondrogenic获得msc分化与ECM富含II型胶原和蛋白聚糖(54- - - - - -57]。本机明胶本身很难提供机械稳定性但通常用于生物打印结合其他生物材料(56]。达利等人表明,褐藻胶和琼脂糖水凝胶支持的发展更透明cartilage-like表型(58]。此外,纤维蛋白原是一种可溶性血浆蛋白魔法在凝血酶和纤维蛋白从而扮演着一个重要的角色在三d-bioprinted形状的稳定性。有鉴于此,纤维蛋白原bioink中它被用来调节细胞分化和自我组织。在低浓度(1 - 5毫克/毫升),纤维蛋白原矩阵提供了一个适合细胞迁移和分化。相反,纤维蛋白原浓度超过10毫克/毫升诱导减少孔隙大小。此外,纤维蛋白也显示增加矩阵的稳定但减少f -肌动蛋白组织(59]。这个试点研究证实了一个普遍的相关性油墨层状胶原组织的再生医学。已经证明它值得在皮肤病学人造皮肤设计,及其组件类似多年来用于软骨组织工程。

我们的结果表明,我们的定制extrusion-based 3 d生物打印方法允许的逐层打印4毫米厚软骨的替代品,模拟3 d环境必要的诱导和维持MSC chondrogenic分化。我们的生物打印系统使用一个tronconical喷嘴,确保最好的保护细胞功能,正如前面演示(60]。为此,我们不可印刷控制评估产生剪切应力对印刷的影响细胞为28天。没有3 d生物打印过程的影响,观察聚合在细胞的可行性。通常情况下,3 d bioextrusion取决于压力的影响在挤压与粘度有关,外加压力和喷嘴直径。我们的结果与先前的数据证明生物打印流程整合与挤压、喷墨、激光生物打印技术并不影响细胞的生存能力,立即或在长期61年- - - - - -66年]。值得注意的是细胞生存能力大于90% 3 d生物打印过程和交联后的包含CaCl bioink₂解决方案或凝血酶(67年,68年]。相反,细胞生存能力可能会受到剪切力的影响应用的混合bioink或长postprinting交联过程中69年]。目前,生活/死细胞生存能力往往是唯一的试验进行评估生物打印过程的安全(53,70年]。在我们的实验条件,纵向线粒体活动的实时测量28天,有或没有TGF -β1,没有改变的细胞内的替代品。我们复合bioink因此环境保存MSC代谢活动提供了生物相容性的能力产生软骨ECM(蛋白聚糖和II型胶原蛋白)。

基于先前的研究证明chondrogenic msc分化的水凝胶治疗生长因子如TGF -β1 (71年,72年),我们确认的能力3 d-bioprinted msc在alginate-based bioink产生软骨低细胞密度矩阵。在软骨组织工程领域,大多数发表的研究使用高细胞密度,如10 - 20百万细胞/毫升,软骨细胞(73年,74年]。这是相同的范围用于MSC密度(30.,48,58,74年- - - - - -77年达到可接受的ECM生产。相比之下,研究使用1 - 3百万细胞/毫升是罕见的23,78年,79年]。在目前的研究中,使用这个细胞浓度,chondrogenic细胞代谢和基因表达D28符合我们之前的工作的结果使用海藻酸/透明质酸盐水凝胶(80年)或胶原蛋白海绵81年]在normoxia有或没有TGF -β1接触。此外,较低的细胞浓度相互塑造了细胞软骨的结构后,在细胞通讯主要旁分泌。这个低细胞浓度符合小透明软骨细胞的比例,特别是在中间地带。此外,在再生医学,低数量的细胞是一个优势。它促进养分扩散和减少ECM的梯度生产观察细胞浓度高(27,82年,83年]。低密度使它更容易使用病人的样本和获得细胞的数量足以迅速产生替代品。也减少了细胞的膨胀避免修改标志,在临床实践中降低污染的风险。

3 d-bioprinted软骨的替代品,我们观察到显著增加COL2A1,能,SOX9。全球,D28缺氧只有压抑chondrogenic和成骨的/肥厚性基因表达在分化阶段。ECM合成期间(D56),所有基因的表达减少,除了SOX9,这可能是由于其在胶原蛋白合成中的作用。在其他已发表的研究,这一趋势并没有观察到能和COL2A1对打印的软骨细胞(7]。相反,正如所料,ECM合成更明显D56和微测量后ECM染色证实相结合的好处TGF -β1和BMP-2 [75年,84年- - - - - -87年]。正如我们此前的一项研究报告的滑液msc、没有观察到BMP-2单独对基因和蛋白质含量的影响(37]。不幸的是,msc的表现型软骨修复是不稳定的,分化继续沿软骨内骨化通路。换句话说,当推对软骨形成,msc往往演变成肥厚性/成骨的承诺。肥大细胞体积增加,ECM重塑。这些变化是由转录因子调节的Runx2 / MEF2C,调节转录的胶原蛋白x缺氧的主要作用是防止发生intra-ECM微钙化物质(88年),这是表型漂移的特征对成骨细胞表型,为证明本茜素红染色。正如广泛报道Pattappa et al。(89年),COL10A1和BGLAP表达强烈抑制在D28缺氧(或chondroxia / physioxia),从而防止肥大和辅助ECM钙化或骨化(89年- - - - - -92年]。

5。结论

目前的研究展示了一种很有前途的方法为关节软骨工程使用extrusion-based 3 d生物打印过程和低浓度(1米)的人类骨骼msc。我们创新bioink结合海藻酸、凝胶和纤维蛋白原是安全的msc,允许生成TGF -β诱导工程软骨的替代品。在本实验的第一步,我们复制结构的软骨的中间地带,与圆形细胞在一个丰富的MEC 1毫米的四层内。4毫米与人类软骨厚度和旁分泌软骨细胞之间的沟通。能和COL2A在场。没有检测到船。在这种情况下,缺氧并没有显著改善ECM合成但阻止钙沉积。最后,缺氧稳定chondrogenic表型,特别是当使用TGF -的组合β1和BMP-2。这些结果需要进一步和体外生物力学研究在活的有机体内研究证实这些软骨的生物相容性/ biofunctionality和biointegration替代品在异位93年和原位79年)条件。下一步将MSC不同来源(如骨,滑膜MSC)和环境(透明质酸盐、硫酸软骨素、胶原蛋白、羟磷灰石)复制每一层浅,中间,深,钙化区。

缩写

1米、2米:	一个或200万个细胞/毫升bioink
3 d:	三维
能:	Aggrecan(基因)
方差分析:	方差分析
bFGF:	碱性纤维母细胞生长因子
BGLAP:	骨钙素(基因)
BMP-2:	骨形成蛋白2
有限公司2:	二氧化碳
COL10A1:	胶原蛋白类型Xα1链(基因)
COL2A:	胶原蛋白II型α1链(基因)
电脑及相关知识:	软骨寡聚基质蛋白(基因)
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
衰退:	Extrusion-based生物打印
做的事:	吸光度
ECM:	细胞外基质
的边后卫:	胎牛血清
呕吐:	糖胺聚糖
他:	苏木精赤藓红番红花
其:	Insulin-transferrin-selenium
M:	几百万
msc:	间充质干细胞
麻省理工:	3 (4 5-Dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子
办公自动化:	骨关节炎
OSX:	Osterix(基因)
PBS:	磷酸盐
存在:	定量逆转录聚合酶链反应
RNA:	核糖核酸
RPS29:	核糖体蛋白S29(基因)
SOX9:	决定性别的region-related HMG-box9(基因)
TGF -β:	转化生长因子β(1 - 3)
VCAN:	Versican(基因)。

数据可用性

期间的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

临床协议是我们Universitary医院伦理委员会批准(授权文件直流2014 - 2148年,2014年7月10日)。

的利益冲突

作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

C Henrionnet, L Pourchet P Neybecker, O Messaoudi参与组织学和生物化学的贡献。D Mainard D Loeuille C马奎特参与知识贡献和编辑的手稿。C Henrionnet, P套现,Pinzano导致了合成和编辑的手稿。所有作者阅读和批准最后的手稿。

确认

我们感谢的护理人员Chirurgie Orthopedique & Traumatologique和埃米尔·加勒中心CHRU南希,协助提供临床资料。这项工作是支持的“方向兴业银行des武器(DGA),格兰特/奖号码:anr - 16 - astr - 0021”;”de la医学研究院Appliquee未来倒基金会授予/奖号码:ap - rm - 16 - 042”;和“大学德Lorraine-Region Alsace-Champagne-Ardennes-Lorraine 2016年,格兰特/奖号码:aap - 002 - 037。“保罗Neybecker支持博士奖学金授予了Ministere de l 'Education国家,de l 'Enseignement特级et de la矫揉造作的(MENESR)。

补充材料

补充数据1:研究的总体设计。补充数据2:生物打印过程。补充数据3:DNA化验D3(赫斯特的方法)。补充数据4:他染色分析3 d打印的替代品播种与msc(1米或2米)。补充数据5:组织学分析(阿尔新蓝)3 d-bioprinted替代品播种与msc在各条件normoxia和缺氧。补充数据5 b:免疫组织化学分析(II型胶原蛋白)的3 d-bioprinted替代品播种与msc在各条件normoxia和缺氧。补充数据5 c:组织学分析(他)3 d-bioprinted替代品播种与msc在各条件normoxia和缺氧。(补充材料)

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