层粘连蛋白作为大规模扩张的衬底的人类诱导多能干细胞在一个封闭的细胞扩张系统

文摘

工程所需的高质量的细胞数量一个成年人无异生物人工器官大于十亿。直到诱导多能干细胞的出现(万能),这种大小和所需的自体的细胞来源复杂性并不可用。这个数字增长的细胞在传统的二维细胞培养系统需要大量的时间、资源和精力,并不总是满足临床需求。使用一个封闭的细胞培养系统是一种有效的和临床适用的方法,可以用来扩大受控条件下的细胞。我们旨在使用量子细胞扩张系统(q)作为iPSC monolayer-based扩张系统。人类则是扩大(14)使用q在两个不同的涂料(层粘连蛋白521 (LN521)和vitronectin (VN)),并进行核型分析。自发的分化和多能性的细胞特征rt - pcr和流式细胞术。我们的结果证明了量化宽松政策提供了必要的环境指数iPSC增长,达到689.75×10⁶±86.88×10⁶在不到7天使用LN521涂层人口翻倍水平的3.80±0.19。相同的结果VN被用作涂料时没有被观察到。细胞维持正常核型(46-XX),表达多能性标记(OCT4、NANOG LIN28, SOX2, REX1, DPPA4,节点,TDGFb, TERT3,和GDF),并表示OCT4、SOX2, NANOG, SSEA4 TRA1-60, tra1 - 81。自发分化成外胚层(巢蛋白、TUBB3 NEFH),中胚层(MSX1 BMP4, T)和内胚层(GATA6,法新社和SOX17)血统被rt - pcr检测与涂层系统。我们得出这样的结论:万能的问维护具备干细胞,是一种很有前途的平台来提供所需的细胞数量recellularize小无异器官支架用于临床。

1。介绍

生物工程整个人体大小的器官需要数十亿的细胞,它可以很难获得在实验室设置(1]。传统的二维(2 d)细胞培养系统,贴壁细胞flask-based文化或多层细胞工厂,需要集中时间、资源、人员、和努力。此外,它使用开放的处理步骤,增加微生物污染的风险和排除临床使用。

标准的培养多能干细胞已经被认为发生在2 d feeder-dependent或feeder-free系统。多个组有讲究的人类已经被暂停扩大他们的生产(2- - - - - -5]。各种生物反应器系统已经开发,培养细胞微载体(6),水凝胶(7),或在三维(3 d)聚合8]。这些技术目前的利益,如表面细胞粘附和增长领域,增加和减少细胞的异质性文化环境(9,10]。目前,有几种类型的微载体可用变量细胞依附属性PSC文化(11]。在这些文化的条件下,多个通道后,细胞维持多能性和正常核型(12,13),可以很容易地冻结和解冻14),增殖在6天(超过10倍11,13]。然而,必须手动交换媒介,这就增加了污染的风险。

大规模的扩张已经在一个健壮的、定义良好的,和监控过程是必不可少的治疗和工业应用3]。量子细胞扩张系统(q)(作秀的旅级战斗队)提供了一个自动的,功能上封闭的细胞培养系统和可定制的设置上,收获种子、饲料、和附着和悬浮细胞。问是一个集成的系统,提供孵化、天然气供应、管理和流体处理的细胞中空纤维生物反应器。

在过去,细胞衍生支线层系统被用来扩大已经同时保持他们的多能性15- - - - - -17]。取代feeder-dependent文化系统,几个矩阵测试了涂层板和微载体在PSC扩张。这feeder-free条件是关键在维持细胞的表型。基底膜基质™,最常见的涂料解决方案中所描述的文学,通常在室温下聚合(RT) (11,18- - - - - -20.),但各种基质如vitronectin (VN) [21)、层粘连蛋白(LN) [22,23),和合成聚合物或共轭肽(24- - - - - -27也为培养已经被报道在2 d或3 d系统。然而,由于涂料在问发生一系列34°-40°C,基底膜基质™不是首选衬底,因为它可能会过程中聚合,形成凝胶,从而无效的完整使用中空纤维生物反应器。更重要的是,人工基底膜来源于Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤细胞(28),这也就排除了其临床使用。在目前的研究中,我们评估两种基质(LN和VN) xeno-free条件下培养细胞培养方法,支持扩大细胞的临床应用。

我们建立了一个封闭的功能系统,扩大生产提供了必要的环境人类诱导多能干细胞(hiPSCs),同时保持其具备干细胞。我们还表明,层粘连蛋白521 (LN521)是一个更高效的涂层比问VN中空纤维系统,导致可行hiPSCs产量更大。所有参数比较标准的PSC培养条件(基底膜基质™)。

2。材料和方法

2.1。文化在文化和维护hiPSCs菜肴

hiPSCs (SCVI273)用于本研究请捐赠Joseph Wu的实验室(斯坦福大学医学、医学和放射学、斯坦福CVI生物)。短暂,收集外周血单核细胞从一个健康的捐赠者,和hiPSCs生成使用nonintegrative仙台病毒系统。

在细胞培养和维护feeder-free system-hESC-qualified基底膜基质™(康宁)和TeSR1™E8™(干细胞技术有限公司、剑桥、MA)标准的文化条件下(37°C公司5%₂)。简单地说,我们与基底膜基质涂层100毫米培养皿™为至少1小时37°C和镀1×10⁵细胞TeSR™E8™媒体补充岩石抑制剂y - 27632 (10μ米,写明ATCC) 24小时。岩石抑制剂用于提高细胞生存通过防止dissociation-induced细胞凋亡(女性)。媒体每天改变,使用细胞的细胞通过分裂重组酶解TrypLE™表达(Gibco)。可行的细胞与锥虫蓝染色测定和血细胞计数器计数。

2.2。量子系统细胞扩张

量子系统是一个一次性无菌细胞扩张,封闭的功能组成的网络由中空纤维生物反应器;气体传输模块;intracapillary循环回路;extracapillary循环回路;四个压力舱;五个入口线;和收获。每个问11500中空纤维(200μ米直径/纤维)和总表面积21000厘米²。中空纤维是由3聚合物(PAES、PVP和PA),毛孔同质的整个生物反应器内部分发解决方案。孔隙大小过滤传入的试剂的分子量,允许小分子很容易进入生物反应器相比,高分子量分子。每个细胞扩张组设在一个控制台,允许控制的intracapillary循环,extracapillary循环,气体交换。细胞通常加载到中空纤维后涂上合适的衬底。

2.3。hiPSCs文化在量子系统的扩张

加载hiPSCs之前,文化表面积intracapillary中空纤维的生物反应器使用下列xeno-free之一的涂料涂层矩阵:人类重组LN521 (5μg / ml, BioLamina,斯德哥尔摩,瑞典)和VN (Vitronectin XF Primorigen™, 10μg / ml,干细胞技术有限公司)。中空纤维表面被涂了至少4小时。细胞被加载到生物反应器在未来保持密度×10⁶细胞在100毫升TeSR™E8™媒体和y - 27632 (10μ米)。旋转生物反应器是创建统一的悬架和均匀分布的细胞之前附件在静态条件下(图1)。这种细胞密度与我们最初播种密度在100毫米培养皿(~ 20000个细胞/厘米²)。24小时后,我们开始媒体灌注在0.1 ml / min,逐步提高利率以应对乳酸水平根据制造商的建议。每天,乳酸水平测量(乳酸+新星生物医学)。人类则在100毫米培养皿培养孵化器(37°C, 5%有限公司₂)被用作控制。

2.4。收获hiPSCs在量子系统的扩张

细胞收获时预测细胞的数量到达了一个高原。青藏高原是评估使用制造商的问模板,计算细胞数量的预测基于乳酸生产一段时间后,根据以下公式: ,在哪里预测的细胞的数量;是大量的乳酸生产(更易);是时间的变化(天);和是参考生产速度(更易/天/单元)。的确定使用plate-based实验,相关的细胞数量和乳酸水平。

200毫升的收获过程执行TrypLE™表达8分钟后跟两个洗与磷酸盐(PBS)(图1)。收集所有细胞收获袋和转移到500毫升管,和样本用台盼蓝染色的,计算血细胞计数器。

细胞在300×g离心5分钟和冷冻10%二甲亚砜(DMSO,σ)和胎牛血清在3毫升cryovials (15×10⁶细胞/瓶)。

2.5。核型分析

人类则是由标准细胞生成的程序使用GTG-banding核型的方法。0.05细胞治疗μ克/毫升KaryoMAX®秋水仙胺™解决方案(技术)在TeSR™E8™媒体3小时然后分离,放置在一个低渗的治疗0.057氯化钾,并固定在甲醇和醋酸。GTG-banding是由分子细胞遗传学工具,MD安德森癌症中心,休斯顿,TX,据ISCN [29日]。

2.6。分化的潜力hiPSC

自发分化为三个胚胎胚芽层,hiPSCs问收获,培养在超低附件6-well板块(康宁)形成拟胚体(EBs)。7天EBs在悬浮培养的37°C和5%的公司₂包含DMEM / F12基础培养基,20%击倒™血清更换,4毫米谷氨酰胺,MEM非必需氨基酸1%,55毫米2-mercaptoethanol (Gibco)。这之后,EBs转移回附着板和培养另一个与基底媒体(7天30.]。分化细胞被rt - pcr分析。

2.7。rt - pcr

RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)和总RNA是量化NanoDrop分光光度计。反转录都使用了高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司™)根据制造商的指示。PCR扩增,铂金™绿色热启动PCR大师混合工具包(英杰公司™)使用。PCR产品被在琼脂糖凝胶电泳分析。

给出了所用引物表的列表1。

2.8。流式细胞术

细胞收获从问固定和permeabilized使用BD Cytofix / Cytoperm™装备,根据制造商的指示。简单地说,细胞resuspended, 250年孵化μl BD Cytofix / Cytoperm 20分钟解决方案在4°C,离心后(300 g×5分钟),这些细胞被resuspended BD烫/清洗缓冲在4°C为30分钟。细胞被沾Alexa萤石®488鼠标anti-Oct3/4, PE鼠标反Nanog, Alexa萤石®647鼠标anti-Sox2, PE鼠标anti-SSEA-4 FITC鼠标反TRA-1-60和Alexa萤石®647鼠标反交易- 1 - 81 (BD)。同形像统计图作为消极的控制。样品使用BD LSRFortessa和FlowJo v10软件进行了分析。

2.9。人口增加了一倍

人口翻番水平(PDL)是使用以下公式计算: ,在哪里是收获细胞的数量是种子细胞的数量31日]。我们使用了来表示的总次数hiPSC问扩张期间人口翻了一番。

2.10。统计分析

数据显示为平均值±标准偏差。对比LN521 VN使用学生的执行t以及或双向方差分析根据的必要性,和 被认为是显著的。GraphPad棱镜®软件,版本7.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国),用于统计分析。我们执行3生物复制扩张使用VN涂层和4生物复制扩张LN521涂层。

3所示。结果

选择更好的为我们的中空纤维基质问结合TeSR™E8™媒体,我们测试和比较两种不同的涂料:LN521和VN。关闭细胞扩张系统的一个关键的步骤是确定适当的时间收获细胞,因为它是不可能看到细胞的形态和confluency。为了解决这个问题,我们使用了两个代理人来定义最优时间收获:(1)控制盘:细胞培养常规细胞扩张系统(细胞板有限公司₂孵化器)和(2)的乳酸水平媒体问。在开始问扩张之前,我们传统的细胞培养细胞扩张系统,测量了乳酸水平,量化细胞的数量获得后5天。使用这些数字,我们创建了一个表与细胞的总数和乳酸水平相关。根据这个表格,我们可以预测生物反应器内的细胞的数量通过测量乳酸水平。这种技术是成功的,和预测数量的细胞类似于我们的收获(图后计数2(一个))。

扩大后的问,hiPSCs连接(图2 (b)典型的PSC形态)和维护,与圆形的殖民地,定义边界和高nucleus-to-cytoplasm比率在这两个表面组织培养菜(图2 (c)),基于标准的报告于et al。16]。在中空纤维问涂LN521,我们观察到一个hiPSCs的指数增长,从49.32×10⁶±5.75×10⁶细胞和完成为689.75×10⁶±86.88×10⁶在6/7日( )。这不是观察到当我们镀膜中空纤维问VN(从44.10×10⁶±4.84×10⁶细胞和完成为59.7×10⁶±13.93×10⁶在8/9天, )(数据2(一个)和2 (d))。类似的增长模式是观察到当我们培养第二个hiPSC线(acs - 1030,写明ATCC) LN521(5.17倍)相比VN(1.4倍;见补充图1)。尽管细胞接收同样体积的介质(LN521 4.76±0.67 l vs . VN 4.14±1.17 l)(图2 (e)),hiPSC LN521有显著较高的自由人民党(图2 (f)VN相比)(3.80±0.19和0.36±0.46 )。即使有一个额外的3天在问和媒体流量增加(0.43±0.15和7天10 0.80±0.34 ml / min),细胞VN没有增加自由人民党(数字2 (d),2 (e),2 (f))。

样本的细胞收集之前和之后的每一个问扩张核型分析和PCR分析。后问扩张对基质,细胞维持正常核型(46-XX)(图2 (g))和他们的多能性(图3(一个)),类似于与标准培养系统的影响(组织培养皿中涂层与基底膜基质™),尽管增长的差异。

来验证这些发现,收获后hiPSCs问,我们执行immunophenotyping为多能性标记流式细胞术。我们观察到的高表达OCT4 (VN LN521: 97.2%: 97.9%, CTRL: 94.3%), NANOG (VN LN521: 93.3%: 99.1%, CTRL: 75.8%), SOX2 (VN LN521: 97.6%: 99.6%, CTRL: 99.9%), SSEA4 (VN LN521: 100%: 100%, CTRL: 100%), TRA1-60 (VN LN521: 97.6%: 98.6%, CTRL: 97.1%),和tra1 - 81 (VN LN521: 97.5%: 99.7%, CTRL: 99.3%)问扩张后的细胞在基质和细胞生长的标准培养系统(图3 (b))。

自发分化是在14日协议执行。问的hiPSCs收获LN521和VN条件下培养7天的暂停。我们观察到细胞聚集的形成,EBs,圆形形状和边界(图定义的4(a))。镀后7天,我们和培育的细胞一个额外的7天,观察细胞迁移从EBs组织培养皿(图4(b))。rt - pcr进行,这证明了所有三个生殖细胞layers-ectoderm (TUBB3,巢蛋白和NEFH),中胚层(MSX1 T和BMP4),和内胚层GATA6,法新社,SOX17已经呈现(图4(c)),提供额外的证据后细胞多能性问扩张。

4所示。讨论

在这项研究中,我们报告一个封闭系统的使用可再生的大规模扩张hiPSCs具备干细胞,同时保持和生存能力,在hiPSC领域迈进了一大步。

在过去的几年中,生物学家们努力建立和优化更加一致和安全的PSC文化系统,维持细胞表型,同时允许指数扩张,不管已经的来源。在传统的2 d文化系统中,只有大约1000万个细胞可以获得每100毫米板。扩大生产来生成所需的数十亿的细胞组织工程用这个标准文化条件既耗时、耗资源,是不切实际的。因此,三维细胞培养条件常常被用于扩大PSC生产(9,10,32,33),包括那些依靠悬挂,水凝胶或脚手架策略在搅拌或搅拌4,7,12,34]。尽管这些方法有吸引力的方面,培养已经在这些系统成为挑战如果细胞形成团聚体或设置在3 d环境中。前生成一个异构微环境有限扩散溶性因素,在养分梯度交付,和异构氧化和pH值,而后者使可行的收获/恢复非常困难。这种不受控制的3 d环境可能导致细胞的分化和/或损失,由于搅拌,可以妥协细胞生存能力和限制细胞膨胀率(35]。

可以使用微载体悬浮生物反应器系统(PSC扩张36- - - - - -38]。使用一个实际上电纺聚已酸内酯纤维系统,Leino et al。36在3 d环境中已经被扩大。作者观察到同质的文化环境和细胞多能性维护。然而,细胞没有增殖播种密度低时使用,不能脱离系统在不影响细胞的生存能力由于纤维的孔隙度。虽然这些系统维护具备干细胞的细胞,他们施加珠搅拌细胞产生的负面影响,包括细胞分离的风险增加9,32,36]。然而,较低的搅拌速度妥协营养交换,导致更大的聚集,难以分离。

stirred-suspension生物反应器系统的另一个选择细胞大量扩张。通过使用这种Krawetz et al。19)能够扩大hPSCs 9-12-fold。然而,作者描述了一个额外的通道的必要性(适应通道)来达到这种增长模式,需要将雷帕霉素添加到媒体报道以保证细胞生存和未分化表型。使用一个类似的系统,孟et al。13hiPSCs)描述了一种解释,但他们需要优化接种条件、播种密度、总大小、搅拌速度,并为每一个细胞系细胞使方法在这项研究中,使用限制扩张的再现性。

在这里,我们使用了问2 d细胞培养系统地扩大hiPSCs同时保持具备干细胞。在这个系统中,我们减少了超过99%的开放活动相比其他生物反应器和消除需要多个孵化器自11500年每个问有中空纤维(200μ每个纤维直径)达到21000厘米的总表面积²(约380100毫米组织培养菜)。扩张后问,细胞表达高水平的多能性标记,保持正常核型,可以自发地分化成三个胚芽层,表明问环境没有改变的多能性状态hiPSC线。

在我们的研究中,我们观察到显著增加的扩散hiPSCs当问被涂上一层的中空纤维LN521与VN。当我们对待VN的中空纤维,细胞产量不高10天后系统时涂上LN521才7天,尽管媒体消费这两种情况下是相同的。这表明,涂层可以改变细胞的增殖率。可能问纤维之间的相互作用和VN疲弱,导致细胞附着的小可用区域。因此,我们建议LN521能够覆盖所有的中空纤维表面,为细胞提供一个面积较大附件,最大化hiPSC扩张。

化学定义媒体(21,39)和feeder-free文化系统涂有各种基质蛋白(11,23,32,40)开发维护已经在文化的表型。基底膜基质™是PSC的黄金标准ECM feeder-free文化在实验室,但由tumor-derived ECM的复杂混合物,蛋白聚糖和生长因子,不能用于临床细胞生产(28,41]。此外,即使在研究环境中,基底膜基质™是不等的,化学定义,和具有较高的变异性,使得很难用在开发一个可扩展的和可再生的PSC文化系统。为了避免人工基底膜的可变性™和生成简化但健壮的定义良好的文化环境,我们使用矩阵纯化蛋白质LN和VN。这些涂料曾被用来增加细胞扩张和分化的可靠性和再现性协议(22,32,40,42,43]。涂料(LN和VN)允许细胞扩张,与正常核型,自我更新和维持多能性标记;此外,他们允许的形成畸胎瘤细胞包含三个生殖层(22,32,36,40,44]。虽然VN可以代替人工基底膜™,罗兰et al。45)表明,基底膜基质™稍微更好的性能在细胞的粘附和增殖。

总之,我们已经表明,问可用于高效、可再生的hiPSC扩张,同时保护细胞的干细胞表型。利用临床批准问配合xeno-free试剂提供了一个优化细胞培养系统生成大量hiPSCs。这提供了重大一步一代人体大小的整个器官生物工程所需细胞的数量和随后的治疗应用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

补充材料

图S1: Lactate-predicted手机号使用ACS1030 hiPSC线扩张中问。红色:LN521涂层;黑色:VN涂层(中引用的结果,第二段)。(补充材料)

引用

1. r . Zweigerdt“大规模生产的干细胞及其衍生品,”生物工程/生物技术的进步卷,114年,第235 - 201页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. l . t .锁和e . s . Tzanakakis扩张和内胚层分化人类胚胎干细胞的后代在微载体stirred-suspension文化”组织工程部分,15卷,不。8,2051 - 2063年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. r .洞螈,a·兰格s selz et al .,“悬浮培养的人类多能干细胞在控制,搅拌生物反应器,”组织工程部分C,方法,18卷,不。10日,772 - 784年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. y的粉丝,m .融合,c . Cheng和e . s . Tzanakakis”简单工程xeno-free微载体的可伸缩的人类多能干细胞在搅拌悬浮培养,“组织工程部分,20卷,不。3 - 4、588 - 599年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. de巴勃罗·j·j·j·c·莫尔,s . p . Palecek”3 d microwell人类胚胎干细胞的文化。”生物材料,27卷,不。36岁,6032 - 6042年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. a·m·费尔南德斯·a·马里奥·r·c·完毕et al .,“成功的扩大生产人类胚胎干细胞在搅拌微载体的文化系统中,“巴西医学和生物学研究杂志》上,42卷,不。6,515 - 522年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. m·塞拉c·科雷亚是r . Malpique et al .,“微型胶囊技术:一个强大的工具整合扩张和人类胚胎干细胞冷冻保存,”《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。8篇文章e23212 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. r .洞螈,a•哈斯s Merkert et al .,“长期扩张的未分化的人类iPS和ES细胞悬浮培养使用定义中,“干细胞研究,5卷,不。1,51 - 64,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c·克鲁普h . Kempf c Halloin et al .,“喂养策略影响人类多能干细胞的可伸缩的扩张在一次性搅拌釜生物反应器,”干细胞转化医学,5卷,不。10日,1289 - 1301年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. w . Almutawaa、l . Rohani和d e . Rancourt”扩张的人类诱导多能干细胞在搅拌悬浮生物反应器,”分子生物学方法卷。1502年,61年53 - 2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. l . g . Villa-Diaz a . m .罗斯,j . Lahann和p h . Krebsbach”点评:简洁的进化人类多能干细胞文化:从馈线细胞合成涂料、”干细胞没有,卷。31日。1、1 - 7,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. m·阿米特·j . Chebath诉Margulets et al .,“悬浮培养的未分化的人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞”干细胞的评论》第六卷,没有。2、248 - 259年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. a . g .孟s Liu Poon和d e . Rancourt”优化人类诱导性多功能干细胞stirred-suspension文化扩张,”干细胞与发展,26卷,不。24日,第1817 - 1804页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. m·r·拉里贾尼a . Seifinejad b Pournasr et al .,“长期维护未分化的人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的暂停,”干细胞与发展,20卷,不。11日,第1923 - 1911页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. j·a·汤姆森j . Itskovitz-Eldor s s·夏皮罗et al .,”来自人类囊胚的胚胎干细胞系。”科学,卷282,不。5391年,第1147 - 1145页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. m·a·j . Yu Vodyanik, k Smuga-Otto et al .,“诱导多功能干细胞来源于人类体细胞,”科学,卷318,不。5858年,第1920 - 1917页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. k .高桥k .田边m . Ohnuki et al .,“诱导多能干细胞从成人人类成纤维细胞因素,定义”细胞,卷131,不。5,861 - 872年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. z, a . Solanki a Hamilos et al .,“应用生物材料促进诱导多功能干细胞研究和治疗,”在EMBO杂志,34卷,不。8,987 - 1008年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. r . Krawetz j . t . Taiani s刘et al .,“大规模扩张stirred-suspension多能人类胚胎干细胞的生物反应器,”组织工程部分C,方法,16卷,不。4、573 - 582年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. a . Manzo y Ootaki, c . Ootaki k . Kamohara和k . Fukamachi”比较研究心率变异性之间健康的人体和健康狗、兔子和小腿,“实验动物,43卷,不。1,41 - 45页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. g . Chen d·r·Gulbranson z侯et al .,“化学定义条件人类iPSC推导和文化,“自然方法,8卷,不。5,424 - 429年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 罗丹,a . Domogatskaya美国斯特罗姆et al .,“长期人类多能干细胞的自我更新人类重组层粘连蛋白- 511”自然生物技术,28卷,不。6,611 - 615年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. h . Hongisto s Vuoristo a Mikhailova et al .,”层粘连蛋白- 511表达与给料机的功能细胞在人类胚胎干细胞的文化中,“干细胞研究,8卷,不。1,第108 - 97页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. d·a·布拉夫曼c . w . Chang a·费尔南德斯k . Willert s Varghese和美国狗,”长期人类多能干细胞自我更新合成聚合物表面,”生物材料没有,卷。31日。34岁,9135 - 9144年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. t . p .周f . Wu周et al .,“简单而通用的合成polydopamine-based表面支持人类体细胞重编程和长期人类多能干细胞的自我更新定义的条件下,“生物材料卷。87年,1卷,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. l . g . Villa-Diaz h . Nandivada j .丁et al .,“合成聚合物涂料人类胚胎干细胞的长期增长,”自然生物技术,28卷,不。6,581 - 583年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. z Melkoumian, j·l·韦伯·d·m·韦伯et al .,“合成peptide-acrylate表面长期自我更新和心肌细胞分化人类胚胎干细胞,”自然生物技术,28卷,不。6,606 - 610年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. c·s·休斯、l . m . Postovit和g . a . Lajoie“人工基底膜:一个复杂的蛋白质混合物所需最佳生长的细胞培养,“蛋白质组学,10卷,不。9日,第1890 - 1886页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. j . McGowan-Jordan a·西蒙斯,m·施密德2016年ISCN:人类Cytogenomic命名的国际体系a . s . Jean McGowan-Jordan和m·施密德Eds。Karger,瑞士巴塞尔,纽约,2016年。
30. Kehat, d . Kenyagin-Karsenti m . Snir et al .,“人类胚胎干细胞可以分化成细胞与心肌细胞的结构和功能特性,”《临床研究杂志》上,卷108,不。3、407 - 414年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. m . Haack-Sorensen b . Follin m·朱尔et al .,“文化扩张的脂肪基质细胞。一个封闭的自动量子细胞扩张系统与手工flask-based文化相比,“转化医学杂志》,14卷,不。1,p。319年,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. s·m·巴登,t·g·费尔南德斯,c . s . Cordeiro et al .,“定义基本8™介质和vitronectin有效支持可伸缩xeno-free扩张引起了人类诱导多能干细胞的微载体培养系统,”《公共科学图书馆•综合》,11卷,不。第三条e0151264, 2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. y邵、j .唱歌和j .傅”对人类多能干细胞控制:3 d生物工程和力学生物学的兴起,“生物材料52卷,26-43,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. b . p . r . Derda l . Li小说,r·l·刘易斯,j·a·汤姆森和l·l·基斯林”定义为人类胚胎干细胞生长基质确定从表面阵列,”ACS化学生物学,卷2,不。5,347 - 355年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. y Lei d·v·谢弗,“一个完全的定义和可伸缩的3 d文化系统对人类多能干细胞和分化扩张,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷110,不。52岁的E5039-E5048, 2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. m . Leino c .搁浅地n . Hughes-Brittain b·罗伯r·麦基恩诉Chotteau,“人类胚胎干细胞分散在实际上电纺PCL纤维支架通过与层粘连蛋白- 521和E-cadherin-Fc涂层,”生物医学材料研究学报B部分,应用生物材料,卷106,不。3、1226 - 1236年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. y风扇、f . Zhang和e . s . Tzanakakis”工程xeno-free与重组vitronectin微载体,白蛋白和紫外线辐射对人类多能干细胞生物工艺,”ACS生物材料科学与工程,3卷,不。8,1510 - 1518年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. l . y . Li Li z n . Chen g .高r .姚明,和w .太阳,“Engineering-derived方法iPSC准备,扩张,分化和应用程序,”生物制造,9卷,不。3,第032001条,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. t·e·路德维希·m·e·Levenstein j·m·琼斯et al。”派生人类胚胎干细胞的定义条件,”自然生物技术,24卷,不。2、185 - 187年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. a·b·普劳斯·m·r·多兰j。j Cooper-White et al .,“长期的文化人类胚胎干细胞在抗坏血酸盐重组vitronectin自由媒体,”生物材料没有,卷。31日。32岁,8281 - 8288年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. 公元Celiz, j·g·史密斯,r·兰格et al .,“材料未来的干细胞工厂”,自然材料,13卷,不。6,570 - 579年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. s . m . Azarin和s . p . Palecek”定义矩阵革命:三一基质为长期扩张ESCs的人类,”细胞干细胞,7卷,不。1、7 - 8,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. h . Albalushi m·库雷克Karlsson l . et al .,“521层粘连蛋白稳定人类胚胎干细胞的多能性表达式模式最初派生馈线细胞,”干细胞国际卷,2018篇文章ID 7127042、9页,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. 罗丹,l . Antonsson c Niaudet et al .,“克隆的人类胚胎干细胞培养层粘连蛋白- 521 /钙粘蛋白矩阵定义和xeno-free环境,”自然通讯,5卷,不。1,p。3195年,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. a·j·t·j·罗兰·l·m·米勒Blaschke et al .,“角色的整合蛋白在人类诱导多能干细胞生长基底膜基质和vitronectin”干细胞与发展,19卷,不。8,1231 - 1240年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2019年费尔南达c Paccola Mesquita等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。