鹿茸间充质的外来体干细胞改善术后认知功能障碍的体外循环大鼠通过抑制TLR2 / TLR4信号转导通路

摘要

术后认知功能障碍（POCD）是体外循环（CPB）的严重并发症，并具有如急性认知功能障碍，记忆障碍，注意力不集中共同的特征。间充质干细胞（MSC）是通过分泌生长因子和细胞因子具有治疗潜力主要通过旁分泌作用多能细胞。外来体是重要的旁分泌的因素之一，并已报告为自身免疫性疾病和中枢神经系统疾病的治疗潜力无细胞疗法。在这项研究中，我们研究了CPB后从认知功能障碍大鼠的鹿茸的MSC（分化AMSC）衍生的外来体和评估其潜在的监管机制。AMSC衍生的外来体降低的神经损伤和脑损伤和防止细胞凋亡的CPB大鼠。此外，发现AMSC衍生的外来体以减少海马神经元细胞凋亡和TLR2，TLR4，MyD88的，和NF-的表达κ的B CPB大鼠。然而，AMSC衍生的外来体上CPB大鼠上述效果被部分阻断toll样受体2/4（TLR2 / TLR4）激动剂（LPS-EB）。总之，AMSC衍生的外来体可以通过抑制TLR2 / TLR4信号传导途径改善CPB大鼠认知功能。

1.简介

死亡率的造成患者术后中央后神经系统体外循环（CNS）并发症的增加（CPB）手术[1,2]。POCD是CPB的严重并发症，其特征在于急性认知功能障碍，记忆障碍，注意力不集中[3.,4]。它的发病术后临床过程中出现系统性和海马炎症[5,6]。虽然POCD与心脏手术的相关性已被确认，但其潜在机制尚不清楚，迫切需要有效的预防和治疗方法。

Toll样受体（TLR）是一组高度保守的I型跨膜蛋白，其可激活信号转导途径，诱导炎症反应，并促进抗原呈递细胞的活化[的7]。TLR2/TLR4信号通路在中枢神经系统的各种炎症疾病中起着至关重要的作用。研究发现，脑出血后损伤组织释放的内源性激活物质可以被TLR4识别;然后,NF -κ乙被激活和促炎细胞因子释放，最终导致组织损伤〔8]。此外，在TLR2缺血脑组织和损伤相关的小胶质细胞中被上调，而脑缺血损伤在TLR2显著降低敲除小鼠[9]。

间充质干细胞是多能细胞，可以产生不同的细胞类型，形成不同的组织，如骨、皮肤和软骨[10- - - - - -14]。间充质干也有转化医学的领域，如组织修复和再生广阔的应用前景，但其作用机制仍是[不清楚15]。最近的研究表明，MSCs的治疗功能主要依赖于旁分泌作用，而不是自身在部位的增殖分化[16,17]。外来体是已被确定，并通过越来越多的实验已经证明在MSCs的各种功能中发挥关键作用的重要旁分泌的因素之一。外来体是其中的特性与它们的亲代细胞[用于交换蜂窝信息重要载体18,19]。最近的研究表明，外泌体可以保护中枢神经系统免受神经炎症作用[20.]。MSC衍生的外来体可潜在地用作无细胞的疗法用于致耐受性免疫应答以治疗自身免疫疾病和CNS疾病[21]。重要的是，经鼻给药的外泌体被迅速运输到小鼠的大脑并被小胶质细胞吸收。与对照组相比，活化的炎性小胶质细胞数量显著减少[20.]。

鹿茸是一个男性第二性附属物其恒定的生长依赖于季节变化在整个生命[22,23]。已知的是，鹿角的快速增长主要是通过驻留在储备间质细胞的增殖实现[24]。从储备间充质细胞中分离、培养出的细胞已被几个实验室部分鉴定为一种间充质干细胞[25,26]。根据以往的研究，鹿角具有多种生物活性，包括抗炎、组织愈合、抗肿瘤、抗氧化等[27- - - - - -29]。我们的理由是，从鹿角隔离可能有相似的有益功能的MSC。这项研究评估在体外循环治疗后大鼠术后认知功能障碍，从公布的AMSC外来体的作用。

综上所述，本研究阐述了amsc来源的外泌体对POCD大鼠的保护作用及其机制，为CPB后POCD患者的治疗提供理论和实验依据。

2.材料和方法

2.1。鹿茸间充质干细胞的分离

由当地动物伦理委员会，并根据该研究所动物护理批准的协议批准的条件下，获得新鲜梅花鹿鹿角。鹿角从麻醉三十岁梅花鹿雄鹿在春末收集。间质是由使用消毒手术器械采取组织切片中获得的鹿角尖端的一部分。该obtained samples were digested with 0.075% collagenase type II (Sigma-Aldrich, USA) under gentle agitation for 45 min at 37°C and then centrifuged at 300× g for 10 min to obtain a stromal cell fraction. The pellets were filtered through a 70 mm nylon mesh and resuspended in PBS. The solution was layered onto histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, USA) and centrifuged at 840× g for 10 min. The supernatant was discarded, and cell fraction was cultured overnight at 37°C, in Gibco Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/ml of penicillin, and 100 mg/ml of streptomycin. AMSCs from passages 3-5 were used for further research.

2.2。分离和纯化AMSC衍生的外来体

在DMEM/F12中添加10%无外泌体FBS培养AMSCs。48小时后，按照Thery等人的方案，采用超离心法从AMSC上清中分离出外泌体[三十]。After ultracentrifuging at 120,000× g for 1.5 h, the exosomes were carefully resuspended in PBS and used immediately or stored at -80°C. The characteristic surface marker proteins (CD9, CD63, and Calnexin) of exosomes were analyzed by Western blot. The morphologies of exosomes were observed with a transmission electron microscope (TEM) as previously described. Flow Nano Analyzer model type N30 (Nano FCM Inc., Xiamen, China) that allows single exosome detection was used to determine the size distribution and granular concentration of AMSC-derived exosomes [31]。

2.3。透射电子显微镜

外来体装载到由formvar覆层网格和用中性1％水溶液磷钨酸溶液负染色。Electron microscopic images were captured and analyzed by a transmission electron microscope (TEM, HT7700, 80 kV, Hitachi, Tokyo, Japan).

2.4。实验动物及分组

雄性SPF级SD大鼠40只，体重350-450 g，由中国医科大学实验动物系提供(啮齿动物使用许可证:SYXK 20180008;鼠类生产许可证:SCXK 20180004)。本实验经中国医科大学实验动物伦理委员会批准(批准文号CMU2018170)。

将大鼠随机分为四组：假手术组（Sham组），CPB手术组（CPB组），外来体+ CPB组（EXO组），和外来体+ CPB组+ TLR2 / TLR4激动剂组（TLR组）与每组10只动物英寸除假手术组，由CPB方法使用POCD模型制备所有其它基团。In the EXO group, the extracted AMSC-derived exosomes were administered 2.1 mg/kg peritoneal cavity 30 min before flow. In the TLR group, 2.5 mg/kg of TLR2/TLR4 agonist (LPS-EB) was injected into the tail vein 30 min before flow. After obtaining the data of water maze test, the rats were anesthetized and placed in a tube, 5 ml of blood was taken through the right internal vein, and the serum was separated by centrifugation and stored at -80°C. The bilateral hippocampus was taken immediately, and a part of the sample was stored in -80°C, while the other in formalin.

2.5。准备CPB模型

术前禁食6小时，腹腔注射钠(30mg /kg)麻醉。翻正反射消失后，将大鼠绑在手术台上，气管插管。连接小动物呼吸机，连续监测心电图、血氧饱和度和体温。左股动脉被放置在导管中，并连接到一个动脉工具包来实时测量动脉压力。将左股静脉置入针内，持续泵入胶体。将尾动脉置入针管中，注入CPB准备使用。然后，引流右侧颈内静脉。配制循环预充液15ml，其中羟乙基淀粉6ml，肝素1ml(含量250iu /kg)， 5%碳酸氢钠1ml, 20%甘露醇1ml，速尿1ml。加入6毫升预充液体连接和固定每根管道。在CPB过程中，实时调节流速，使血库中的血容量维持在1 ~ 2ml。 The flow rate of extracorporeal circulation was not less than 80 ml/kg/min. After 1 h of the CPB process, mechanical ventilation was resumed. The hematocrit (Hct) reached above 0.25, the flow rate was gradually decreased, and the machine was stopped. The tubes in the heart were removed one at a time and mechanical ventilation was continued. The remaining blood was slowly infused in the reservoir, and the tracheal intubation was withdrawn after the rats resumed spontaneous breathing.

2.6。水迷宫

24 h after CPB, the water maze test was performed for 7 days, including hidden platform test and space exploration test. In the hidden platform test, the rats were placed from any quadrant into the water facing the pool wall and had to swim for 90 s to find the hidden platform. The time to find the hidden platform is the period for escaping the incubation. If the rats were unable to find the platform within 90 s, they were directed to the platform with a recording score of 90 s. The experiment was conducted for 5 days, and the first 4 days was used as acquired training. The score of 90 s was eliminated, and the test scores on day 5 were used as the spatial learning memory scores. In space exploration testing, after 24 h of the hidden platform test, the platform was removed. The rats were placed inside the water at the same water inlet point, and the swimming path of the rats was recorded within 60 s. Furthermore, the swimming distance and residence time of the target quadrant and the number of crossings of the original station were recorded. The moving trajectories of the rats were recorded, and the information processing was performed using the Morris water-maze video analysis system.

2.7。对于神经功能评分分数

体外循环心脏搭桥1天、3天、7天后，采用Garcia评分量表对实验动物神经功能进行测量(表)1)。

2.8。H＆E染色

固定在福尔马林中的组织样本置于浓度为70%、80%、90%、95%和100%的酒精中。二甲苯是透明的，浸在蜡块中。然后，蜡块被切成4μ用切片机米部分，然后脱蜡。该sections were stained with hematoxylin for 5 min, washed with PBS, and differentiated with 1% hydrochloric acid alcohol and eosin dye solution for 30 s. After the gradient alcohol dehydration, transparent treatment, and neutral gum seal, the pathological changes in each group were observed under light microscopy.

2.9。TUNEL染色

该原位细胞死亡检测试剂盒（Roche Diagnostics公司，曼海姆，德国）根据制造商的说明书使用。简单地说，5 μ石蜡包埋的组织海马区摩尔/升切片脱蜡，透化，并封闭。切片用50处理 μl TUNEL reaction solution and incubated in a humid dark box at 37°C for 60 min. Subsequently, 50 μ将链霉亲和素- hrp工作液的l加入切片中，再次在盒式磁带中孵育30分钟。荧光染色使用DAPI染色核，然后常规脱水、脱色和固定。切片用显微镜检查，并拍摄图像。对每一张捕获的图像，计数细胞核总数和tunel阳性细胞核，计算凋亡比例。

2.10。ELISA测试

炎症因子IL-1β（CSB-E08055r，CUSABIO，中国），IL-6（SEA079Ra，USCN，中国），TNF-αα（SEA133Si，USCN，中国），IL-10（SEA056Ra，USCN，中国），氧化应激指数SOD（SES134Hu，USCN，中国），MDA（CEA597Ge，USCN，中国），GSH（CEA294Ge，USCN，中国），NO（IS100，USCN，中国），及脑损伤标志物S100-β使用不同的ELISA试剂盒检测大鼠血清(SEA567Ra, USCN，中国)和NSE (SEA537 Ra, USCN，中国)，操作步骤按说明书操作。

2.11。免疫荧光法

After dewaxing, the wax pieces of hippocampal tissue were immersed in a 3% hydrogen peroxide solution for 15 min, washed with PBS three times, and subjected to antigen retrieval by a 0.1 M sodium citrate solution. It was blocked in goat serum and incubated at 37°C for 30 min. Then, the wax pieces of hippocampal tissue were incubated with primary antibodies (anti-TLR2, Abcam, ab16894; anti-TLR4, Abcam, ab22048; anti-MyD88, Abcam, ab28763; and anti-NF-κB Abcam ab16502;(英国剑桥)4℃过夜，PBS洗涤三次，37℃与相应的荧光标记二抗孵育30分钟，然后PBS洗涤三次。最后用DAPI染色，室温孵育10 min, PBS洗涤3次，中性树脂密封，荧光显微镜下观察。

2.12。Western印迹

外泌体和海马匀浆后，加入预冷的RIPA (Thermo, 89900, USA)裂解液，在冰上裂解30分钟。收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo, 23225, USA)测定浓度。简单地说,40μ用SDS-PAGE将上清中的g蛋白分离并转移到PVDF膜上。外泌体组织中加入CD9 (Abcam, ab92726, UK)、CD63 (Abcam, ab59479，)和Calnexin (Abcam, ab22595，)一抗以及TLR2、TLR4、MyD88和NF-κ乙加入到海马。BCL 2（Abcam公司，ab59348），Bax蛋白（Abcam公司，ab32503），亲胱天蛋白酶-3（Abcam公司，ab32150）和裂解的caspase-3（Abcam公司，ab49822）初级抗体加入到PVDF膜，并在4孵育过夜°C。After washing with PBS, secondary antibodies were added and incubated at room temperature for 2 h. The ECL luminescence kit (Thermo Scientific, USA) was used to develop the color. Images were obtained by the Azure c600 Western Blot Imaging System (Azure, USA), and the gray values were read by Quantity One software.

2.13。PCR

用Trizol (Invitrogen, 15596026, USA)制备冷冻脑组织裂解液。按照Trizol试剂操作说明书提取组织和细胞的总RNA。通过逆转录合成第一链cDNA (Thermo, K1622, USA)后，TLR2、TLR4、MyD88和NF-κB反应采用qRT-PCR (Qiagen, 204057, Germany)检测。引物序列见表2,which were synthesized by Shanghai Shenggong Biological Co., Ltd. The reaction conditions were predenaturation: 95°C for 30 s; PCR reaction: 95°C for 5 s and 60°C for 20 s, 40 cycles; and melting curve analysis: 95°C for 1 s, 65°C for 15 s, and 95°C for 5 s. After the reaction was completed, the amplification curve and the melting curve were confirmed.

2.14。统计分析

使用SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA)软件对结果进行分析。测量数据表示为 ( )。该 -被用于两个组间比较试验，差异具有统计学显著时 。

3.结果

3.1。收集的外来体的形态和表型鉴定

分化AMSC使用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液传代培养在体外。正常条件下培养3天后，发现间充质干细胞呈梭形、三角形或多边形，细胞质透明(图)1(一))。融合细胞呈单层排列(图)1 (b)）后7天培养和融合。在5^日细胞分布均匀，排列紧密，呈梭形或三角形。后5^日代，某些细胞的形态改变，包括平坦化细胞，细胞过程的加速，和细胞的不一致性（图图1（c）)。外泌体的范围和大小通过N30型流动纳米分析仪(Nano FCM Inc.，厦门，中国)进行测量。结果表明，颗粒的直径在50-160 nm范围内，平均为72.6 nm(图)1（d）)。外来体的形态通过透射电镜（TEM）直接观察到。该particles were observed as round-shaped vesicles with a bilayer membrane structure and with a diameter of approximately 50-100 nm (Figure1（e）中)。Western blot检测外泌体蛋白标志物CD9、CD63和Calnexin(图)1 (f))。以上结果表明，外泌体已成功地从AMSCs中分离出来。

3.2。amsc来源的外泌体减轻了CPB大鼠的神经损伤

CPB可导致由代表POCD神经和精神障碍。CPB大鼠用AMSC衍生的外来体注入，并且没有观察到神经功能评分和空间学习和记忆能力的变化。在CPB组的神经功能评分 ,这比假手术组的分别显著降低（ )(图图2（a）)。外来体的给药后，神经功能评分提高至 与CPB组比较( )。采用隐平台训练和空间探索实验对大鼠进行认知功能测试。在图图2（b），相对于假手术组，对于CPB小组在寻找平台潜伏期明显延长（ )。与CPB组相比，EXO组中的等待时间周期是短显著（ )。所述TLR组中的潜伏期是类似于CPB组（ )。在空间探索实验（图2 (c)），目标象限的游泳距离和停留时间的CPB组中显著减少了与假手术组比较（ )。在EXO组大鼠的游泳距离和停留时间均显著长于那些CPB组（ )。此外，游泳距离和停留时间被视为通过TLR2 / 4信号激动剂干预（以改善 )。以上结果提示amsc来源的外泌体可以减轻CPB大鼠的神经损伤。

3.3。amsc来源的外泌体可防止CPB大鼠的脑损伤

通过H＆E染色观察脑组织的组织病理学变化。如图3(一个)被发现CPB大鼠海马被严重破坏，分散的细胞和细胞间隙逐渐扩大。此外，细胞和血管组织的增生增加和组织的结构和安排均紊乱。与CPB组相比，EXO组中，将细胞整齐排列和小区频带是不完整的。所述TLR组的损坏条件是CPB组中相似。将细胞稀疏地分布，并且细胞质空泡逐渐增加。H＆E染色显示CPB大鼠海马组织受到严重破坏，而美国超导公司衍生外来体的干预可以预防海马组织损伤。此外，TLR2 / TLR4激动剂部分逆转AMSC衍生的外来体对大鼠CPB CPB-引起的脑损伤的防止效果。为了验证在CPB大鼠海马损伤的程度，用ELISA法检测脑损伤的标记物（图3 (b))。结果表明，血清中NSE和S100-均呈阳性βCPB组的浓度显著增加(与sham相比， )。该EXO组中的标记物比那些CPB组中显著降低（ )而TLR组与CPB组相似( )。这些结果表明，AMSC衍生外来体可以防止在CPB大鼠脑损伤。

3.4。AMSC衍生外来体抑制的炎症和氧化应激的大鼠CPB

炎症因子和大鼠血清中的氧化应激因子ELISA法检测。结果示于图4。与假手术组比较，IL-1的浓度βIL-6和TNF-α而IL-10在CPB组中显著降低( ),表明CPB可导致增加的炎症反应。在EXO组，IL-1的浓度βIL-6和TNF-α均显著减少，IL-10增加显著（相对于CPB， )(图图4（a）)。这些结果表明，AMSC衍生外来体可有效抑制CPB大鼠炎症反应。类似地，CPB组中的超氧化物歧化酶和NO水平较假手术组显著降低，而MDA含量已显著增加（ )。在EXO组中，SOD和NO水平均较CPB组显著更高，MDA含量已降低显著（ )(图图4（b）)。这些结果表明，AMSC衍生的外来体可以抑制CPB大鼠氧化应激反应。

3.5。amsc来源的外泌体可防止CPB大鼠神经元凋亡

术后认知功能障碍可引起脑组织神经元凋亡。在脑组织细胞凋亡用TUNEL（图检测图5（a）），和细胞凋亡相关蛋白的表达，用Western blot法检测（图图5（b）)。TUNEL结果表明，CPB组中的阳性细胞的数量增加显著（相对于假手术， )。此外，EXO组在海马的阳性细胞明显高于那些CPB组显著降低（ ),而TLR组阳性细胞数量较EXO组明显增加( )。这些结果表明，AMSC衍生的外来体具有对CPB大鼠神经细胞凋亡的保护作用。类似地，如示于图图5（b），Bcl-2的表达观察到的CPB组中显著减少和在Bax的显著增加（相对于假手术，p < 0.05). The expression of Bcl-2 in the EXO group had significantly increased, while in Bax significantly decreased (vs. CPB, )。然而，Bcl-2表达被发现的TLR组显著降低，在Bax的显著增加（相对于EXO， )。此外，CPB组的pro-caspase-3表达明显下降，而cleaved caspase-3表达明显升高(与sham相比， )。亲胱天蛋白酶-3表达的EXO组显著增加，而裂解的caspase-3的表达降低显著（相对于CPB， )。相较于EXO基，亲胱天蛋白酶-3的TLR组中的表达显著下降，而裂解的caspase-3级显著增加（ )。这些结果表明，AMSC衍生外来体可以抑制神经细胞凋亡，并防止神经元变性CPB大鼠。

3.6。经由TLR2 / TLR4信号转导通路AMSC衍生外来体改进CPB诱导POCD大鼠

toll样受体在CPB大鼠的炎症和免疫反应中发挥重要作用。因此，TLR2, TLR4, MyD88和NF-的水平κWestern blot、qRT-PCR、免疫荧光检测大鼠海马区B。如图所示6(一)和6 (b)，TLR2，TLR4，MyD88的，和NF-的mRNA和蛋白表达κB中的CPB组较假手术组（ )。与CPB组比较，TLR2、TLR4、MyD88和NF-的水平κEXO组B水平明显降低( ),这表明AMSC衍生的外来体可以逆转TLR2 / TLR4表达在CPB大鼠信号传导途径有关的蛋白。同时，TLR2 / TLR4信号传导途径的活化后，外来体不能降低IL-1β、il - 6、TNF -α和MAD级别，而且可以不增加IL-10，SOD和NO的（水平图图4（a）和图4（b）)。此外，这些结果通过免疫荧光证实（图6 (c))。可以看出的是AMSC衍生的外来体可以在CPB大鼠通过TLR2 / TLR4信号传导途径减轻POCD。

4。讨论

我们的研究表明，amsc来源的外泌体对体外循环后的大鼠具有神经保护作用。体内，我们发现腹膜内给予amsc来源的外泌体可以减少炎症反应和氧化应激，防止神经元凋亡和脑损伤，从而阻碍CPB大鼠POCD的发展。

体外循环技术在临床实践中的应用越来越广泛，POCD已成为CPB手术的严重并发症[32]。这一问题直接关系到外科治疗的成败，严重困扰着心脏外科的发展。POCD的症状与神经炎症密切相关，与阿尔茨海默病(AD)相似[33]。鹿茸生长过程中，间充质细胞的增殖决定了鹿茸的生长速度[24]。间充质细胞被认为是天鹅绒生长的主要细胞来源，在天鹅绒生长过程中可分化为成纤维细胞、软骨细胞和骨细胞[25,26]。除了骨髓间充质干细胞的多能分化潜能外，一些骨髓间充质干细胞旁分泌因子已被发现通过调节细胞局部反应作用于细胞迁移、抗氧化、抗凋亡、血管生成和免疫调节。msc来源的外泌体在神经炎症、神经源性龛和神经发生以及神经疾病的治疗策略中发挥重要作用。在我们的研究中，成功地分离和鉴定了AMSCs及其外泌体(图)1(一)- - - - - -1 (f))。建立CPB大鼠的认知功能障碍模型来研究AMSC衍生外来体的保护作用。神经功能评分和水迷宫试验中对大鼠进行，以确认AMSC衍生的外来体相比，CPB组（图显著增加神经功能评分，游泳距离，以及停留时间和具有较短的等待时间段图2（a）- - - - - -2 (c))。神经元特异性烯醇化酶（NSE）和S100钙结合蛋白B（S100-β）被认为是中枢神经系统损伤的特异性和灵敏性的生化标志物[34]。如图3(一个)， amsc来源的外泌体可防止海马组织损伤，显著降低血清NSE和S100-水平β。

炎症被认为是几种病理条件的主要特征。炎症放大器在各种人类疾病的发展和进展中发挥关键作用，包括自身免疫性疾病、神经退行性疾病和其他炎症性疾病[35]。通过手术免疫系统的活化，鉴定为通过破坏血脑屏障（BBB），如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的免疫细胞浸润的强烈的刺激。所得到的大脑炎症可导致认知能力下降[36]。最近的一项研究表明，来自人沃顿果冻间充质干细胞(WJ-MSCs)的外泌体对围产期脑损伤中的小胶质细胞具有抗炎作用[37]。类似这样的结果，从脂肪干细胞衍生的外来体可以抑制小胶质细胞活化和神经炎症预防通过抑制NF-κB和MAPK途径[38]。在我们的研究中，是血浆IL-1βIL-6和TNF-α水平看到的CPB组中显著增加，并且通过AMSC衍生的外来体补充抑制这种增加（图图4（a）)。IL-10，在抑制促炎细胞因子产生的关键分子，是在EXO组（降低，并且反效果通过AMSC衍生外来体补充图图4（a）)。氧化应激中起关键作用的开发和发展神经炎症由于其在中枢神经系统的免疫系统的激活,导致中央炎症反应刺激生产的一些炎症介质,如更多的活性物种,趋化因子和细胞因子,激活小胶质,先天和适应性免疫细胞的渗透外围(39]。本研究中，人脐带间充质干细胞的外泌体通过草酸+COM减轻HK-2细胞的氧化损伤[40]。与此相关，我们证明了POCD可以诱导MDA水平的升高，而SOD和NO水平可以被amsc来源的外泌体逆转(图)图4（b）)。一系列研究数据报道，POCD发生时，海马区出现细胞凋亡，细胞凋亡在POCD的发生发展中起重要作用[41]。在我们的研究中，TUNEL的结果表明在CPB组中的阳性细胞的数目的增加显著，并且被认为这种增加通过AMSC衍生的外来体补充被抑制（图图5（a）)。CPB组在Bcl-2表达中，pro-caspase-3明显降低，在Bax表达中，cleavage -caspase-3明显升高;这些作用被amsc来源的外泌体部分消除(图)图5（b）)。

TLR是所涉及在识别的病原体相关分子模式（PAMP）公知的关键模式识别受体（PRR）42]。后来的研究表明，TLRs与不同条件下神经炎症的发病机制有关。例如，缺乏TLR2、TLR4和CD14表达的小胶质细胞无法引起促炎免疫反应，而促炎免疫反应会降低促炎细胞因子(如TNF-)的表达α，IL-1α，IL-6，和IL-8）[43,44]。此外，已经报道，WJ-MSC衍生的外来体抑制LPS诱导的TLR4 / CD14在小胶质细胞信号[39]。我们的研究表明，amsc来源的外泌体通过TLR2/TLR4信号通路改善了cpb诱导的大鼠POCD。如图6，TLR2，TLR4，MyD88的，和NF-的mRNA和蛋白表达κB在CPB组中显著增加，而这种增加被amsc来源的外泌体补充所抑制。然而，TLR2/TLR4激动剂(LPS-EB)部分逆转了amsc衍生的外泌体对CPB的抑制作用，并诱导TLR2、TLR4、MyD88和NF-的表达κB.此外，TLR2 / TLR4激动剂还观察到部分逆转AMSC衍生的外来体上的CPB组附图中的效果（2- - - - - -5)。

总之，AMSC衍生的外来体可以减少POCD脑损伤，炎症和氧化应激和防止细胞凋亡的CPB大鼠。这种抑制与TLR2 / TLR4信号传导途径有关。

5.结论

本研究表明，amsc来源的外泌体有助于改善CPB作用大鼠的认知功能，CPB与TLR2/TLR4信号通路相关。我们鉴定了来自于amsc的外泌体，并研究了其通过抑制TLR2/TLR4信号通路减轻CPB大鼠神经损伤和脑损伤以及防止神经元凋亡的能力。提示amsc来源的外泌体对POCD大鼠的保护作用及其机制。因此，我们的研究为体外循环术后认知功能障碍的预防、发生、发展及预后提供了理论和实验依据。

数据可用性

在本研究中使用和/或分析的数据集可在合理要求下由通讯作者提供。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

作者的贡献

杨春和孙胜男太阳同样对这项工作作出了贡献。

致谢

这项研究是由吉林省科技发展计划（批准号20190301082NY）和吉林省自然科学基金（授权号20170101032JC）的资助。

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