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干细胞国际
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干细胞国际/2020/文章

研究论文|开放存取

卷 2020 |文章编号 2365814 | https://doi.org/10.1155/2020/2365814

子陵王蓉江王璐，Xiongbin陈，悦翔，陈晋林波，明河啸，李玲，王亚平， “人参皂苷Rg1通过GSK-3抑制人骨髓间充质干细胞的衰老而促进分化β和β连环”干细胞国际， 第一卷。2020， 文章编号2365814， 16 网页， 2020。 https://doi.org/10.1155/2020/2365814

人参皂苷Rg1通过GSK-3抑制人骨髓间充质干细胞的衰老而促进分化β和β连环

王子陵，1 蓉江，1 王璐，1 Xiongbin陈，1，2 悦翔，1 Linbo陈，1 明河肖，1 李玲，3 和 yap王1

1组织胚胎学，干细胞实验室与组织工程，重庆医科大学，重庆400016，中国的部

2解剖与组织胚胎学，基础医学院，中国传统成都中医药大学，四川610075，中国的部

3妇产科，重庆医科大学附属第二医院，重庆400010，中国的部

学术编辑：瓦莱里娅Sorrenti负责
收到 2020年3月25日
修订 2020年4月27日
公认 2020年05月08日
发表 2020年5月26日

摘要

目标。为了证明人参皂苷Rg1对人骨髓间充质干细胞（HBM-MSC的）的分化的作用。随后，对于检测皂苷Rg1的合理的机制影响间充质干细胞分化进行了探讨。方法。流式细胞术是用于小区识别。HBM-MSC分化能力的分化培养研究。SA -β的β-gal染色来检测细胞衰老的水平。Western blot和免疫荧光法来确定蛋白质表达水平。RT-qPCR的用于检测mRNA的表达水平。结果。皂苷Rg1调控HBM-MSC分化。分化培养分析表明，皂苷Rg1促进细胞对成骨软骨和。Western blot检测结果表明，皂苷Rg1调控的过度激活β-catenin信号通路，显著调节GSK-3的磷酸化β。GSK-3β抑制剂（氯化锂）显著增加GSK-3的皂苷Rg1诱导的磷酸化β，进而降低rg1诱导的hBM-MSCs的分化。结论。人参皂苷Rg1通过抑制GSK-3的磷酸化，降低衰老细胞Wnt通路的过度激活β和调节间充质干细胞的分化能力。

1.介绍

成体干细胞的衰老是发生和人体衰老的发展和老年病[最新理论1-4]。干细胞可以维持和控制正常的身体的平衡[五，6]，干细胞的老化导致身体的结构和功能，以及相关的老年性疾病的发生的退化。对于老年退行性疾病的预防和治疗，这是很有价值的研究干细胞衰老的机制和控制措施，并想方设法刺激干细胞的活性。间充质干细胞（MSC）从所述中胚层衍生并可增殖和分化成成纤维细胞，网状细胞，巨噬细胞和内皮细胞，脂肪细胞，成骨细胞和造血基质细胞[7]。先前的研究[8，9已经证明，随着年龄的增长，hBM-MSCs会表现出动态的衰老生物学变化，伴随老年性疾病的发生发展。

人参是一种补充“气”的中药。根据神农的草药典籍[10，人参可以“补肾、降子痫、明目、益脑、祛邪”，“坚持正确使用人参可延年益寿”。现代医学研究及化验分析亦显示[11-13人参皂苷Rg1是人参中重要的化学单体，对调节人的中枢神经系统、心血管系统、抗疲劳、调节物质代谢有明显作用。这个研究小组一直在结合传统中医的概念和干细胞理论和努力找到一个方法来延缓人体衰老的碰撞传统“气和血”理论和干细胞理论,使身体“健康老”,避免“过早衰老的身体”。先前的研究[14-17研究表明人参皂苷Rg1可以拮抗机体氧化损伤，通过影响细胞氧化应激机制调节神经干细胞和造血干细胞的衰老。人参皂苷Rg1能否调节人骨髓间充质干细胞的衰老?可能的机制是什么?

Wnt /β-catenin信号通路是一种重要的干细胞相关通路[18]。Wnt通路在进化过程中是保守的，在发育过程中具有广泛的生物学功能[19-21]。有报道[22-25]认为的活化水平ββ-连环蛋白信号通路是密切相关的干细胞衰老的程度。在我们以往的研究[26-28]，我们发现，干细胞衰老是由于在干细胞的生活环境的变化，是由于与在干细胞微环境的变化有关的信号传导途径的改变。其中，改变的ββ-连环蛋白信号传导途径具有与干细胞功能的变化的宽和重要的关系。最近的研究[24，29，三十]已经表明ββ-连环蛋白信号传导途径具有广泛的对造血干细胞衰老的生物效应，和造血干细胞衰老可通过的过度激活来产生ββ-连环蛋白信号通路。与此相反，抑制ββ-连环蛋白信号传导途径可以衰减的造血干细胞的衰老。所以，在人骨髓的老化间充质干具有相关的细胞（HBM-MSC的）ββ-连环蛋白信号通路？

在目前的研究中，确定Rg1对HBM-MSC分化的影响，Wnt信号的作用/ββ-连环蛋白信号传导途径进行了研究。这些研究结果可以支持促进干细胞活性和分化，以及在组织工程和临床治疗中使用皂苷Rg1。

2.材料和方法

2.1。hBM-MSCs的分离和培养

从骨髓中分离出人骨髓间充质干细胞。来自18至80岁健康捐献者的骨髓( ）收集自中国重庆医科大学第一附属医院接受骨髓穿刺的志愿者。本研究获得重庆医科大学伦理委员会批准。

该bone marrow cells were mixed with the red blood cell cracking liquid and the sedimentation (volume 5 : 1) at 4°C for 5 min. Mononuclear cells were separated from the residue by using an isolated lymphocyte separation medium. The isolated hBM-MSCs were resuspended in DMEM/F12 supplemented with 10% FBS, 1% penicillin, and 1% streptomycin. Cells were cultured at a density of 在37℃，含5% CO的湿化环境中2。大约20 ~ 25d后，细胞被培养并以90% ~ 100%融合，然后继代培养。传代细胞每7-10天携带一次。实验使用hBM-MSCs (p3-p6)的第三和第六部分。用倒置显微镜(Olympus公司，东京，日本)观察细胞的生长和形态。

2.2。流式细胞术

流式细胞术检测的HBM-MSC表面抗原标记物的表达。细胞（ 每个组中的）每一组的悬浮在含有2％BSA的PBS，荧光素异硫氰酸酯（FITC-）标记的或藻红蛋白（PE-）标记的特异性抗体的FITC-CD105，FITC-CD45，FITC-CD34，FITC-CD19，FITC-CD14, FITC HLA-DR, FITC-CD90, PE-CD73, PE-CD11b which were incubated in accordance with the specification at 4°C for 30 min in dark. The results were used Cell Quest software for data processing.

2.3。皂苷Rg1治疗方案和剂量优化

该皂苷Rg1从吉林洪生物技术有限公司购买皂苷Rg1是白色固体粉末，微溶于水，且可溶于DMSO中。因此，皂苷Rg1被配置的DMSO溶液的高浓度。该皂苷Rg1组中的细胞暴露于皂苷Rg1，和细胞对照组接收pseudotreatment（不含皂苷Rg1）。该药物的最佳浓度和时间，通过一个CCK-8方法和细胞增殖分析来确定。

2.4。EdU化验

HBM-MSC的是在24孔板中的浓度接种 和cultured in Edu solution for 24 h. 4% paraformaldehyde was fixed 30 min at room temperature. Washed cells were permeabilized 0.5% Triton X-100 for 20 min. Then, the cells were incubated with 1X Apollo® reaction cocktail for 30 min and stained using 1X Hoechst33342 for 30 min and imaged under a fluorescent microscope (Olympus Corporation). The proliferation rate was defined as the ratio of Edu-positive cells (labeled red fluorescence) to hoechst33342-positive cells (labeled blue fluorescence).

2.5。衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β- 半乳糖）染色

该SA-β-gal染色按照厂家说明进行。按上述方法制备细胞，4%多聚甲醛固定5分钟，PBS洗涤2次，保鲜膜封于染色箱，37℃染色过夜。蓝色的细胞质是衰老的细胞。倒置显微镜采集图像，使用Image-Pro Plus 6.0软件进行光密度分析。

2.6。在体外分化
2.6.1。成骨

当细胞黏附率达到50%-70%时，用ODM替换传统培养基，每3天更换ODM，培养21天。Rg1处理组在ODM介质中加入Rg1，持续21天。21 d后用4%多聚甲醛浸泡30 min, PBS洗涤3次。然后，1%茜素红S ( ）用5分钟。

2.6.2。脂肪形成

当细胞贴壁率达到100%时，用ADM代替常规培养基，每3天更换ADM培养基，培养21天。Rg1治疗组将Rg1加入ADM培养基21天。21 d后用4%多聚甲醛洗涤细胞30 min, PBS洗涤3次。然后用油红O染色60分钟。

2.6.3。软骨

When cell adherent reached 70%-80%, use CDM instead of conventional culture medium, replace CDM culture every 3 d, and cultivate for 21 d. Rg1 was added to CDM media in the Rg1 treatment group for 21 days. After 21 d, the cells were washed with 4% paraformaldehyde for 30 min and washed with PBS for 3 times. Then, dye with Alcian blue for 30 minutes.

分化培养基和染色溶液从赛业生物科学公司（中国苏州）购买。进行观察和使用倒置显微镜（奥林巴斯公司）收集的图像。

2.7。免疫荧光染色

细胞s prepared as previously described were fixed by 4% paraformaldehyde for 20 mins. After washing with 0.5% Triton X-100 for 20 min, blocking with 10% goat serum was done for 30 mins at room temperature. Then, the cells were incubated with antibodies againstβ-连环蛋白(1:100)在4℃过夜。第二天，细胞在室温下加热30分钟，洗涤3次。然后，将cy3标记的二抗(1:30 00)在37℃孵育1 h。DAPI用于核染色。所有幻灯片直接在荧光显微镜下观察(LSM510;卡尔·蔡司，德国耶拿)。抗体购自Cell Signaling Technology公司(Boston, MA, USA)。

2.8。Western印迹

用放射免疫沉淀法提取总蛋白，裂解缓冲液与1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合(Beyotime Institute of Biotechnology)，用双软骨酸法测定浓度。含40 g蛋白的样品用12%的SDS PAGE分离，转移到聚偏氟乙烯膜上。室温下用脱脂奶粉(5%溶解于TBS tween 20中)密封2小时，在4℃(一抗稀释缓冲液1:10 00稀释)中孵育过夜β连环蛋白,GSK-3β，β-actin(均来自Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA)、LEF、TCF-4和C-myc(均来自Proteintech Group, Inc.， China)二抗(1:10000 TBS-tween)室温孵育90分钟。使用增强化学发光检测系统(Pierce;美国马萨诸塞州威豪市赛默费希尔科学有限公司)，与β-actin(1:10 00稀释抗体稀释缓冲液)作为内控。集成光密度由Image Lab 5.2.1 (Bio-Rad Laboratories, Inc.， Hercules, CA, USA)进行量化。

2.9。实时定量rt - pcr

总RNA，根据制造商的协议，用Trizol试剂（Invitrogen，USA）分离。cDNA的第一链通过的TaqMan RT试剂（Applied Biosystems公司，USA）构成。SYBR Green超（Bio-Rad公司）被用于环行器实时检测系统（Bio-Rad）上执行实时定量PCR。mRNA表达水平和GAPDH进行归一化，并用于分析的比较循环阈值方法。该 测量了三个独立实验的偏差。所使用的PCR引物见相关资料(表格)1和2)。
SYBR®预混料的Taq™II（2个） 五 μ大号
PCR正向引物(10μΜ） 0.1μ大号
PCR反向引物（10 μΜ） 0.1μ大号
基因 2 μ大号
无RNase卫生署2O 2.8 μ大号
总 10 μ大号
Reaction conditions: 95°C 30 s, 95°C 5 s, 60°C 30s, circle 40 times.
表格1
β连环 向前 五 -AAGCCACAAGATTACAAGAAACGG-3
逆转 五 -CCAAGATCAGCAGTCTCATTCCAA-3
LEF 向前 五 -GAAATCATCCCAGCCAGCAA-3
逆转 五 -GGACCCATTTGACATGTACGG-3
原癌基因 向前 五 -GAGACAGATCAGCAACAACCGA-3
逆转 五 -CTGCTTGGACGGACAGGATG-3
TCF-4 向前 五 -GGAAAGAAGAAGAGGCGGTCA-3
逆转 五 -GCACTGTCATCGGAAGGAACG-3
GAPDH 向前 五 -GCTACAGCTTCACCACCACAG-3
逆转 五 -GGTCTTTACGGATGTCAACGTC-3
表2
实时定量PCR使用的引物。
2.10。统计分析

所有数据表示为 偏差。所有统计分析使用单因素方差分析进行，并使用SPSS v20.0（IBM公司，阿蒙克，NY，USA）进行Fisher最小显著差异的考验。 被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。传统的骨活检和形态测定

骨髓活组织检查是了解骨髓的一种方法。然而，对于骨髓状态活检比穿刺更详细和全面。对某些疾病,如骨髓纤维化、骨髓穿刺经常失败由于“干抽”,和骨髓活检往往是成功的。我们临床收集病人的活检标本进行赖特染色。使用形态测量软件检测各组织的含量。结果（图1)显示，随着年龄的增加，骨髓组织中造血组织和骨小梁组织的比例降低，脂肪组织的比例增加。


图1
传统的骨活检和形态。骨髓活检从不同年龄的患者（标本 ）共收集瑞氏染色。使用形态软件的每个组织的量进行了调查。柱状图显示了形态测量的结果。的（a）<25岁组;（b）中25-35岁组;（C）35-45岁年龄组;（d）45-55岁年龄组;（E）55-65岁年龄组;和（f）> 65岁的组。
3.2。HBM-MSCs的识别

细胞形态，多向分化潜能，以及表面标记物将是确定所述干细胞的关键。因此，实验是在方法，以确保细胞的有效性。的细胞培养物显示了细胞通常细长的并且纺锤形，其增长是螺钉生长的特性的结果（图2 (b))。Adipogenic differentiation medium-induced hBMSC adipogenesis for 21 d, the result, is shown in Figure2 (c)。第21天软骨形成诱导，hBMSCs的Alcan蓝染色如图2 (c)。在图2(一个)，在这里，是的hBMSCs的细胞表型的字符，这表明细胞的流式细胞术图案CD73 +，CD90 +，CD45-，CD34-，CD14-，和HLA-DR-。鉴定的细胞的所有三个分析显示这些细胞，其已被纯化和培养是人间充质干细胞[23，31]。

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图2
人骨髓鉴定充质干细胞。细胞通过下述表面标志物，细胞形态和分化的能力来鉴定。的（a）将细胞用荧光素染色异硫氰酸酯（FITC-）或PE缀合的抗体或具有免疫球蛋白同种型对照抗体。（b）中该morphology was observed using phase-contrast microscopy at different phases (24 h (b-A), 3 d (b-B), 14 d (b-C), and subcultured hBM-MSCs (P3) (b-D), 100x). (c) The differentiation of hBM-MSCs, using induction medium inducing cells to chondrogenesis (c-A), lipoblast (c-B), and osteogenesis (c-C). Afterward, the special staining was used to detect the differentiation.
3.3。皂苷Rg1的最佳剂量和确定曝光时间

为了筛选Rg1对hBM-MSCs的最佳剂量和暴露时间，我们进行了CCK-8实验。总体而言，Rg1组的OD均值高于对照组(>65岁组)(图)3)。该cell viability increased significantly in the Rg1 groups treated for 24 h ( ）作为皂苷Rg1浓度增加。然而，有明显的增加两组间无显著差异（ )。At 48 h, cells treated with 40 μ中号皂苷Rg1有一个比其他组的显著更高存活率，而那些具有较高浓度处理没有实质性改变。

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图3
Rg1对人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)生长的影响。Rg1组分别用不同浓度、不同时间的Rg1处理。(a, b)不同浓度Rg1处理衰老间充质干细胞后的细胞增殖。此试验重复三次。展示了代表性的图像。(c)采用细胞计数Kit-8 (CCK-8)法测定hBM-MSCs的生长曲线。 ， 。

随后，HBM-MSC扩散在不同组中，研究了埃杜，结果表明，HBM-MSCs的增殖当与皂苷Rg1 40处理显著增加 μ我在48小时。

3.4。细胞形态和衰老皂苷Rg1的影响

骨髓培养的平均值为 每个组。After 72 h, 60%-70% of hBM-MSCs were observed to adhere to the culture dish, and some spindle cells were observed (Figure图4（b）)。10-12 d later, hBM-MSCs were 90% to 100% fused. The cells in passage culture also retained the shape of fibroblasts (Figure图4（c）)。Rg1处理后细胞形态无明显变化。

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图4
Rg1对hBM-MSCs衰老及形态的影响。在(a) 24 h和(b) 72 h观察细胞形态，(c)分离后培养至第三代。SA -β半乳糖苷酶被用来标志衰老细胞阳性细胞的细胞质中被染成蓝色，（d）<25岁，（E）> 65岁，和（f）> 65 +皂苷Rg1。此试验重复三次。展示了代表性的图像。杆值被用来评价SA-的强度β-gal阳性染色(g)， Western blot检测P53和P16蛋白表达(h)。β-Actin作为内部对照。 和> 65岁组, vs < 25岁组。SA -β半乳糖苷酶：衰老相关β牛乳糖;杆:相对光密度。

用SA-染色法将衰老的间充质干细胞染成蓝色β半乳糖苷酶染色[32)(图图4（d）-4（F））。结果表明，SA-的阳性率β衰老组hBM-MSCs的-Gal染色明显增加(图)图4（e）)。随着皂苷Rg1治疗，阳性率SA-βHBM-MSC的-Gal染色减少（图图4（f）)。这一结果表明，皂苷能延缓HBM-MSC的老化。在老化过程中的P53和P16蛋白的表达会增加[33]。结果（图4（H）)显示Rg1可以降低P53和P16蛋白的表达。

3.5。在HBM间充质干细胞分化能力皂苷Rg1对

与间充质干细胞在一定条件下，可以分为多种功能细胞。研究[34-38]报道，间充质干细胞具有分化成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞的能力。这种能力的强度与干细胞的“能力”。结果表明，成骨诱导培养后，皂苷Rg1治疗> 65岁的间充质干细胞的茜素红染料染色后增加的暗红色结节（图五（成骨）），脂肪诱导的培养，皂苷Rg1治疗> 65岁的间质干细胞，和油红O与红色的脂质材料减少染色（图五(脂肪形成))。在软骨诱导培养中，Rg1治疗>65岁间充质干细胞后，Alcian blue染色的蓝色软骨组织增加(图)五（软骨））。上述结果表明，皂苷Rg1可以提高充质干细胞在> 65岁基团，其可以减少脂肪形成分化能力的成骨和软骨形成分化能力。


图5
人骨髓间充质干细胞（HBM-MSC的）的分化潜能。After 21 d of culture in osteogenic (a–c), or adipogenic (d–f), or chondrogenic (g–i) differentiation medium, the osteogenic, adipogenic, or chondrogenic differentiation of hBM-MSCs was assessed by specific staining. This test was repeated three times. Representative images were shown. Images were taken at 100x magnification. (a, d, and g) the <25-year-old group, (b, e, and h) the >65-year-old group, and (c, f, i) the >65-year-old+Rg1 group.
3.6。Rg1减少Wnt /β-Catenin通路在老年间充质干细胞中的激活

作为一种多功能蛋白，β-catenin广泛分布于各种类型的细胞中[39-41]和在细胞分化中起重要作用[39，42，43]。进行Western blot和免疫荧光来监测Wnt信号的关键蛋白/ββ-连环蛋白信号通路。结果发现，皂苷Rg1（40 μM, 48小时)显著减少ββ-连环蛋白，C-MYC，LEF和治疗衰老间充质干细胞的TCF后-4水平（图图6（d），6（e）中， 6(g)和6(h))。GSK-3β水平显著增加(图图6（F）)。结果表明，皂苷Rg1降低的激活β联蛋白途径在老化HBM-MSC的。

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图6
Rg1对Wnt/表达的影响βhBM-MSCs中-catenin信号通路相关蛋白和mRNA(a-c)免疫荧光法，PI(红色)细胞定位β-连环蛋白，DAPI(蓝色)来观察细胞核。(a) <25岁组，(b) >65岁组，(c) >65岁+Rg1组。此试验重复三次。展示了代表性的图像。(d)蛋白表达分析β用Western blot连环蛋白。β-Actin作为内部对照。（E，I）信令的mRNA的分析途径相关的通过RT-PCR的mRNA;GAPDH的mRNA的表达作为内部对照。（F）的GSK-3的表达β蛋白Western blot检测。（G，H）LEF / TCF和在不同的组中C-myc蛋白质的相对蛋白质表达，并β-Actin作为内部对照。 主场迎战> 65岁组， 与<25岁组相比。
3.7。Rg1调节hBM-MSC分化，并与Wnt/相关β联蛋白途径

确定Rg1对衰老hBM-MSCs分化的影响是否依赖于Wnt/β-catenin信号通路，hBM-MSCs用通路激活剂Licl (20 mM)预处理。的水平β联蛋白显著增加，GSK-3β用LiCl预处理后显著减少，表明有效的LiCl激活的Wnt /βhBM-MSCs中的-catenin通路。

细胞分化是通过感应分化试剂盒评估。该皂苷Rg1治疗组中的成骨细胞和软骨细胞分化的能力比在Licl-（皂苷Rg1 +活化剂）处理组和对照组显著更高（图图7（a）和图7（b）)。结果表明，氯化锂预处理后，所述的表达β联蛋白，TCF，LEF，和c-Myc增加，而GSK-3的表达β降低了。Rg1治疗后,β-catenin蛋白、TCF、LEF和C-myc下降，GSK-3下降β表达增加(图图7（c）-7（F））。

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图7
Rg1调节与GSK-3相关的老年间充质干细胞(hBM-MSCs)分化β蛋白。通过在氯化锂（A，B）的存在或不存在分化培养法检测细胞分化的能力。此试验重复三次。展示了代表性的图像。β连环蛋白,GSK-3βWestern blot (Western blot, c-f)分析C-myc、TCF和LEF。 。

4。讨论

骨髓纤维化（MF）被称为髓磷脂。它是一种在骨髓造血组织引起的胶原增生骨髓增生性疾病，它的纤维组织严重地影响造血功能。发病年龄为50年和70岁之间。有学者认为骨髓纤维化是由造血干细胞的异常刺激引起的，导致纤维组织增生，甚至新骨形成和骨髓造血组织受累最终导致造血功能衰竭。

在骨髓穿刺过程中，人们发现，患者年龄越大，“干抽”的可能性就越大。骨髓活检结果统计显示，随着年龄的增长，造血组织和骨小梁的人骨髓的比例下降，而脂肪组织的比例增加。

在这项研究中，HBM-的MSC已成功地从人骨髓中分离。将培养的HBM-MSC的显示成纤维细胞形态。先前的实验[44]已经表明，下述表面标志物的那些相似的间充质干细胞的，表达典型的间充质标记物（CD73，CD90）。细胞表面抗原的表达与HBM-MSCs的先前报道的数据一致。HBM-可分化为成骨细胞，脂肪细胞，并在体外软骨细胞。这些结果表明，分离的细胞被鉴定为HBM-MSC的与多能干细胞的共同特征。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是一种属于中胚层的多能干细胞[45]。间充质干细胞的分化方向是很重要的[45-50]。因此，对研究方法的重大意义，以调节间充质干细胞的分化。中国传统医学是几千年的中国文化和文明的传承。它被认为是具有中国特色的生命科学。中国传统医药理论[24]认为，干细胞属于人体的“基本气”。具体而言，胚胎干细胞属于“先天气”，而成人干细胞属于“后天之气”。“气”的局面是与整体身体素质。人参是中国传统医学临床实践“补气”的必备良药。为P.人参的主要活性成分，皂苷Rg1起着在治疗或各种疾病的辅助治疗[重要作用51-54]。补气能激活干细胞功能吗?能不能通过使干细胞“气”足来延缓身体衰老?这些问题都值得深入探讨。

我们的研究发现rg1抑制Wnt/β联蛋白信号途径调节HBM-MSC分化。Wnt /ββ-连环蛋白信号传导途径是经典途径通过调节的定位来调节干细胞的功能β联蛋白，从而调节下游蛋白质和基因的表达[19，20，55]。GSK-3β复合物的重要部分是否在降解βWnt/中的-连环蛋白β-catenin信号通路[55]。在不存在Wnt信号传导的，β-连环蛋白与轴蛋白、APC(腺瘤性息肉病大肠杆菌)、GSK3形成多蛋白复合物β,对照α。然后，β联蛋白是由激酶在这个复杂磷酸化，并且通过降低E3泛素连接酶。TCF-4和LEF是重要的结合位点β-连环蛋白进入细胞核后。C-myc和Cyclin D1基因是Wnt/重要的靶基因ββ-连环蛋白信号通路。Wnt信号的过度激活/β趋向于-catenin信号通路β-连环蛋白聚集在一起进入细胞核。Wnt信号的过度激活/ββ-连环蛋白信号传导途径增加了生产的β-连环蛋白通过降解APC和GSK-3的复合物β。作为β连环蛋白在细胞质中增加时，将转移至细胞核并与家族成员的复合物，如转录因子TCF / LEF [56-58]。通过调节靶基因如c-Myc和细胞周期蛋白D1的表达，干细胞的生理功能是调节[20]。

在这项研究中，皂苷Rg1延缓间充质干细胞的衰老机理进行了进一步研究。作为GSK-3的抑制剂β， Licl可以激活Wnt/β-catenin信号通路，加重间充质干细胞的衰老。Licl组加入人参皂苷Rg1后，可以看出Rg1+Licl形成骨结节和软骨结节的能力较Licl组增强。研究表明，Rg1可以调节licl诱导的分化能力下降。Western blot显示βRg1+Licl组-catenin、TCF、C-myc、LEF降低，GSK-3表达下降β增加了。这些结果表明人参皂苷Rg1可干扰Wnt/的激活ββ-连环蛋白信号传导途径和延迟HBM-MSCs的衰老。

然而，Rg1调节Wnt/的确切机制β-catenin信号通路尚不清楚。有报道[59]该皂苷Rg1可拮抗氧化应激损伤并减少细胞中各种氧化因子的释放，包括丙二醛（MDA）和反应性氧物质（ROS）。先前的研究[60，61]已经表明，皂苷Rg1还具有在细胞和小鼠中的抗炎效果和减少的表达和在细胞释放各种炎症因子，包括白细胞介素-1（IL-1），白细胞介素-6（IL-6），和肿瘤坏死因子α（TNF-αα)。周某等人。[62发现活性氧的生成和NF-的激活κ转录因子,导致诱导Wnt配体如Wnt1 Wnt7a和激活β连环蛋白。结果表明，氧化应激是Wnt/的上游调节因子β-连环蛋白，一种发育信号通常在正常成人肾脏中是沉默的。Bi等[63]发现皂苷Rg1可下调细胞因子 - 细胞因子受体相互作用，包括RELT，TNFRSF8，TNFRSF6B，和EDA2R，其能够结合肿瘤坏死因子受体相关因子1或与Fas配体TNFSF6结合诱导细胞死亡中表达该细胞受体分子。ββ-连环蛋白和GSK-3β在这些过程中扮演规管的角色[63]。因此，我们推测，两种可能的机制可能是负责本研究中的皂苷Rg1调节Wnt信号通路。其中之一是，皂苷Rg1可以减少导致Wnt信号传导途径的调节氧化因子的表达和释放。另一种是，通过皂苷Rg1的基因降级可以调节GSK-3的磷酸化β和β连环蛋白。不过，这种猜测还需要进一步研究。

总之，皂苷Rg1能调节HBM-MSC分化和Wnt信号/β-catenin信号通路可能参与了这一过程。本研究结果为Rg1在MSCs辅助治疗中的应用提供了重要的实验依据。

数据可用性

数据共享不适用于本文，因为在本研究中没有创建或分析新的数据。

利益冲突

所有的作者宣称没有竞争的利益。

作者的贡献

概念是由亚平王完成。数据收藏被子陵王，明河晓和李灵进行。收购资金由亚平王收购。方法是通过融江，鹿王，林波陈和陈Xiongbin执行。项目管理是由子陵王和悦翔执行。编写原草案是由王子陵完成。

致谢

本研究由国家自然科学基金(No. 81673748)资助。

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