负压的影响和收获的网站在人类脂肪从Lipoaspirates Tissue-Derived基质细胞的特征

文摘

背景。脂肪tissue-derived基质细胞(ADSCs)潜力巨大细胞疗法,包括组织工程。然而,很多因素都可以影响孤立ADSCs的特点。方法。我们研究收集网站的影响,即。大腿内侧( ),外大腿( ),和腹部( ),和消极的压力,即。,low (-200 mmHg) and high (-700 mmHg), on the characteristics of isolated ADSCs. We counted initial yields of attached cells after isolation. In subsequent passage, we studied the number, viability, diameter, doubling time, mitochondrial activity, and CD surface markers of isolated ADSCs.结果。我们从大腿外侧显示更高的初始细胞收益率比腹部地区的地区。负压不影响细胞的收益率从大腿外地区,而收益率从下腹部地区在高负压高于低负压。在随后的段落,一般而言,没有明显的关系被确认不同的负压和ADSC的特点。没有观察到显著差异ADSCs大腿和腹部ADSCs的特点。只有1天,在外大腿ADSCs直径明显比在腹部ADSCs。此外,我们注意到一种趋势的大腿ADSCs(即。,inner thigh+outer thigh) to reach a higher cell number on day 7.讨论。收集网站和负压力可能会影响初始细胞从lipoaspirates收益率。然而,对于后续的在体外培养和用于组织工程,似乎收获站点和负压的水平没有一个关键或限制对基本ADSC特征的影响。

1。背景

各种来源的干细胞在再生医学细胞疗法的基本元素,特别是对于组织工程。如今,组织工程往往使用(1)多能干细胞或多功能,(2)可以经常大量收获,和(3)是被道德问题比其他类型更少。间充质基质细胞(msc)多功能plastic-adherent纤维母细胞。他们可以从成人器官和组织,主要收获。,bone marrow, peripheral blood, adipose tissue, skin, skeletal muscle, dental pulp, brain, and endometrium [1]。不仅成人组织,而且extrafoetal组织,如胎盘、脐带组织,羊膜,羊水也能作为msc的来源。的特点和分化骨骨髓来源基质细胞(bmsc)已被广泛研究,在他们第一个msc描述。bmsc提供有利的分化特征。然而,捐助者和脂肪的BMSC收获过程不舒服tissue-derived基质细胞(ADSCs)提供类似的收益率孤立的细胞,与更大的后续增殖能力(2]。近年来,ADSCs已经成为组织工程和细胞治疗的理想目标。相对容易的获取过程和ADSCs的多功能特性使这些基质细胞适合各种用途(3]。应用自体的可能性可以进一步利用ADSCs细胞疗法。

隔离方法ADSCs从脂肪组织可分为酶和非酶的方法(4,5]。直到现在,酶消化使用胶原酶被最广泛的执行过程。然而,新的替代非酶的技术(例如,振动和离心法)也可以应用,特别是对于临床用途6]。酶消化和离心分离后,得到三个分开的部分,即上层油部分含有脂肪细胞,消化组织组成的中间部分,红色的间质血管分数(SVF)颗粒底部7]。SVF部分是不同的细胞类型的混合物组成的ADSCs周也不定地,preadipocytes,内皮前体细胞,内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和淋巴细胞(5]。

大量和范围的研究集中在获得ADSCs已经出版。研究调查了各种fat-harvesting过程、细胞隔离程序,和捐赠的因素。所有这些因素可以影响生存能力、产量,和随后的孤立的细胞的增殖和分化。肿起的抽脂作为最简单的程序获取脂肪组织。负压(真空)在抽脂过程使用的是一个重要的因素,影响收获组织的质量和数量。李等人研究的影响(即不同的负面压力。-381毫米汞柱和-635毫米汞柱)在脂肪移植8]。在他们的在活的有机体内研究中,体重没有显著差异或脂肪移植的组织学观察;此外,高负压并不影响脂肪移植的可行性[8]。同样,在一项由Charles-de-Sa et al .,无显著差异,在脂肪细胞的生存能力或数量的msc、脂肪组织中发现了获得在各种负面压力(9]。然而,其他研究报告称,负压细胞特性的重要影响。Mojallal等人测量大的脂肪组织细胞产量较低负压下收获(-350毫米汞柱)比在高负压(-700毫米汞柱)10]。同样,陈等人报道了超过2倍细胞数量SVF从脂肪组织分离收获低负压(下 )比在高负压( )(11]。他们还报道细胞快速成长和获得更高的一些生长因子分泌细胞在低负压下初始段落(11]。

表面的脂肪组织的收集网站似乎是另一个重要的供体因素可能影响生存能力和孤立的细胞的扩散。细胞分离的数量相比更加与众不同等人从腹部区域和臀部大腿/区域。他们找到了一个更高频率的ADSCs SVF隔离来自腹部区域,但没有显著差异被发现在有核细胞的绝对数量12]。然而,ADSCs的成骨和chondrogenic分化能力并不影响收获网站(12]。Padoin等人观察到更高的细胞收益率从小腹和大腿内侧比从其他(即吸脂区域。、上腹部、侧面、转子的区域,和膝盖)[13]。生存能力和数量的差异SVF ADSCs培养后的数量,也研究了Tsekouras和同事。在他们的研究中,从大腿外侧SVF表现出更高的细胞数(14]。这种趋势也在随后的细胞继续培养,外部和大腿内侧的样本均显示ADSCs数量高于腹部,腰,膝盖或内部样本。其他研究报告脂肪移植的数量没有明显的统计学差异(15,16]或脂肪细胞生存能力17)根据捐赠者的网站。

不仅在负压抽脂和收获供体也不同的收获过程(18)和其他个人捐赠因素影响生存能力,发现了ADSCs的增殖和分化特征。进一步的因素包括体重指数(BMI)、年龄、性别、并发疾病,如糖尿病,也放射治疗和药物治疗19]。

需要调查和确认最好的收获ADSCs条件,这将有助于把他们在临床实践中常规使用。直到现在,研究尚未统一,一直主要集中在不同的细胞类型(脂肪细胞、preadipocytes总SVF)。ADSCs的潜在差异特征似乎是不可忽视的,需要进一步澄清未来在组织工程中使用。我们的研究的目的是探讨负压的影响也在抽脂和施主能级的最初连接细胞的收益率和随后的细胞增殖,细胞数量,实现细胞生存能力,直径和表型标记孤立ADSCs当培养在体外条件。

2。材料和方法

2.1。捐助者和抽脂手术

比较研究是进行皮下脂肪组织的样本来自15个健康的捐赠者在医院Na Bulovce知情同意后在布拉格。雌性的集团( )和一个男性( )经历了肿起的抽脂,从大腿内侧脂肪组织( ),从大腿外侧( ),从腹部和( )是收获。收获进行了符合赫尔辛基宣言的原则下实验涉及人体组织和伦理道德委员会批准签发医院Na Bulovce在布拉格(2014年8月21日)。抽脂术是在无菌条件下进行,使用肿胀。肿起的解决方案包含一个1000毫升生理溶液与肾上腺素(1:200000)1毫升和碳酸氢盐20毫升的8.4%。为了保护收获基质细胞免受可能的毒性,没有使用局部麻醉药。我们使用吸脂机(MEDELA主导),使连续负压集,我们利用负压-200毫米汞柱和-700毫米汞柱。表面的脂肪组织是收获用科尔曼风格钝插管4孔的内径3毫米。这两个低负压(即。,- - - - - -200 mmHg) and high negative pressure (i.e., -700 mmHg) were used during liposuction in selected harvesting sites for each donor. Specifically, in the abdominal region, low pressure was used on one side of the abdomen, while high pressure was applied on the opposite side of the abdomen. Similarly, in the outer and inner thigh regions, low pressure was applied on one leg and the high pressure was applied on the contralateral leg (Scheme1)。不同套管和真空吸入容器用于低,高压低压收获的收获防止污染材料高压收集材料,反之亦然。捐赠者的年龄范围是26-53年(平均年龄 年)和体重指数范围 (平均体重指数 )(表1)。捐赠者没有患糖尿病或高血压,和他们没有烟草使用者。

2.2。隔离ADSCs

隔离过程中执行新的lipoaspirates(抽脂手术)后2小时内根据埃斯蒂斯隔离协议et al。7]。然而,我们做了一些轻微的修改,如我们之前所述研究[20.]。总之,lipoaspirates洗几次磷酸盐(PBS;Sigma-Aldrich)。然后,lipoaspirate消化,使用含有1%的PBS (wt /卷)牛血清白蛋白(BSA);Sigma-Aldrich)和I型胶原酶0.1% (wt /卷)(沃辛顿)1小时的温度37°C。在消化过程中,组织是离心机,上层和中产层吸气。获得SVF洗了三次。100年一个过滤器与毛孔μm大小(细胞过滤器,BD猎鹰)此外用于筛选的细胞悬液SVF之前播种到培养瓶(75厘米²TPP,瑞士)的密度0.16毫升的原始lipoaspirate /厘米²。孤立的细胞培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM;Gibco),补充(卷/卷)为10%胎牛血清(的边后卫;Gibco)、庆大霉素(40μg / mL;列克),重组人类成纤维细胞生长因子基本(FGF2;10 ng / mL;GenScript)。主要的细胞,称为“通道0”培养,直到他们达到70% -80%的融合。然后,细胞通道。

接下来的实验(计划1),隔绝lipoaspirate收获的细胞在低负压(即。,- - - - - -200 mmHg) are referred to as “low,” and the cells isolated from the lipoaspirate harvested under high negative pressure (i.e., -700 mmHg) are referred to as “high.” The compared groups of cells are referred to as low inner thigh (low I thigh), high inner thigh (high I thigh), low outer thigh (low O thigh), high outer thigh (high O thigh), low abdomen, and high abdomen.

2.3。收益率最初附着的细胞

主文化孤立的细胞,如前所述,播种密度是0.16毫升的原始lipoaspirate /厘米²。隔离和播种后第一天(0)通过新鲜的培养基是改变介质,和独立的细胞被冲走了。然后,细胞产量每毫升lipoaspirate连接细胞的数量计算,因为只有这些细胞在组织工程相关的潜在用途。故事的4到6为每个样本被随机选择的微观领域相差显微镜和被人工细胞计数分析。然后,连接细胞的数量比较根据不同的负压或收集网站。

2.4。细胞数量、可行性、直径和倍增时间

每个捐赠者的细胞,在低和高收获相应的区域内负压的腹部或大腿,被培养,然后分析。通道1中的孤立的细胞被播种到12-well组织培养聚苯乙烯板(TPP,瑞士;直径2.1厘米)的密度14000细胞/厘米²(即。,50,000 cells/well) and were cultivated in DMEM+10% (vol/vol) FBS+10 ng/mL FGF2 for 7 days. The volume of the cell culture medium was 3 mL/well. The cells were cultivated in a humidified air atmosphere with 5% CO₂的温度37°C。1天、3和7,PBS的细胞被洗了,然后被分离与Trypsin-EDTA孵化解决方案(Sigma-Aldrich) 4分钟37°C。Trypsin-EDTA的影响解决方案后来被添加一个中等的边后卫,resuspended细胞。数量、可行性和分离细胞的直径在每个测量使用Vi-CELL XR细胞生存能力分析仪(贝克曼库尔特)。在这个分析器,细胞生存能力评估台盼蓝排斥试验。从5到8个独立样本的每个实验组捐赠在每一个时间间隔进行分析。细胞群体倍增时间(DT)从ADSC数字计算,根据以下方程: ,在哪里代表文化的持续时间,代表细胞的数量在3天,代表细胞的数量在1天。

2.5。细胞线粒体的活动

线粒体酶的活动通常是为了估计测量细胞增殖活动。通道1中的孤立的细胞被播种到24-well组织培养聚苯乙烯板(TPP,瑞士;直径1.5厘米)的密度14000细胞/厘米²(即。,25,000 cells/well) and were cultivated in DMEM+10% FBS+10 ng/mL FGF2 for 7 days. The volume of cell culture medium was 1.5 mL/well. On days 3 and 7, a CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS; Promega Corporation) was performed according to the manufacturer’s protocol. In brief, the principle of the MTS assay is based on a colorimetric change of the yellow tetrazolium salt to brown formazan. This change is brought about by the activity of mitochondrial enzymes. The absorbance was measured at a wavelength of 490 nm, using a VersaMax ELISA microplate reader (Molecular Devices LLC). From 5 to 6 independent samples were measured for each experimental group in each time interval.

2.6。流式细胞术

通道2,细胞的特点是流式细胞术,使用特定的表面抗体CD标记。评估是由人口的百分比细胞含有ADSCs的标准标记,即。CD105(也称为endoglin膜糖蛋白TGF -的一部分β受体复杂),CD90 (Thy-1胸腺细胞抗原属于免疫球蛋白超家族),和CD73 (ecto-5 - - - - - -核苷酸酶,glycosylphosphatidylinositol-anchored膜蛋白)。其他评价指标包括CD29(整合素β₁、胶原蛋白、纤粘连蛋白受体)的一个组成部分,CD146(黑色素瘤细胞粘附分子,层粘连蛋白受体),CD31(也称为platelet-endothelial细胞粘附molecule-1 PECAM-1),和造血细胞CD34、CD45标记3]。总之,这些细胞被洗PBS和孵化了Trypsin-EDTA 4分钟37°C。随后,媒介的边后卫添加和细胞离心(5分钟,300克)。上层清液的向往,和细胞resuspended PBS (wt /卷)为0.5% BSA (Sigma-Aldrich)。这些细胞被同样分为整除(即。250000细胞/整除)。Alexa647 Alexa488 FITC -————,或PE-conjugated单克隆抗体,即。,against CD105, CD45 (Exbio Praha), CD90 (BD Biosciences), CD73, CD146, CD31 (BioLegend), CD29 and CD34 (Invitrogen), were added separately into aliquots. The aliquots were incubated with the antibodies for 30 minutes at 4°C in dark conditions. Next, the stained cells were washed three times with PBS with 0.5% (wt/vol) BSA and were analysed with the Accuri C6 Flow Cytometer System (BD Biosciences). In each aliquot, 20,000 events were recorded for each CD surface marker.

2.7。显微技术

相差显微镜检查是用来想象依恋的过程中,传播,经济增长在本机ADSCs隔离(通道0)。CD表面标记的免疫荧光染色法进行本地秉承ADSCs(2)通过使用PE-CD90 (BD科学)和Alexa488-CD29(表达载体)抗体。细胞核与赫斯特33342年原生细胞复染色(Sigma-Aldrich) 30分钟在黑暗中在室温下。奥林巴斯显微镜IX71(目标放大10或20 x)被用来代表图像。

2.8。统计分析

首先,评价的意义不同的负面压力,观察到的数据(即。,initial cell yields, later cell numbers, and mitochondrial activity) were presented as the ratio of low-pressure cells to high-pressure cells for each donor. The Mann-Whitney Rank Sum test was used to test the equality of the medians of the ratios on different days of the experiment. Second, an unpaired two-sample - - - - - -测试参数(数据)或Mann-Whitney秩和检验(非参数数据)被用来测试的意义之间的差异外大腿和腹部区域。大腿内侧区域与其他收获相比没有统计学上网站由于相对较小的样本组(即。,从只有3例)。所有的测量数据都是根据Kolmogorov-Smirnov测试测试正常。数据显示一个高斯分布表示为 。然而,由于小样本大小和捐助者之间的广泛分散的数据没有显示一个高斯分布。非参数的数据表示为中间值和四分位范围(智商范围)。统计分析使用SigmaStat软件(美国Systat软件有限公司); (流式细胞术) (对于所有其他方法)被认为是具有统计学意义。的情节生成R(编程语言)。

3所示。结果

3.1。分离后的细胞和细胞产量增长

在通道0,我们观察到轻微的差异的范围中细胞粘附和生长细胞是从不同的捐赠者。然而,细胞从所有捐助者通常达到70%或80%融合到第十天。图1显示代表图像的粘附和生长的过程在ADSCs隔离来自同一个病人。第一天隔离后,连接细胞的数量每毫升lipoaspirate计算每个样本。连接低压细胞连接高压细胞的比例为每一个捐赠者显示平均水平接近1.0大腿外地区,这意味着同样数量的压力(图连接细胞2(一个))。然而,这个比例的平均水平(0.79)显著降低腹部地区(图2(一个)),这表明更高的细胞收益率从高压lipoaspirates这收获的网站。我们观察到显著高2倍或三倍数量的附加细胞外大腿区域比从腹部区域(图2 (b))。大腿内侧区域与其他收获相比没有统计学上网站由于相对较小的样本。

3.2。手机号

细胞的数量获得相应地区的下腹部或大腿低负压和在高负压同一供体测量天1,3,7。低压细胞的数量比高压细胞的数量在一个特定的文化从每个捐赠者显示平均水平1.0附近细胞从大腿内侧,外侧大腿,腹部区域(图3)。没有统计学差异在细胞外大腿和腹部之间的数天1和3(图4)。当组织的细胞从大腿内侧和外侧大腿一起进行评估,我们观察到细胞数量在大腿ADSCs高于腹部ADSCs ( )7天(图4)。

3.3。倍增时间

天1和3之间的计算倍增时间(即。细胞培养48小时)。有相似的中间值在所有样本组,从24.99小时(低腹部)(高大腿内侧)(图28.65小时5)。观察样品组之间无显著差异。

3.4。可行性和直径

没有发现显著差异在细胞的可行性,以台盼蓝排斥试验来衡量,在第一天(从88.0%低93.6%腹部低外大腿),3天(从93.5%高腹部为96.6%外大腿),并在7天(从90.3%高大腿内侧为95.9%外大腿)(表2)。我们观察到显著外大腿ADSCs直径比腹部ADSCs ( )在第一天。然而,直径无显著差异观察3天,7天(表3)。

3.5。细胞线粒体的活动

在ADSCs线粒体酶的活动,认为是细胞增殖活动的一个间接指标,测量在播种后3至7天。线粒体活动的比例的低压细胞线粒体活动的高压细胞在特定的一天从每个捐赠者文化显示平均水平1.0附近细胞从大腿内侧,外侧大腿,和腹部地区,而且没有观察到显著差异低压电池和高压之间的细胞(图6)。同样,没有明显差异在细胞的线粒体活动从不同的捐赠站点3天(表4)。7天,我们观察到线粒体活动的大腿内侧ADSCs倾向低于其他收获网站;但是,没有进行统计分析由于样本量相对较小。

3.6。流式细胞术

细胞的百分比为典型的间充质基质细胞标记阳性,即。,CD105,CD90,CD73,和CD29,was very high in ADSCs obtained from all tested sources. No significant differences were found in the presence of these markers in cells obtained from lipoaspirates taken at different negative pressures and from different harvesting sites (Table5)。然而,略低和更多的变量值获得abdomen-derived ADSCs。代表图像CD90、CD29疣状图所示7 (b)。我们还观察到在CD146的百分比变化⁺细胞在捐助者(从3.9%低大腿内侧和低外大腿10.9%低腹部)(图7(一))。这种可变性在从腹部地区ADSCs略高,不依赖于负压。细胞的百分比轴承造血和内皮细胞标记,即,CD34、CD45、CD31非常低,显示细胞之间没有显著差异在不同的负面压力,获得不同的捐赠站点(表5)。

4所示。讨论

执行一组实验揭示负压的影响和收集网站上的孤立ADSCs捐助者的特点。为未来使用在组织工程中,我们感兴趣的主要是基本的粘附和生长特性的显著差异ADSCs隔离后在通道1和2。我们的研究提供了一个机会来比较孤立的细胞从同一地形区域,收获在低负压和在高负压从每个捐赠者。在通道0,我们观察到细微的差异在附件和传播的速度和增长的捐赠者的ADSCs细胞被孤立。这些初始interdonor差异可能是由于不同的ADSC的频率获得SVF细胞。ADSCs变化频率,由一个克隆形成单位试验和/或限制稀释试验,发现脂肪组织中收获从各种捐助网站(12)或当使用不同的收获过程(21]。具体来说,更加与众不同等人观察到的频率明显高于ADSCs从脂肪组织分离收获从腹部地区比从臀部大腿/地区12]。Oedayrajsingh-Varma等人观察到的频率显著高于ADSCs从脂肪组织分离获得的切除和肿起的吸脂比从组织得到ultrasound-assisted抽脂(21]。在这些研究中,绝对的有核细胞数收获脂肪组织和可行的细胞间质血管的数量比例不受解剖网站或通过外科手术的类型。然而,在其他的研究中,解剖网站确实会影响总SVF ADSC的收益率。Iyyanki等人观察到总SVF更高收益率的腹部收获比从侧面和腋窝收获网站网站;然而,ADSC收益率没有显著差异(18]。弗雷泽在研究et al ., abdomen-adipocyte收益率比hip-adipocyte收益率高出1.7倍,和显示的脂肪细胞产量大[donor-to-donor可变性22]。然而,无论是有核细胞产量还是preadipocyte收益率显著不同(22]。大范围的ADSC捐助者之间的收益率也观察到,也没有统计之间的差异被发现腹部,大腿和乳房区域(21]。相比之下,我们的研究显示收集网站的潜在影响,当我们观察到更多的附加细胞每毫升lipoaspirate大腿外侧区域比腹部区域隔离后1天在体外文化。不同的结果关于收集网站对细胞的影响收益率可能获得的,因为不同的靶细胞的数量在不同的论文被研究。整形手术的目的,细胞产量所有有核细胞,脂肪细胞,preadipocytes, SVF也是一个感兴趣的主题。然而,组织工程的附着ADSCs更侧重于收益率可以进一步扩散和/或分化。

收获细胞的总数也可以影响负压抽脂过程期间使用。在研究Mojallal et al .,较低的负压抽脂期间(-350毫米汞柱)导致SVF收益率高于高负压(-700毫米汞柱)10]。同样,在最近的一项研究Cheriyan et al .,高数和高生存能力上发现的脂肪细胞lipoaspirates获得较低负压(-250毫米汞柱)比高负压(-760毫米汞柱)23]。然而,这些研究只进行三个病人。在我们的研究中,在细胞的数量在低收入和高压的隔离是类似的细胞从大腿外侧区域,而腹部地区的特点是高初始连接细胞产量高的压力。

虽然最初SVF收益率、脂肪细胞产量和ADSC lipoaspirates的频率也各不相同,以后期间的差异在体外ADSC培养我们特别感兴趣的。我们的研究集中在数量,线粒体活动,并在随后的使ADSCs的可行性。我们观察到相似的细胞数量和线粒体活动独立于低收入和高阴性压力为一个特定的地区。这意味着随后的扩散ADSCs并不影响负压抽脂过程期间使用。陈等人最初观察到更高的增殖活动(评估细胞计数Kit-8)在低负压SVF细胞比在高负压SVF细胞从通道1和2的腹部11]。然而,这些显著差异并没有出现在通道3 (11]。同样,我们的结果也可能提供支持的理论差异在低压和高压细胞增殖活动期间使后变得不那么明显在体外种植。有趣的是,其他研究人员报道,不同的设备和不同级别的负压抽脂期间不影响百分比和脂肪细胞的可行性和孤立的间充质基质细胞9]。之间的差异比较研究也可能出现,因为不同的细胞群被研究。即负压技术对脂肪细胞可能有更大的影响,因为他们更大的规模,尽管他们可能只有最小影响较小的细胞,包括祖细胞(22]。因此有必要仔细考虑哪些类型的脂肪组织细胞收获和使用。在我们的研究中,大腿外侧ADSCs直径更大的细胞悬液后第一天比腹部ADSCs播种。然而,类似的细胞直径3至7天。

功能和细胞类型的代表性的脂肪组织中不同地形区域。Preadipocytes ADSCs从皮下、肠系膜、网膜的,或胸内的脂肪仓库显示不同的表达谱和分化能力(24,25]。皮下脂肪仓库更容易获得比其他脂肪仓库。尽管皮下和内脏脂肪的形态没有明显不同,显示的收获皮下ADSCs明显高于细胞数量,倍增时间短,对内脏ADSCs CD146的表达高于在后面的段落(26]。此外,内皮下仓库,肤浅的仓库似乎具备干细胞和multipotency特征的细胞比深层皮下仓库(27]。直到现在,收获的脂肪仓库通常是选择实际需要的基础上或选择。然而,特定的解剖的脂肪组织来源获取可以在进一步的整形外科手术中发挥作用和细胞疗法。从不同的脂肪细胞仓库表达不同同源框Hox基因。这支持不同的胚胎起源,所以捐赠者和宿主脂肪组织网站需要仔细匹配(28]。Kouidhi等人相比,人类的基因表达与下巴膝盖ADSCs ADSCs [29日]。他们发现更多的增强表达Pax3(即。,a neural crest marker) in chin ADSCs than in knee ADSCs, whereas the expression of most of the Hox genes that are typical for the mesodermal environment was higher in knee ADSCs than in chin ADSCs. In later passages, chin ADSCs also displayed higher self-renewal potential [29日]。在我们的研究中,我们获得了类似的数字和类似的可行性ADSCs从大腿内侧,大腿外侧区,腹部地区天1和3。因此,我们的结果是按照其他研究人员的研究中也发现类似的增长动力学ADSCs从腹部大腿和臀部/地区(12,30.]。然而,类似的细胞数天1和3,我们观察到一种倾向的大腿ADSCs(大腿内侧+外大腿)达到值高于腹部ADSCs 7天( )。因此看来,可能会有显著差异在以后的两个手机号码获取站点之间的病人包括在我们的研究中,我们观察到大捐助者之间的变化。有趣的是,我们还观察到一个倾向降低线粒体的活性比外层ADSCs大腿和腹部的大腿内侧ADSCs ADSCs 7天。这些结果可能与更高的细胞数量的大腿内侧ADSCs 7天,当细胞已经达到融合,减少了扩散活动。然而,较少的大腿内侧ADSC样品比其他组的情况下(即。、外大腿ADSCs和腹部ADSC)也可能影响结果。收集网站也可以影响克隆形成单位(CFU) ADSCs孤立。弗雷泽等人发现在臀部ADSCs CFU是高于腹部ADSCs [22]。这一发现可以按照更高的臀部大腿/ ADSCs增殖率在以后的时间间隔的文化22]。

在我们的实验中,我们观察到一个非参数分布的捐赠者的数据。不依赖于interdonor可变性收获网站或负压可能是由其他捐赠者的因素引起的。年龄和体重指数是已知的其他因素发挥相当大的作用在SVF ADSC收益率和特征(19]。然而,关于年龄和体重指数的影响研究发现ADSC收益率往往是矛盾的(31日- - - - - -33]。例如,在研究de Girolamo et al .,细胞产量ADSCs年长的病人明显大于从年轻的病人31日),而在研究修梅克et al .,病人的年龄似乎不影响细胞产生32]。重大donor-to-donor可变性也报告了multilineage分化能力,自我更新能力,和免疫调节细胞因子的分泌34]。虽然可以解释这些可变性的乳腺癌病史和随后的治疗,捐助者之间也有显著差异那些没有被诊断出患有癌症34]。动脉粥样硬化是另一个检查参与组成分泌腺供体因素可以改变和减少ADSCs由于线粒体功能受损的免疫调节能力(35]。此外,ADSCs孤立肾血管性疾病患者表现出更高层次的DNA损伤和迁徙能力低于ADSCs从健康的捐赠者36]。在另一项研究中,ADSCs孤立从硬皮病患者,一种自身免疫性结缔组织病,显示较低的扩散率和迁移能力低于控制ADSCs从健康的捐赠者37]。

许多报纸已经报道了各种donor-to-donor产生潜在影响因素间充质基质细胞的特点。此外,似乎有很多细胞间差异在同一个捐赠者。这可以体现两个细胞间的异质性在体外和在活的有机体内interclonal功能和分子变异,如变量分化能力,现有的快速增长和增长缓慢的克隆,和其他的差异蛋白质组和转录组38]。各种克隆msc的百分比在细胞使发展和变化。即使在一个MSC克隆,有越来越多的证据表明,intraclonal异质性改变细胞的行为和特点38]。

在大多数捐助者,我们证明了一个高水平的积极性的孤立的细胞CD105, CD90、CD73,和CD29 ADSCs(> 80%)和低水平的积极与否CD45, CD31、和CD33 ADSCs(≤2%),根据指南描述ADSCs [39]。我们观察到无显著差异的存在CD标记根据负压或收获。我们的结果是按照那些被其他研究人员报道,他们没有发现差异CD标记SVF收获从不同的站点12,14,30.]。在另一项研究中,对在场的情况下,祖内皮细胞,SVF preadipocyte细胞和间充质细胞不会受到不同的负面压力9]。此外,Chen等人的研究,在高负压对产量有负面影响,对经济增长,生长因子的分泌,没有发现差异CD标记(11]。有趣的是,我们观察到变化中CD146捐助者的存在。CD146的存在⁺细胞皮下仓库也不容忽视的一项研究李et al。26]。CD146积极性可以周的标志。细胞在接触小血管周围的周脂肪组织,他们也存在于收获SVF [40]。周皮细胞的起源并不是唯一可能的解释。审查的其他理论解释CD146的存在,看到41]。在msc,高CD146的表达与承诺对血管平滑肌细胞谱系(42]。这对血管组织工程承诺可能是有趣的,当区分ADSCs对血管平滑肌细胞是必需的。CD146⁺细胞结合人类脐静脉内皮细胞也报道支持(通过传代形成细胞的形成和伸长capillary-like管状结构(26]。李等人也观察到大CD146扩散⁺细胞比CD146^{- - - - - -}细胞;然而,CD146的百分比⁺与后续接种(ADSC文化细胞减少26]。似乎CD146表达ADSCs相对异构的和可能发挥重要作用在特定的组织工程的应用潜力。其他造血和内皮细胞标记物的存在(例如,CD34、CD45和CD31)可以影响未来疗法使用SVF或ADSCs。最优的比例ADSCs造血干细胞和祖细胞在孤立SVF定义为特定的CD表面标记似乎成功的干细胞疗法的关键(43]。

4.1。限制

第一个限制我们的研究是相对比较小的样本大小,与不均匀的样品数量从每个施主能级(即。大腿内侧( ),外大腿( ),和腹部( ))。由于大腿内侧的最小样本量ADSCs,我们没有做一个统计对比这群细胞和外ADSCs大腿或腹部ADSCs。更多的捐助者将是可取的。然而,我们假设下的ADSC表征在体外文化条件和后组织工程目的,样本大小就足够了。

第二个限制的研究主要是集中在负压和收获网站而不是其他病人因素,如年龄、性别、或体重指数;这些其他特征因此捐助者之间的不完全统一。然而,研究小组显示类似的年龄和体重指数与正常数据分布参数。

第三个研究的局限性是它关注ADSCs以后使用的组织工程。因此,我们只有孤立的部分特征ADSCs坚持塑料培养瓶。ADSCs的收益率计算之后坚持烧瓶,及其特征(表面标记的细胞增殖,流式细胞术分析)研究了在随后的段落。没有其他细胞类型(即。,adipocytes or all nucleated cells) were analysed in this study with respect to their yields or their viability. The conclusions concerning the influence of negative pressure and harvesting site therefore refer only to plastic-adherent ADSCs.

ADSCs的描述在体外文化条件,我们选择通道1和通道2根据具体分析。这些段落分析ADSCs是相同的。然而,细胞的增长动力从通道的变化而变化,这变化也可以具体在每个孤立的ADSC人口。

5。结论

在我们的研究中,我们观察到一个明显高于最初连接细胞的数量每毫升的lipoaspirate外大腿区域比腹部区域隔离后1天。不同负压的关键决定因素不是细胞大腿外地区的收益率,而高负压有积极影响细胞腹部地区的产量。然而,对于后续的培养,没有明显的特征之间的关系被确认孤立ADSCs和负压吸脂手术期间使用的水平。此外,收集站点ADSCs只有轻微影响在某些参数对文化的特定日子(即。,diameter on day 1). In general, no significant influence of the harvesting site was observed on the cell number, mitochondrial activity, viability, diameter, or on the presence of CD markers. These thigh ADSCs reached a higher cell number than for abdomen ADSCs on day 7 only in cases where cells from the inner thigh and outer thigh areas were evaluated together. However, we observed donor-to-donor variability in initial adhesion, in absolute cell numbers, and in the expression of some CD markers. Thus, our results could suggest that donor-to-donor differences may be affected not only by the harvesting site and by negative pressure but also by other factors. For subsequent在体外培养和使用在组织工程中,似乎收获站点和负压的水平没有一个关键或限制对基本ADSC特征的影响。然而,有必要进行彻底调查的该地区ADSCs要收获和特定的抽脂手术,参照脂肪组织的目的被收获。

缩写

ADSC:	脂肪tissue-derived基质细胞
伴着:	骨髓间充质基质细胞
体重指数:	身体质量指数
BSA:	牛血清白蛋白
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
DT:	倍增时间
的边后卫:	胎牛血清
FGF2:	纤维母细胞生长因子基本
智商范围:	四分位范围
硕士:	间充质基质细胞
SVF:	间质血管分数。

数据可用性

数据可以从相应的作者要求合理的请求。

伦理批准

这项研究是经医院伦理委员会批准Na Bulovce在布拉格(2014年8月21日)。没有动物被用于这项研究。

同意

所有的参与者在研究了明智的书面同意。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢马丁•Parizek博士(本月杂志。),他的技术援助和Jan Travnicek博士在布拉格(捷克技术大学),进行磋商的使用R(编程语言)和情节设计。罗宾·希利先生在布拉格(捷克技术大学)是感激地承认他的语言修改的手稿。这项工作是由查尔斯大学授予机构(GAUK,项目没有。642217),由教育部、青年和体育的捷克共和国LQ1604国家可持续发展项目二世(BIOCEV-FAR项目),由捷克和健康研究委员会、卫生部捷克共和国(批准号15 - 33018 - a)。

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