文摘
全球每年数以百万计的整形手术执行纠正脂肪代谢障碍的客观因病变,肿瘤切除术,出生缺陷和AIDS-associated抗逆转录病毒治疗。除此之外,大量的临床研究评估过程的结果,依赖于真皮填充剂的组合和自体的细胞。然而,对这些组合和本地化的安全注射的细胞。本研究的目的是测试解决方案的毒性含有1%透明质酸(HA)和脂肪基质细胞(对asc)人类脂肪组织和评估的定位注射细胞,有或没有哈,标以锝99 m。老鼠接受皮下和腹腔内注射含1% HA /脂肪基质细胞的一个解决方案隔离从人类脂肪组织中。动物被观察42天。解决方案测试在这个研究并没有导致系统性,生化,或解剖病变可能代表毒性症状。协会对asc公顷,贴上锝99 m仍在注射部位出现的一段时间的24小时之内,证明了一个全身成像软件融合SPECT和CT。总之,我们的研究表明,皮下、腹腔内注射HA与脂肪基质细胞(对asc)是安全的。协会对asc HA和没有引起局部或全身性毒性。因此,管理的体积等于或小于0.2毫升的代理填料( 6ASC + HA 1%)应考虑后续研究可能是一个替代真皮填充剂由于预期的长期影响。
1。介绍
脂肪代谢障碍综合症包括异质群体的罕见疾病临床表现为部分或全部没有皮下脂肪组织和脂肪存款nonadipose组织如肝脏、肌肉、肾脏和胰腺。最近,面部脂肪代谢障碍已成为一个重要的公共卫生问题,因为它与艾滋病的抗逆转录病毒疗法用于治疗(1- - - - - -6]。到目前为止,包括自体脂肪移植的修复手术,眼球移植,游离皮瓣手术,和真皮填充物的使用7,8]。
自体组织来源于抽脂过程和其他生物材料代表了两种不同形式的真皮填充剂(9]。透明质酸(HA)提供了一种生物相容性选择结缔组织的结合,发挥结构作用在成年人的皮肤和结缔组织(10- - - - - -13]。
数篇论文显示人类脂肪干细胞的潜在好处/基质细胞(对asc)在临床前和临床试验;然而,经同行评议的数据仍然对asc一直有限领域的审美医学(14]。透明质酸,目前灌装产品用于医学美学,提出了重大限制真皮填充剂,包括免疫反应和长寿,和一些组织认为理想的真皮填充剂尚未生产(15]。
近年来,一些作者已经发表的结果与用脂肪干细胞的疗效与不同的生物材料治疗不同病变软骨缺陷(16和骨软骨17和神经再生18]。根据这些作者,本协会将增加再生功效。
自体脂肪组织和生物材料的浓缩干细胞强化原位代新分化的细胞和细胞外基质的生产。因此,这些组合对患者有更持久的影响比单独使用真皮填充剂(19- - - - - -25]。Nowacki等人表明脂肪干细胞真皮填充剂的配方生产更大的填充效果持续的时间大大超过真皮填充物对asc准备好了没有。此外,对asc和可溶性因子函数在皮肤保护和再生作用,诱导胶原蛋白合成、抑制黑素原生成,招募和保护真皮成纤维细胞(15]。
一些临床研究主要集中在使用autologous-derived干细胞整形手术。然而,对注射干细胞的定位和使用它们的潜在副作用26]。
脂肪干细胞增殖迅速的几个章节,第三段后表现出稳定的表型。这些属性对asc让我们获得大量的低风险culture-induced染色体异常或畸胎瘤的形成,因为后者通常与间充质干细胞(没有联系19,20.]。根据Lequeux et al .,使用对asc而非脂肪组织的优点有很多。这种技术可再生的和可控的,因为一个确切的数量的细胞可以被注入和表型是众所周知的。事实上,对asc细胞悬液含有超过95%的表达间充质标记CD105, CD90、CD73和不到5%的细胞表达hematopoietic-related标记,CD14和CD45。这个新成立的脂肪组织,在整容手术,使用时可以恢复皮肤体积,因此减弱,甚至导致更持久的皱纹消失,通过注入哈,这只有一个瞬时效应随着时间的推移,因为它是再吸收(27]。
基于支持额外的好处的数据证明了HA对asc和协会,本研究利用动物模型测试解决方案的毒性含有1%透明质酸(HA)和脂肪基质细胞(对asc)。此外,使用相同的模型,我们评估了本地化的注入对asc和HA与放射性同位素标记锝99 m (99米Tc)来确定干扰其定位和性能。99米Tc-ASCs被全身成像评估软件的融合SPECT和CT在注射后约24小时。
研究旨在评估安全的基本原理和本地化的细胞存在于一个新的先进的细胞治疗产品。细胞产品不加选择地使用了几十年,但仅仅几年前,世界的监管机构开始发放规定生产这种类型的产品。由于对asc的可塑性,至关重要的是,临床前和临床研究执行明确的特征和过程。这些产品用于临床使用应该通过一个足够强大的制造过程由质量控制,以确保一致性和再现性(28,29日]。再生和个性化医学的主要目标之一是细胞疗法的发展没有副作用和缺乏道德问题。
2。材料和方法
2.1。ASC Obtention和表征
脂肪组织是获得健康的病人(二十个女人,三十至六十岁)提交给审美抽脂手术皮肤外科门诊诊所的皮肤科Bonsucesso联邦医院的服务(HFB),巴西里约热内卢。所有的志愿者签署知情同意的形式,根据当地伦理委员会批准的程序下协议数量30/10的CEP / CONEP平台。
先前描述的分离、培养对asc在文献[19,25]。简单地说,脂肪组织受到酶和胶原酶消化II型0.01%(美国新泽西州Worthington-Biochem,莱克伍德)37°C,激动之下。然后,间质血管分数(SVF)孤立镀 7细胞每75厘米2瓶(TPP, Trasadingen,瑞士)补充DMEM-LG介质(LGC、圣保罗、SP、巴西)。达到80%的融合后,对asc保持酶的分离,这些对asc被使用在第三段。
为了确认是否获得细胞对asc文化确实后,这些细胞被标以特定的表面抗原的抗体。表面抗原表达允许细胞群的快速识别。Immunophenotypes测定通过特定的表面抗原表达的评价描述Dominici et al。30.]:造血细胞(CD45-BD Pharmigen,圣何塞,CA,美国),间质细胞(CD105、CD73 CD90-BD Pharmigen,圣何塞,CA,美国),和内皮细胞(CD31, CD133-BD Pharmigen,圣何塞,CA,美国)。标记细胞在BD流式细胞仪获得的咏叹调IIu-flow血细胞计数器(圣地亚哥,正欲、钙、美国),和至少五万事件进行了收集和分析。诱导的细胞可塑性评估细胞分化为骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞谱系后祖克描述的方法等。19]。短暂的状态,对asc是镀在显微镜盖玻片 mm培养皿(美国纽约康宁,Steuben)的密度 2细胞/厘米2。当70%的文化达到融合,分化诱导介质(19]培养基被替换下场。
2.2。ASC在HA播种:评价细胞粘附和形态
测试细胞粘附和形态, 6的速度对asc是稀释1:1公顷为2%(西尔维斯特实验室。Quimica e Farmaceutica Ltda。,Rio de Janeiro, RJ, Brazil). This cell suspension was kept in culture and analyzed in three different times after plating (one hour, twenty-four hours, and seven days). As a negative control, a cell suspension of 5细胞/毫升是保存在文化在相同条件下与10% FCS DMEM-LG补充。
2.3。ASC协会生物材料
准备填充剂, 6细胞被停职的相互混合1毫升的实验解决方案包含2%的透明质酸(西尔维斯特实验室Quimica e Farmaceutica Ltda。里约热内卢,巴西)在生理盐水稀释0.9% (RJ Equilex,里约热内卢,巴西),达成最终的细胞浓度 6细胞和HA的1%。
2.4。时间进程分析超敏反应和全身毒性
填充剂的安全(HA / ASC)分析了通过过敏测试,愤怒,和毒性,进行基于ISO 10993 (31日,32),按照推荐的共识与HA相关不良事件的分类时启动。
作为测试系统,一百五十(150)鼠形纯种血统的男性,12至14周的年龄,开始时使用的管理。
过敏症和系统性的评估毒性的填充剂(HA / ASC),以及它的所有组件,以个性化的方式(氯化钠0.9%,透明质酸1%,脂肪干细胞),进行了,完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)积极控制。测试系统是由剃须准备政府和消毒。测试物质管理一旦cervicodorsal皮下组织的地区,在固定量0.2毫升/测试系统。并行,阳性对照组添加到分析,接收一个固定量0.2毫升(0.05毫升的FAC 0.15毫升生理盐水)/测试系统。
相同的测试物质和管理类型进行评估hypersensitization和系统性毒性大鼠( 每测定)。第一次评估,密切观察动物的头三天改变等临床参数的头发,皮肤、眼睛、黏膜、呼吸、运动活动,行为,和等不良反应的发生震颤,抽搐、唾液分泌,腹泻、倦怠、嗜睡和昏迷。
末尾的第一次试验,通过深度镇静和动物安乐死检查评估宏观上可能的毒性作用。组织学评估的评估进行了注射部位的炎症反应。
后来,相同数量的动物( )提交类似的程序和评估在14日,28日,四十二天注射后全身毒性分析。在每个观察期,动物禁食一夜之间从肝静脉采血前,然后通过深刻的镇静安乐死。血液学生化剖面进行血液测试。
2.5。评估与锝99 m细胞定位
简单地说, 7细胞被孵化500年在室温下十分钟μ二氯化锡(SnCl的L2)。随后,25 mCi99米Tc被添加到解决方案,培养持续了十分钟。混合物然后离心机在500 xg五分钟,和颗粒悬浮在0.9%氯化钠溶液。标记细胞的生存能力评估的台盼蓝(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)排除测试。标记效率(百分比)计算了颗粒除以活动的总和的放射性颗粒+浮层。来确定HA干涉的本地化细胞,一群老鼠( )接受注射,皮下注射,背地区0.2毫升99米Tc-ASC ( 6细胞)与1% HA在生理盐水;另一组( )接受注射0.2毫升99米Tc-ASC ( 6细胞)没有哈。
全身、平面和SPECT显像进行了三个小时和24小时后细胞输注在通用电气射线照相机(美国通用电气医疗集团,芝加哥,IL)和计算机断层扫描在一个最佳状态进行PET / CT 560(美国通用电气医疗集团,芝加哥,IL)。SPECT / CT融合处理与OsiriX©软件。
2.6。统计分析
方差分析的数据进行了分析与方差分析,其次是事后Bonferroni过程。差异被认为是重要的时候 。
3所示。结果
3.1。ASC Obtention从脂肪组织
在这项研究中获得的对asc提出了高容量的附着力的塑料培养瓶,高增殖潜能,表现出一个fibroblastic-like方面在第三段(数字1(一)- - - - - -1 (c))。细胞显示指数增长,通过加倍他们的人口大约每24小时(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。细胞分化为中胚层的血统
对asc被分化成脂肪形成的、成骨的chondrogenic血统。在一个脂肪形成的诱导培养基培养时,这些细胞开始出现许多液泡代表多腔的脂肪组织的脂质积累特点(图2 (b))与对照组相比(图2(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
为了证实成骨分化,分析了细胞外基质的钙化ASC细胞利用茜素红。与对照组相比(图2 (c)),钙化可以看作是细胞单层(图中红色区域2 (d))。同时,为了证实chondrogenic分化,细胞培养与chondrogenic感应媒体21天。这段时间后,细胞提供了一个积累硫酸蛋白聚糖可以专门检测到使用阿尔新蓝染色在酸性条件下(图2 (f)),而对照组与标准培养基培养(图2 (e))。
3.3。Immunophenotyping
对asc第三通道后,提出了集群分化表达:CD45- - - - - -CD34- - - - - -CD105,+,CD73+,CD90+(图3(c))。贴壁细胞表达95%以上的人类间充质基质细胞标记CD105, CD90、CD73。这些细胞也呈现低表达造血CD34、CD45标记。数据3(一)和3(b)显示的存在造血细胞在第一和第二通道。
3.4。细胞粘附和形态
没有在体外细胞粘附和形态学改变的证据评价组ASC + HA(西尔维斯特实验室、RJ、巴西),与对照组相比ASC + DMEM-LG。的文化提出了关于细胞粘合度和形态方面类似的特征。这些参数分析了一个小时,24小时,7天之后文化(图4)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.5。超敏反应的评估
没有统计上显著的变化在临床参数进行评估,如皮肤和头发障碍,改变的眼睛和粘膜,呼吸和循环变化,中枢神经系统疾病,somatomotor活动和标准行为的变化,震颤,抽搐、唾液分泌,腹泻、倦怠、嗜睡和昏迷。宏观和微观分析显示不同程度的炎症在动物处理哈,完全弗氏佐剂,或填充剂(ASC + HA),预计(图5和表1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。评估系统性毒性
没有统计上显著的宏观参数变化、体重增加(表2(表),以及水3(表)和饲料消费4)在填充剂组或任何的四个对照组在观察几天。血液学和生化血液测试显示没有急性毒性(表的迹象5和6),皮下注射的测试评估动物没有造成死亡的物质。
3.7。评估与锝99 m细胞定位
的标记效率99米Tc-ASCs 85%和标记细胞生存能力已经上升到95%。标签程序并不影响细胞的生存能力。如图6,标签99米Tc-ASCs ( 6细胞)与1% HA细胞仍在注射部位出现的一段24小时未发现迁移到任何器官的迹象。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
成功的整形手术,包括基质和干细胞取决于基质的生物相容性和细胞是否仍在注射部位出现的。支持,使用间充质干细胞的组合/基质细胞与足够的3 d矩阵提高他们的再生效果16]。此外,结果表明,微环境刚度和弹性对干细胞分化和很重要的形式组织的细胞(33]。
自体脂肪组织和生物材料的浓缩干细胞强化原位一代新分化的细胞和细胞外基质(ECM)的生产。因此,这些组合对患者有更持久的影响比真皮填充剂(19- - - - - -25]。脂肪干细胞和脂肪移植临床研究中使用的半面和/或脂肪萎缩(7,34- - - - - -36)和其他美学治疗(8,13,37- - - - - -39]。
其他临床研究显示了使用联合治疗潜力由富含血小板血浆(PRP)和透明质酸(HA)刺激伤口的再生(40- - - - - -42]。同时,在大鼠烧伤创面模型,结合透明质酸和脂肪中提取干细胞(对asc)能够促进伤口愈合43]。
在和音在活的有机体内在3 d模型,对asc培养HA凝胶显示促进组织再生(球状体的潜力44]。此外,对asc培养在一个三维胶原蛋白I型支架结合PRP和人类重组胰岛素治疗骨软骨缺损(很有用45]。对asc作为描述,可以在组织修复是一个非常有用的工具,因为这些细胞产生一些细胞因子和抗炎、免疫调节、抗凋亡、血管生成物质,以及神经营养因子(46]。
透明质酸是一种resorbable填料广泛应用于化妆品行业,特别是在整容手术给支持,体积,和水分组织(47- - - - - -49]。这个产品的审美效应被认为是暂时的,自然和进步的降解性取决于天然透明质酸酶,并预计其重吸收发生在12 - 18个月期间(50]。过敏反应是罕见的,但当他们发生时,他们注射后可能导致血管性水肿(51,52]。
尽管更广泛的研究必须在审美医学使用真皮填充剂,这一领域的显著增长,新的细胞产品需要分析前间隙(28,29日,53]。再生和个性化医学的主要目标之一是细胞疗法的发展无副作用和缺乏道德问题54]。干细胞产品用于临床使用应该通过一个足够强大的制造过程由质量控制,以确保一致的和可再生的最终产品。干细胞医学临床前评价应该以充分评估不同方面包括的概念、定位、免疫排斥,和安全28,29日,53]。在这个场景中,我们的研究调查与实验相关的安全和对asc的本地化HA在巴西生产。在这项研究中,我们使用一只健康的老鼠模型来测试填充剂的毒性,包含1% HA解决方案,对asc源自人类脂肪组织。此外,我们评估对asc公顷/解决方案的定位标记99米Tc。
我们的结果表明,皮下管理测试解决方案,哈,对asc和FAC没有造成死亡或在观测期间体重的变化。动物哈/对asc和哈显示增加体积在注射部位出现的。如前所述(55)、动物用完全弗氏佐剂(FAC)治疗炎症的迹象,并显示有刚毛的头发,红斑、肿胀在注射部位出现的。生物化学和血液参数评估值一直在描述参考(56,57]。宏观分析组间并没有透露重大调整,这可以被认为是正常的。轻度红斑出现在动物收到哈,消失后三天内应用程序(49]。同时,温和的肿胀通常是发现在化妆品的应用程序(48]。皮肤损伤涉及到许多不同的退化过程,特别是减少成纤维细胞胶原蛋白的生产。一些细胞因子和生长因子参与刺激成纤维细胞胶原合成的皮肤再生和已被证明是一个分子对asc分泌的一部分,这表明这些细胞可能是适合促进萎缩性和受损皮肤的修复7]。可能的作用机制包括旁分泌激活真皮成纤维细胞和真皮血管生成。因此,维护细胞注射部位是最优的支持组织的再生细胞分泌的能力因素,促进邻近组织的再生(58]。
关于干细胞的定位,使用核医学的评价单元位移已广泛应用于各种类型的研究跟踪细胞的迁移;许多成像方法如宠物、SPECT和MRI已使用(59- - - - - -61年]。在我们的研究中,我们使用99米Tc-ASCs评估细胞归巢。的选择99米Tc是由于它的衰变时间短等特点,容易图像捕获通过使用γ相机确保最佳图像质量,和高灵敏度和可用性相比其他类型(62年- - - - - -65年]。我们的结果表明,99米Tc-ASCs + HA停留在注射部位(图24小时的一段时间6),没有扩散或迁移到不同的器官的迹象,显示其可行性。峰等人已经证明了对asc标签信号的同种异体可能由核磁共振检测14周后关节内的注入羊骨关节炎(66年]。虽然我们的标签技术允许我们图像标记细胞只直到注射后24小时,我们清楚地观察到细胞仍在注射部位出现的。
一些作者已经在他们发表的文章《永久的细胞与生物材料在注射部位有关。这些细胞注射部位的保留是最小化这些细胞粘附的生物材料(15,66年- - - - - -69年]。根据贝尔托齐et al ., HA的使用可以防止过度ASC扩散,允许持续释放注射部位(70年]。史密斯et al。71年),在一个在活的有机体内研究使用MI的小鼠模型,观察到注射HA-based材料批准用于细胞疗法结合使用的干细胞显著增加细胞保留在分娩后24小时相比,细胞在PBS。即使在长期的细胞移植(3周后交付),一个重要的保留是观察。生存的效果观察3周后post-transplantation归因于细胞通过受体CD44材料相互作用。
实验研究的数量评估细胞与生物材料相关的使用真皮填充物还小;一些研究人员评估细胞迁移或描述实际和这种类型的细胞疗法的临床应用。的在活的有机体内细胞皮下注射的效果不能被认为是完全安全的,直到因素导致局部电池持久性更彻底地评估和理解(72年- - - - - -74年]。
进一步的临床前研究与标准化的协议和较大的随机临床试验根据国际准则,如FDA规定,仍然需要确保安全性和有效性使用任何基于单元的产品之前,这些细胞可以用于临床[75年]。特别是,研究者需要证明对asc的安全性和有效性在动物模型中,单独或结合新的生物材料26]。因此,在临床使用,许多问题如原位稳定、分化,细胞迁移应该得到解决(76年]。
5。限制
我们的模型的局限性包括随访时间的24小时,这可能不足以证明长期持久的细胞注射部位出现的周围宿主组织,因此它的影响。注射填充剂的脂肪代谢障碍大鼠模型允许我们分析其疗效。
6。结论
总之,目前的工作是设计作为一个临床前研究评估的安全性和定位包含人类对asc真皮填充剂+ HA在动物模型。尽管报告的变化,生物材料和人体细胞检测的协会并没有导致系统性,生化,或解剖病变可能代表毒性症状。在我们的研究模型,它已经表明,代理填料(对asc + HA)在皮下和腹腔内注射是安全的。
此外,细胞仍在注射部位出现的恢复和增强所需的形式,以及持续的长期维护的审美效果。因此,管理的数量等于或小于0.2毫升的代理填料( 6对asc + HA 1%)为后续研究应考虑。我们所知,这是第一次,这样的研究进行了文献中所描述的。
数据可用性
作者将提供原始数据与纸有关的编辑审查和/或公共访问。后的数据将被保留一个合理的时间。
伦理批准
人类细胞的使用和获取他们的程序是经当地伦理委员会批准的联邦医院IRB Bonsucesso协议号码30/10。动物协议经伦理委员会批准的使用动物科学实验(健康科学中心的里约热内卢联邦大学的),在协议数量167/13和当地伦理委员会也批准了与皇家教育学院相关研究和技术开发,在协议数量CEUA-IRPoA 1920/13。与使用实验动物相关的所有程序由这项工作遵循的道德戒律的使用研究动物保健和使用手册的制定实验动物(国家研究委员会,2003年),指导文档识别,(经合组织,2000年),动物实验的伦理原则(巴西大学动物实验,1991),以及澳大利亚守则的动物保健和使用科学的目的(2004)。
同意
从患者获得书面知情同意是匿名的信息在这篇文章发表。
的利益冲突
作者声明没有潜在的利益冲突的研究,本文的作者,和/或出版。
确认
本研究由巴西科学和技术发展委员会(CNPq),里约热内卢州研究基金会(FAPERJ E-26/190.153/2013),国家科学和技术研究所的再生医学(INCT-REGENERA),改善高等教育的协调人员(披肩)和Cryopraxis Criobiology Ltda。