由脐带间充质干细胞支持的骨代用品骨缺损修复

摘要

客观的.各种病因的损伤、炎症、肿瘤或创伤过程或外科手术可能导致骨缺损或萎缩。有时，骨丢失的再生过程受损、显著减慢或不发生，例如先天性骨缺损。对于骨缺损重建，使用从髂骨翼取出的一块骨或死者的骨移植。用骨替代物替换自体或异体骨源可减少重建骨缺损期间的手术次数和药物昏迷时间移植手术可能通过分泌血管生成因子、募集其他MSC或分化为成骨细胞对组织再生产生积极影响。材料和方法来源于脐带的间充质干细胞（沃顿果冻（WJ-MSC））在添加肝素、10%血小板裂解物、葡萄糖和抗生素的GMP级DMEM低葡萄糖中培养。体外将WJ-MSC接种在骨替代物Bio-Oss Collagen®上，并在StemPro®成骨分化试剂盒中培养。在第1、7、14和21天（体外培养日（DIV））的培养过程中，我们分析了WJ-MSC在Bio-Oss支架上的生存能力（共聚焦显微镜）和粘附能力（电子显微镜），以及基因表达（qPCR）和蛋白质分泌（Luminex）。在活的有机体内将带有WJ-MSC的Bio-Oss®支架移植到颅骨的钻孔中以获得其过度生长。在术后7、14和21天进行计算机断层扫描以评估再生。结果。Bio-Oss®支架为WJ-MSC的存活提供了有利的环境。WJ-MSC在骨分化培养基中能够附着和增殖在Bio-Oss®支架上。从qPCR和Luminex®获得的结果表明，WJ-MSC具有分化为成骨样细胞的能力，并可能诱导破骨细胞生成、血管生成在动物研究中，种植在Bio-Oss®上的WJ MSCs增加了支架与宿主骨的结合，并将其形态改变为成骨样细胞。结论所提出的结构由Bio Oss®组成，该支架具有高度的灵活性和可塑性，经批准可与具有免疫特权的接种WJ-MSC一起临床使用，可被视为骨缺损的重建疗法。

1.介绍

由于出生缺陷、损伤或正在进行的疾病过程而导致的骨缺损通常需要重建。就标准程序而言，使用的是自己的骨移植。这意味着需要额外的程序，有时还会给患者带来健康并发症。根据科学研究，此类骨移植通常比其他手术更容易萎缩经测试的生物材料支架。通过将骨支架引入人体，假定其将长期发挥特定功能。植入物与骨的良好吻合及其适当的弹性可为骨缺损的正常愈合过程创造条件。

口腔医学中常用的生物材料之一是Geistlich Pharma AG生产的Bio Oss®。该材料被批准用于正畸手术的临床应用。Bio Oss®由去除脂类、血液成分和蛋白质的牛骨组成；因此，移植后不会发生排斥反应。Bio Oss®具有与人类松质骨非常相似的结构，具有弹性和高孔隙率，允许细胞粘附和存活。

近年来，生物医学领域对间充质干细胞作为组织内源性再生的潜在助推器表现出了极大的兴趣。MSC表达表面标记物，如CD73、CD90和CD105，并具有更新和分化为首选细胞类型（如骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞）的潜能。每年，从骨髓或脂肪组织分离的MSC的临床试验数量都在增加。这些细胞的作用尚未完全解释，但在骨骼系统中，皮肤病学和眼科学的基础是分化成靶细胞系以及免疫调节和促血管生成功能[1.]．

骨髓间充质干细胞首先从骨髓中分离出来；此后，这些细胞被广泛地描述和使用。除骨髓外，骨髓间充质干细胞是从脂肪组织和脐带中分离出来的。分离的骨髓间充质干细胞的数量占从骨髓抽出物获得的总细胞的0.001%到0.01%，约为2%如果是脂肪组织，则在脐带的沃顿果冻中约占25%[2.].骨髓和脂肪组织的收集与侵入性手术有关，而脐带则是分娩过程中的废物。此外，利用胎儿来源的MSC干细胞进行再生还有其他好处，这是因为它们具有广泛的生长和更高的分化谱[3.]．WJ-MSC可塑性强，可分化为骨、脂肪细胞、软骨细胞和汗腺细胞[4.]，雪旺细胞[5.,6.和胰腺细胞[7.]甚至神经样细胞[8.].由于长期暴露于环境条件下，从成人组织中分离出的细胞可能具有增殖和再生能力降低以及与较短端粒相关的更快老化的特点。与这些细胞相比，来自脐带的MSC具有原始效力，并且由于其胎儿来源，其性质不变[9]．

WJ-MSCs的一个非常重要的优势是其低免疫原性，这使得这些细胞不仅可以用于自体移植，而且可以用于异体移植，而且排斥反应风险极小。WJ-MSC的特点是低蛋白表达一级组织相容性I类(MHC-I)和缺乏MHC-II;因此，它们受到NK细胞的保护[10]．低免疫原性可能还与细胞表面缺乏CD40、CD80和CD86作为免疫反应共刺激物以及其抑制因子吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和前列腺素E2的同时表达有关。此外，WJ-MSC表达人白细胞抗原HLA-G5 (human白细胞抗原G5)和HLA-G6，这两种抗原通过抑制淋巴细胞增殖参与了母体子宫内胎儿耐受的过程。WJ-MSCs移植到免疫系统减弱的小鼠后未形成畸胎瘤，且迄今未见WJ-MSCs移植患者中出现此类病例的报道[11,12]．

2.材料和方法

我们的实验是按照这个方案进行的1..

2.1.WJ-MSC的分离和培养

脐带(UC)是从华沙医科大学妇女和新生儿医学中心摘取的，经母亲同意和当地伦理委员会同意。UCs在含有100 j/ml青霉素和链霉素和0.25的PBS中运输μg/ml两性霉素B。在不到24小时内进行分离程序 出生后h。UCs被切成1-2块 毫米件 从沃顿果冻的血管周围区取出mm活检片，置于6孔细胞培养板上，组织在90%DMEM（Macopharma）、10%血小板裂解物（Macopharma）和2 j/ml肝素，1%( )抗生素（Gibco），1%( ),100mg /ml葡萄糖，5% O_2.培养基每2-3天更换一次。用Accutase（BD）收集从组织块中迁移出来的细胞。

2.2。流式细胞仪分析

为了确定MSC标记物，用Accutase从细胞培养瓶中收集细胞。用与荧光色素结合的小鼠抗人抗体对细胞进行染色：异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、培菌素-叶绿素-花青蛋白复合物（PerCP-Cy）™), 或别藻蓝蛋白（APC）：CD90-FITC、CD44-PE、CD105 PerCP-Cy™, CD73-APC（BD茎流™ 使用FACSCalibur II（Becton Dickinson）分析细胞。

2.3. 免疫细胞化学分析

将细胞接种在24孔细胞培养板中的聚赖氨酸上的盖玻片上。用4％多聚甲醛固定细胞10分钟，用Triton X-100（Sigma-Aldrich）渗透15分钟（在染色CD73和CD90时不适用），并含有10％山羊血清（染色时10％驴血清）对于骨桥蛋白）用1％牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich）1小时。将细胞与小鼠抗人一代抗体CD73，CD90，Osteocalcein，山羊抗人骨骨桥蛋白，兔抗小鼠一抗ki67在4℃下过夜（表1.).抗体用PBS洗涤几次，二级抗体-山羊抗小鼠/兔或骨桥蛋白-驴抗-山羊抗体添加1小时 用Hoechst 33342对细胞核进行复染。骨钙黄绿素的免疫细胞化学染色在新分离的细胞和骨分化后21天进行，并在荧光显微镜下检查蔡司AxioVert.A1。在骨分化培养基中，在Bio Oss®胶原支架上培养21天的细胞上进行骨桥蛋白免疫细胞化学染色，并在共聚焦显微镜下蔡司LSM780进行检查。

2.4.菌落形成单位分析

脐带被切成两半。一部分冷冻在80%PBS中，10%2 M蔗糖和10%二甲基亚砜。第二个用于新鲜分离。WJ摩根士丹利资本国际4号^th传代在6孔细胞培养板上重复接种10个细胞/孔。10-12天后，用4%多聚甲醛固定细胞15天 用0.5%甲苯胺蓝溶液染色20分钟 在共聚焦显微镜蔡司LSM780下检测RT细胞中的min。在ZEN 2.3 lite软件中计算CFU-F的数量。冷冻组织保存1个月后，将UC解冻，并对新鲜UC进行所有步骤。实验分3次重复进行。

2．5．WJ-MSC的成骨、软骨和成脂分化

细胞以24孔细胞培养板的密度播种 用于成骨和 脂肪发生。在达到50-60％的WJ-MSC汇合后，对于骨质发生和70％的脂肪发生汇合，STEMPRO®骨质发生/脂肪发生分化试剂盒代替标准生长培养基。适用于软骨发生，1 μl液滴 将溶液播种在井中心，在高湿度条件下10分钟后，轻轻地加入StemPro®软骨形成分化试剂盒。在骨分化培养基培养21 d、脂肪分化培养基培养14 d、软骨分化培养基培养14 d后，细胞在4%多聚甲醛中固定，分别用茜素红S、油红O和1%阿利新蓝溶液染色。细胞在分化培养基中培养时，将细胞培养板转移到21% O_2.按照制造商的建议。

2.6。细胞增殖测定

WJ骨髓间充质干细胞接种于3000个细胞/cm^2.在96孔细胞培养板中。细胞在标准培养基和StemPro®成骨分化试剂盒中培养8天，每种情况下培养6个孔，每天培养一个平板。之后 ,用血小板裂解物、肝素、葡萄糖和抗生素将培养基改为DMEM w/o酚红。10 μ向孔中加入1 l MTT盐并培养4.5分钟 h、 二十五 μl溶液留在井中，50 μ添加1 l二甲基亚砜。在FLUOstar Omeg（BMG Labtech）中测量吸光度。每天重复该程序8天。根据以下公式计算每种条件下的群体倍增时间： 在哪里今天是实验日，₀是实验的第一天，是特定一天内的细胞数量，以及₀是中单元格的初始数目₀.

2.7。将细胞播种到支架中

Bio Oss®胶原蛋白购自Geistlich Pharma SA.100 用手术刀将mg立方体切成16小块 μ将8000000细胞/ml细胞液L注入支架中。将带细胞的支架移入24孔细胞培养板，1孔最多3个立方体。Bio-Oss®胶原蛋白与WJ-MSC在标准培养基和StemPro®成骨分化试剂盒中培养21天。24小时后，将支架转移到新井中。

2.8.Bio Oss®胶原蛋白的细胞活力测试

如前所述，将细胞接种到支架中。在第1、7、14和21天，在标准培养基和StemPro®成骨分化试剂盒中进行细胞活力测试。在每个时间点，用同型二聚体乙锭和钙黄绿素AM在DMEM中对含有细胞的支架进行20分钟的染色 用PBS清洗后，在共聚焦显微镜下检查支架，蔡司LSM780 -生成2D图片的平面。

2.9. WJ-MSC在Bio-Oss®胶原蛋白上的沉降评估

根据将细胞植入支架的步骤，将细胞植入支架。在第1、7、14和21天进行评估。对于每个时间点和条件，制备无细胞支架作为阴性对照。在每个时间点，将支架转移到固定液中进行电镜观察。在扫描电子显微镜JSM-6390LV（JEOL）下检查支架。

2.10.3D培养中WJ-MSC蛋白分泌

根据将细胞接种到支架中的情况，将细胞接种到支架中，每个条件下每个时间点有3个支架。在第2天、第7天、第14天和第21天，从所有井中收集培养基，并在每种条件下连接到一个falcon管中，冷冻并储存在-80°C下。24 h收集前，将培养基换成新鲜培养基。收集标准培养基和StemPro®成骨分化试剂盒作为阴性对照。实验分3次重复进行。将所有培养基解冻并在500 x g中离心5分钟 最低3 将每毫升上清液转移到Spin-X 6超滤浓缩器（SIGMA）中，截止值为5 kDa，离心1800 x g，持续15分钟 最小BMP-2、FGF-23、IL-6、骨保护素、RANKL、Dkk-1、IL-1α，骨桥蛋白，肿瘤坏死因子-α、VEGF-D和TGF-β1在Luminex®分析中进行分析。所有步骤均按照制造商的说明进行。在Luminex Bio Plex®200系统中读取Luminex®板。

2.11.RNA分离和qPCR分析

如前所述，将细胞接种到支架中，每个条件下每个时间点3个支架。在第2天、第7天、第14天和第21天，收集支架并在400分钟内悬浮 μ将1 l苯酚溶胶冷冻并储存在-80°C下。实验分3次重复进行。按照制造商的说明，使用Total RNA Mini Plus（A&A生物技术）从支架上分离总RNA，并使用Clean Up RNA浓缩器（A&A生物技术）进行清洗和浓缩。19 按照制造商的说明，使用RNA-to-cDNA试剂盒（Thermo Fisher）反向转录每个探针的RNA。按照制造商的说明，使用SsoAdvanced PreAmp Supermix对cDNA进行预扩增。25 μl的cDNA加入225μ每根探头的水量为l。5 μ每一个qPCR反应都使用1 l的cDNA溶液、引物和来自3color RT HS-PCR mix Sybr®的混合物。PCR是用人的特异性引物进行的GAPDH,B2M,RPLI3A,HPRT1,TBP,PPIA,BGLAP,阿尔普,RUNX2,COL1A1,视频显示器和SNAI1。QPCR条件是95℃，40个循环的95°C，95°C，60°C为60°C。参考基因由Genorm和NARMFINDER测定。使用参考基因​​：TBP。Geneex 6.1软件（MultId分析AB，Göteborg，瑞典）用于通过PFFAFL方法分析数据[13通过LightCycler®96软件(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)自动计算出的定量循环(Cq)值和基线设置(Table2.）.

2.12.体内移植

在以下实验中使用四只Wistar大鼠。在麻醉下，在每只大鼠的头皮中制备4个串辛孔（〜0.2cm宽）。一个人留空，一个人装满了Bio-OSS®胶原蛋白，用注射细胞填充了Bio-Oss®胶原蛋白，用注射细胞填充了Bio-OSS®胶原蛋白，并施加了额外的细胞溶液注射移植地点。手术后饲养大鼠21天。

2.13.计算机断层扫描

7、14和21天后，在麻醉下对大鼠头皮进行计算机断层扫描。使用Albira PET/SPECT/CT临床前成像系统（Bruker）进行计算机断层扫描。每次成像时，大鼠使用异氟醚（Baxter Polska Sp.z o.o.）进行麻醉通过鼻锥吸氧并监测呼吸。CT扫描参数设置如下：管电压为45 kVp，管电流为400 μA、 投影数为1000，CT最小分辨率为90 μm、 对头皮进行三维重建，并在PMOD软件（版本3.307，模块视图工具[PBAS]（PMOD Technologies LLC）中对时间点之间的骨再生进行比较。在动物身上进行的所有程序均由华沙大学生物系第一个地方伦理委员会批准（许可证编号560/2018）。

2.14. 尸检分析

大鼠处死后，分离颅穹窿，37℃摇瓶浸泡于2j /ml胶原酶中2h。取头皮软组织，用双目相机拍照。

2.15。统计数据

使用GraphPad Prism 5软件对原始数据进行统计分析。Kolmogorov-Smirnov检验用作正态性检验。学生 -使用一对组测试或单因素方差分析，然后使用Tukey的多重比较测试进行组内比较： , , ,和 .结果代表三个独立的实验，每个实验至少有四个重复。图中显示的结果为标准值的平均值。

3.结果

3.1.隔离效率和WJ-MSC特性

WJ骨髓间充质干细胞是从新鲜和冷冻的UC组织中分离出来的，这些UC组织来自血管周围区的沃顿果冻（图1）2.）.

从组织块移出的细胞显示典型的成纤维细胞样形态（图1（a）).观察到新鲜UC和冷冻UC之间的分离效率差异，但不影响分离WJ-MSC的能力（图1（b）)WJ骨髓间充质干细胞能够从单个细胞中形成CFU-F。平均而言，40%的细胞能够从新鲜和冷冻分离获得克隆原性（图1 (c)）.

流式细胞术分析显示约97%的分离细胞表达CD73、CD90和CD105，缺乏CD45、CD34、CD19和CD11b标记物（图2(一个)–2 (c)）.

免疫细胞化学染色显示WJ-MSC表达CD73和CD90。在少数细胞中，未分化细胞中观察到骨钙黄绿素，而骨桥蛋白中未观察到。在骨分化后，WJ-MSC在细胞中表达 在未分化细胞中，观察到大量Ki67表达（图3.）.

WJ MSCs分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞，分别通过油红O、阿尔辛蓝和茜素红的阳性染色证实（图4.）.

在标准培养基和骨分化培养基（约30天）中，WJ-MSC从第1天到第8天的倍增时间没有明显差异 h（图5.）.

3.2.细胞活力测试和评估WJ-MSC在Bio-Oss®胶原蛋白上的沉降

在这两种情况下的第一天，细胞在Bio-Oss®胶原上的存活能力相当，但在骨分化中，培养基细胞具有成纤维细胞样的形态^th第二天，两种条件下的细胞活力相似。在骨分化过程中，与对照条件下附着在支架上的少数细胞相比，培养基细胞变得更短、更宽，支架的整个表面几乎被一层细胞覆盖。在骨分化条件下，细胞之间的界限模糊，难以区分不同的细胞。在实验结束之前，观察到类似的结果，对照组的细胞数量减少得更多，骨分化组的成骨细胞形态更多（图1）6.）.

在Bio Oss®胶原上培养的WJ-MSC的免疫细胞化学染色显示这些细胞中有骨桥蛋白表达（图7.).WJ-MSC表达骨桥蛋白 .

3.3。3D培养中的蛋白质分泌

WJ-MSC分泌在骨再生过程中至关重要的细胞因子（方案3.）.在骨分化培养基中，从第2天到第21天，可以观察到种子细胞分泌的BMP2蛋白浓度增加。在控制介质中，这种趋势不会发生。FGF-23的蛋白浓度也发生了类似的变化，直到第7天蛋白浓度才开始升高^th当仅在骨分化培养基中达到平台时。

对于对照培养基中的VEGF，蛋白量从2^钕第14天^th在分化培养基中可以观察到相反的结果，其中^钕第七天^th每天，注意力增加，并保持在这个水平，直到实验结束。

在对照条件下，截骨疏松素浓度在2中增加^钕而在骨分化培养基中，从实验开始到实验结束，蛋白质含量一直在增加。

通过时间略微增加骨蛋白酶浓度，但在分化介质中，可以从7中观察到大幅增加^th天和它的稳定分泌直到21岁^英石白天

在对照条件下，RANKL水平从第2天到第21天略有下降，而在骨分化培养基中，RANKL水平在第7天增加了2.5倍，该水平在实验结束前保持稳定。

在这两种情况下，TGF分泌增加的趋势-β1从第2天到第21天可以观察到。

在这两种情况下，在第2天，大量的IL-6分泌，在第二天的水平，该蛋白急剧下降。

通过在控制条件下进行21天的实验，与大量相比，DKK-1的分泌几乎没有观察到，其倾向于骨液细胞化培养基中的蛋白质水平直至最后一天。

IL-1和TNF的浓度-α在对照条件下，从第2天减少。在骨质细胞化条件下，可以观察到逆转趋势，直到第7天可以观察到蛋白质水平的增加，然后分泌那些蛋白质在实验结束之前稳定某些水平（图8.）.

3．4．基因表达(qPCR)

通过对6个内参基因的分析，选用geNorm软件- tata结合蛋白(TBP)肽基脯氨酰异构酶A(PPIA)还有一个基因是由NormFinder软件选择的-TBP（图9）.接下来的分析，TBP该基因被用作参考基因。

从标准培养基中Bio Oss®胶原蛋白上培养的WJ-MSC中提取RNA后，qPCR所需材料短缺。因此，使用标准培养基中2D培养的WJ-MSC材料中的基因表达进行比较。将BGLAP增长了5倍阿尔普从第2天到第21天观察表达。下降了6倍COL1A1在第2天观察到表达，从第7天到第21天观察到表达增加了8倍。在实验第2天，观察到表达增加了3倍SNAI1; 在第7天和第14天，与对照组相比，表达下降到1倍增加；在第21天，表达再次增加到2倍。视频显示器从第2天到第21天，表达量增加了10倍。表达RUNX2轻微下降，在21天的实验中约为1倍（图10）.

第7天、第14天和第21天的计算机断层扫描显示，钻孔后的空孔缺乏再生（图11）.在术后，扫描充满支架的孔显示放射性再生。最多21天，注射细胞的变体之间没有差异。

在胶原酶溶液中孵育并用纱布移除软组织后，没有细胞的支架从孔中掉出。注射细胞的支架显示与头皮的骨组织的连接（图12）.

4.讨论

沃顿果冻（脐带基质）由于其完全无创收集和高可用性，可能是最方便的MSC来源（WJ-MSC）用于未来的临床治疗。从出生后分离的细胞的优势在于其早期发育阶段，这使其分化程度较低，比体细胞间充质干细胞具有更高的增殖潜能，具有更高的克隆形成能力和较慢的衰老速度。此外，WJ-MSC显示出可忽略的免疫原性。这是由于MHC I类抗原（HLA-ABC）的低表达和MHC II类抗原（HLA-DR）的缺乏共刺激抗原如CD80和CD86参与T淋巴细胞反应和B淋巴细胞的激活。考虑到同种异体系统中细胞的可用性和管理能力，WJ-MSC可能是比骨髓来源的MSC更好的临床使用来源。为了获得最大的p由于WJ-MSC可能具有较高的增殖和克隆形成潜能以及良好的存活率，我们开发了一种从脐带特定区域分离的方案。类似于Subramanian组[14，我们用机械技术从血管周围区分离细胞。最好的结果是使用直径为2毫米的生物午餐。

本实验室使用的WJ-MSC分离技术可获得高产量和高质量的细胞。与其他科学家报道的10-30%的MSC群体相比，分离细胞群体的CFU-F高达40%，这是一个阳性结果[2.,9,15]用我们的方法分离的沃顿果冻在分离后可以在不减少MSC数量的情况下冷冻，这与Chatzistamatiou的观点相矛盾，Chatzistamatiou认为只有从新鲜组织才能有效地从脐带分离MSC[16]．

迄今为止，从骨髓中分离的MSC是骨科手术中最常用的。在我们以前的论文中[8.]，我们比较了BM-MSC和WJ-MSC的一些特性，WJ-MSC的某些特性仅适用于该部分。正如Chen和Avercenc-Léger在他们的研究中所显示的那样，WJ-MSC优先与中胚层细胞系不同([17,18])WJ-MSC还可以分化为外胚层和内胚层胚层的细胞系，这一点已被Maher Atari和我们的团队证实([19–21.]). 因此，这些细胞的可塑性显示出其很高的治疗潜力。

对于骨重建，移植细胞必须具有向成骨细胞（OB）分化的能力.从文献中可以看出，这些细胞是在宿主干细胞/基质间充质细胞重塑过程中招募的。在某些临床情况下，宿主前体细胞的数量不足，这就是为什么现在将人类MSC引入临床的原因。

MSCs具有多向功能。除了成骨细胞的分化，MSC还支持破骨细胞的发育。破骨细胞的发育需要来自造血细胞的破骨细胞祖细胞之间的细胞间接触。骨桥蛋白似乎是在这一过程中起关键作用的因素。骨桥蛋白在成骨细胞和破骨细胞分化早期表达，其细胞黏附特性对破骨细胞的形成至关重要。它负责细胞附着在基质物质或其他细胞上，促进相互作用。Yamate等[22.]所述抗骨桥蛋白抗体或含RGD的肽抑制该过程，而新分离的WJ MSC分泌骨桥蛋白，但在细胞培养过程中分泌量显著下降；在分化条件下，其水平不断增加。

此外，骨桥蛋白被认为可以增强MSC的分泌潜能，进而促进造血前体细胞的增殖和分化。

在所述条件下分离和培养的WJ-MSC与BM-MSC类似，可通过分化为成骨样细胞直接促进骨再生，并通过刺激成骨细胞和破骨细胞的成熟以及通过分泌VEGF-D激活血管生成间接促进骨再生。

骨重建分几个阶段进行，具有不同的关键因素（方案3.).第一阶段是骨吸收。在此阶段，Dkk-1、IL-6、IL-1和TNF的分泌-α增加破骨细胞生成的助推器[23.,24.].在再生的下一阶段，新骨形成。BMP-2在ECM中积累[25.]与诱导骨形成的成骨细胞受体对抗。在我们的实验中，BMP-2的分泌增加。FGF-23也有类似的趋势，FGF-23是一种维持离子内稳态和骨矿化的蛋白质[26.]．在三维培养过程中，细胞贴壁于支架，活细胞，并能迁移。这些特征与骨桥蛋白分泌的增加相关，骨桥蛋白分泌也有助于骨重塑、应激反应和修复([27.])。新骨的吸收和形成必须平衡。它由骨保护素（OPG）和RANKL维持。OPG是RANKL的竞争性抑制剂，负责破骨细胞成熟和骨吸收，OPG和RANKL之间的适当比例是维持适当骨体积所必需的[28.,29.].两种蛋白质水平在实验过程中都有所增加。为了实现正确的骨再生，需要同时进行血管生成。向细胞提供营养物质，使受损组织碎片沉淀下来，这对骨再生过程至关重要[30.]．VEGF-D刺激内皮细胞的增殖和迁移，属于重要的促血管生成因子。尽管Amable小组发现WJ-MSCs不分泌VEGF [31.]，在我们的实验中，我们观察到分化培养基中VEGF-D水平从第2天到第7天显著增加，并一直维持到第21天。与我的观察结果一致，Obtulowicz等人和Widowati等人也描述了WJ-MSC的促血管生成特性[21.,32.]因此，可以假设WJ MSCs通过刺激VEGF-D的产生促进新血管的形成，从而支持和加速组织的再生（方案1）3.）.

在骨组织广泛缺损的情况下，由于缺乏细胞生长和组织再生所需的支架，单独使用细胞治疗不能带来预期的结果。有必要使用骨移植材料和细胞进行联合治疗，以加速结构的再生并通过上述间充质干细胞的分泌、诱导和分化特性，支持导入材料与患者骨骼的连接[33.]大量研究表明，由于其生物物理特性，例如弹性、形状或孔隙率，用于创建三维骨架的适当选择的材料可能会影响间充质细胞的分化[34.–36.]．遗憾的是，有时尽管满足地形条件，但这些材料的生化组成可以防止适当的细胞存活，粘附和分化。测试的一些材料不能用于诊所;其他人不可生物降解。这就是为什么选择对再生的最佳骨架的选择仍然正在进行中。

在我们体外研究表明，WJ MSCs能够在Bio-Oss®胶原支架上定植，由此产生的结构具有细胞存活率高的特点，并允许形成复杂的成骨结构，单个细胞之间的边界特征消失。此外，MSC植入支架并培养在成骨细胞和破骨细胞分化的关键因素是分泌的骨介质。

自然环境中的观测体内有必要确认MSC向成骨样细胞整合和分化的能力。根据我们的经验，体内通过使用大鼠模型进行的检查，我们证明移植后21天存在植入活WJ-MSC的Bio-Oss®胶原支架。为了验证骨替代物与大鼠骨组织的完全整合，移植后几个月必须进行类似的观察[37.]然而，尽管时间如此之短，但在尸检后，可以得出结论，注射细胞的支架与颅骨的结合程度高于单独的空骨架，这可能是软骨形成的结果，在计算机断层扫描中无法观察到。使用不同的骨替代物和骨髓间充质干细胞进行上颌窦提升的结果相似[38.]，但有报道称移植骨髓间充质干细胞的存活率较低，这是由于急性炎症和机械损伤[39.]不愿意在诊所里使用这种疗法。

5.结论

骨缺损的重建是一个需要除下颌骨、长骨或颅骨以外的材料的过程。通过应用计算机断层扫描，可以清楚地显示缺损的形状。但是，移植物和患者骨骼之间的边界仍应被破坏。为此，所用材料必须是弹性的，易于重塑，在手术过程中灵活。在Bio-Oss®胶原支架中添加10%的胶原使其易于成型和处理。此外，它有利于细胞附着在支架上，并导致更好的存活和分化。根据我们的观察，骨骼可以像塑性材料一样放置和安装在缺陷上然后注入细胞。这不会干扰细胞定植或降低细胞存活率。由于适当的孔隙率，细胞将在局部壁龛内形成。另一方面，我们证明WJ-MSC可能是临床重建治疗的最佳细胞源。它们具有相同的成骨和分泌能力与其他骨髓间充质干细胞一样，它们是骨形成所必需的多种因素之一，同时，它们的免疫原性较低，甚至可以进行同种异体移植。此外，它们更容易获得，并且通过适当的分离和培养方法，它们的存活和增殖潜力非常高。见《移植联合治疗》手稿经临床使用支架的研究，WJ-MSC的性质有可能立即用于临床骨缺损的重建。

数据可用性

本研究的数据可向相应作者索取。

利益冲突

作者声明，关于本论文的发表，不存在相互竞争的财务利益或利益冲突。

致谢

这些研究是在电子显微镜平台上进行的，该平台位于波兰华沙Mossakowski医学研究中心波兰科学院，透射电子显微镜型号JEM–1011（JEOL），配备了EDS INCA（牛津）分析仪。这项工作得到了国家研发中心的部分支持（批准号：Strategmed 1/234261/2/NCBR/2014）。

工具书类

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