文摘
介绍。成人神经嵴干细胞(成都市)用于再生医学的重要视角。成人建设隔离是最具吸引力的来源毛囊(高频)和皮肤真皮(SD),因为容易访问和微创活检。本研究的目的是比较高频的生物属性,SD-derived成都市后大规模扩张。方法。传统的外植体方法用于获得高频建设工作。SD成都市的隔离,一个新的preplating组成的联合技术和后续培养3 d plasma-derived血纤维蛋白水凝胶应用。研究细胞通过流式细胞术,ICC, qPCR, Bio-Plex多元分析,指导multilineage分化化验。结果。我们获得成年SD和高频成都市从每个皮肤样本( )。成年SD和高频建设工作是积极的关键神经嵴标记:SOX10,我(CD271)、巢蛋白,SOX2, CD349。SD成都市显示更高的增长率在大规模扩张相比,高频建设( )。最后SD成都市人口也包含更多的单独使用细胞( )和SOX10+,CD271+CD105,+,CD140a+CD146+,CD349+细胞( )。高频和SD成都市有类似的基因表达分析和产生生长因子,但一些定量差异被发现。成人心力衰竭和SD建设工作得以进行定向分化为神经元,雪旺细胞,脂肪细胞,成骨细胞。结论。大规模生产的高频和SD合适来源的成年成都市具有类似生物属性。我们证明了成都市人口从SD同质并显示增长速度显著高于高频建设工作。此外,SD成都市隔离是更便宜、更容易,和最小耗费时间的方法。
1。介绍
神经嵴(NC)是一种瞬态结构出现的胚胎发育期间脊椎动物(1)形成在体细胞外胚层之间的边界和神经板(2]。加拿大科学家认为数控是第四个胚胎大脑大厅层考虑其作用脊椎动物个体发育和系统发生3]。这个概念在科学界正变得越来越普遍。规范后,数控细胞进行分层和遥远的迁移到目标组织和器官。许多类型的细胞和组织来自数控,包括骨、软骨、结缔组织在头部和颈部区域,周围神经系统的神经元和神经胶质细胞,黑色素细胞,内皮细胞,间质(可见)角膜细胞,一些内分泌细胞的APUD系统[4]。有几个在数控领域,其中颅神经嵴细胞拥有最广泛的潜力multilineage分化。他们产生ectomesenchyme(即。,different mesenchymal cell types, like adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes), melanocytes, neurons, and glia of the peripheral nervous system [4]。
如此大的潜力multilineage分化意味着多功能干细胞的存在。数控干细胞的存在在哺乳动物在1992年首次显示premigratory /早期迁移阶段[5]。自1997年以来,神经嵴多功能干细胞(成都市)已确定和孤立的组织和器官后胎儿和产后哺乳动物的发展阶段:小肠(6),脊髓背根[7],隆起地区[8)和真皮乳头(9]的毛囊(高频),皮肤真皮(SD) [10),脂肪组织(11),骨髓(12],口感[13],齿龈[14),鼻粘膜(15],牙髓[16],牙周韧带[17,心18),角膜(19和虹膜20.)基质等。成人成都市新发现和研究的历史,他们的组织来源,生物特性进行了总结在最近的一些评论21,22]。成人建设工作有能力进行定向分化为脂肪细胞,成骨细胞,软骨细胞,黑色素细胞,神经元,雪旺细胞21,22]。此外,数控细胞具有的可塑性HOX代码,这决定了细胞在体内的位置信息。这个属性允许数控细胞,移植到受损组织的网站后,修改原来的HOX代码和获取宿主组织的特点HOX代码。重要的是,受损组织可以non-NC起源和来自其他胚胎层(例如,中胚层)。这种现象是第一次描述了下颌骨骨祖细胞,具有数控起源、移植后的骨缺损胫骨(中胚层起源)[23]。NC-derived鼻软骨细胞移植后膝盖的关节软骨的缺损(中胚层起源)还演示了HOX代码可塑性(24]。很可能HOX代码可塑性确保正确的结构和功能集成将数控细胞移植到宿主组织的其他胚胎起源。此外,在一定的实验条件在体外和在活的有机体内,成人成都市CNS-specific细胞,包括神经干细胞(25),少突胶质细胞(26),星形胶质细胞(27,28,多巴胺神经元(29日,30.]。在皮肤创伤模型,结果表明,成人成都市调节损伤后修复再生的过程及其消除导致异常的皮肤修复(31日]。
成人培养成都市治疗应用导致骨的修复(32)和软骨缺陷(33和受损周围神经34,35)和脊髓(36,37]。此外,本地和/或predifferentiated成人建设工作得以进行结构和功能集成到大脑移植后(38,39]。因此,由于大量multilineage分化和潜力HOX代码可塑性,成年成都市有吸引力的候选人在再生医学应用(40),特别是在神经学和神经外科领域41]。
成人建设工作由一个小异类在组织和器官的细胞。因此,选择性分离的成年成都市及其有效的大规模扩张的重要技术问题成功申请再生医学的目的。各种技术被申请成人成都市的选择性隔离:fluorescence-activated细胞排序(6,42),选择性培养条件增长neurosphere-like结构(42,43],外植体技术[44,45)等。
承诺的来源隔离成年成都市SD和高频由于不远的微创活检过程。外植体技术是传统上用于隔离和大规模扩张的成年成都市从人类头发毛囊(44,45]。然而,外植体方法的主要和重要的缺点是外植体分离的高频率,从高频外植体角化细胞的自发产物,长期主要培养一步一步获得足够的后续治疗细胞数量扩张(44,45]。最初描述的和广泛使用的方法隔离和扩张的SD成都市新形式neurosphere-like结构是基于他们的能力在一个特定的无血清培养基和超低附件文化菜(42,43]。一方面,这种方法允许获得成都市从异构选择性增长包含细胞起源于中胚层的细胞群。从另一方面来说,这种方法的缺点是成都市的相对较低的增长率和细胞培养的高成本由于使用特殊的超低附件文化船只,高浓度的重组生长因子,和生长激素补充剂的替换胎牛血清。因此,扫描的新方法来优化建设隔离和大规模扩张仍然是一个在再生医学角度向量。本研究的目的是比较成人的生物属性高频成都市外植体获得的方法和SD成都市孤立我们的替代方法通过preplating和纤维蛋白水凝胶后大规模扩张。
2。材料和方法
相关的所有程序获得人类皮肤活检,细胞分离和培养进行书面告知捐赠者同意和依照法律的乌克兰。研究协议是国家生物伦理学委员会批准基因和再生医学研究所的南乌克兰的基辅,乌克兰。细胞培养进行GMP / GTP-compliant生物技术实验室ilaya.regeneration(许可经营人类脐带血银行,其他组织和细胞;乌克兰卫生部颁发的AE。186342年从11.07.2013)。
皮肤标本从5岁健康男性捐赠者获得20到28年。
2.1。捐赠者和细胞培养筛选测试
外周血样本捐助者(PCR ELISA)和细胞培养操作(PCR)筛查艾滋病毒½,乙肝病毒、丙肝病毒、HSV½,巨细胞病毒,EBV,梅毒螺旋体、支,尿道支原体感染。细胞培养也通过PCR检测潜在的支原体污染支原体检测组件(AppliChem,德国)。培养细胞的正常核型GTG-banding方法证实了最后一段。
2.2。分离和培养的成年成都市从人类毛囊和皮肤真皮
高频的文化建设工作得到根据Sieber-Blum等外植体的方法。8在我们的人类样本修改(45]。短暂,两个皮肤标本每捐赠从头皮区切除局部麻醉下真皮打孔刀(Dermo-Punchø4毫米,Sterilab,意大利)。一夜之间,皮肤标本被孵化在4°C Dispase II的解决方案(0.4 U /毫升;美国Sigma-Aldrich)。然后小心地摘取了一个表皮真皮和HFs中分离的控制下Stemi 2000立体显微镜(德国卡尔蔡司)。HFs中移植在一层薄薄的胶原凝胶在两个培养皿ø35毫米(SPL、韩国)和孵化为40分钟37°C multigas孵化器(210年粘合剂CB,德国)5%股份的氛围2和5%啊2和饱和湿度为97%之前附件添加完整的生长介质。
成都市新隔离,细胞从SD(隔夜孵化后在4°C 2 U /毫升Dispase II的解决方案和表皮清除)碎和消化0.1%胶原酶/ 0.1%链霉蛋白酶混合解决方案(美国:Sigma-Aldrich) 3 h。得到细胞悬液离心10分钟800 g(埃普多夫5804 r,德国)。在10毫升细胞颗粒resuspended完成生长介质和播种preplating成标准的细胞培养塑料培养皿ø100毫米(SPL、韩国)48 h。preplating,使用下面的生长培养基:αMEM w / o核苷(英国Gibco), 10%的边后卫PharmaGrade(美国Sigma-Aldrich), 2毫米稳定l谷氨酰胺(擤鼻涕、法国),1%的抗生素/抗真菌的解决方案(擤鼻涕、法国)。preplating后,不依从细胞群在600 g 5分钟收集和离心机(埃普多夫5804 r,德国)。细胞颗粒在4.5毫升resuspended血小板血浆差获得来自同一个捐赠者。然后0.5毫升的混合物组成的0.45毫升的血清(来自同一个捐赠者)和50μl 10% CaCl2的解决方案是添加到细胞悬液。混合的结果很快就转移到T25瓶(SPL、韩国),放置15分钟的水凝胶聚合的孵化器。三维纤维蛋白水凝胶的形成后,5毫升的完整生长介质被添加到瓶中。接种的细胞与纤维蛋白水凝胶是由孵化链霉蛋白酶为0.1%(美国Sigma-Aldrich) 10分钟。由此产生的细胞悬液稀释5×PBS(美国Sigma-Aldrich)和离心5分钟在600 g (5804 r埃普多夫,德国)洗出酶的残骸。颗粒resuspended,洗一次与PBS(美国Sigma-Aldrich)。细胞在生长培养基和培养resuspended collagen-coated培养瓶。
主要培养后,细胞用0.01%胰蛋白酶在0.53毫米Na亚文化2EDTA溶液(美国Sigma-Aldrich)和播种到collagen-coated培养瓶(T25瓶、SPL、韩国;美国康宁公司或五multiflask)电镀密度1000细胞/厘米2。
细胞培养在multigas孵化器CB 210(活页夹、德国)37°C公司为5%2和5%啊2和饱和湿度。成人心力衰竭的扩张和SD成都市以下使用生长培养基:αMEM w / o核苷(英国Gibco), 5%的边后卫PharmaGrade(美国Sigma-Aldrich), 5 ng / ml bFGF(英国Gibco), 10 ng / ml EGF(英国Gibco), 1%的补充(英国Gibco), 2毫米稳定L -谷氨酰胺(擤鼻涕、法国),1%的抗生素/抗真菌的解决方案(擤鼻涕、法国),和2 U /毫升肝素(Indar、乌克兰)。
评估后,细胞总收率数量增长率培养成人心力衰竭和SD成都市P3 (2 d和3 d的文化),104细胞被播种每个培养皿ø35毫米(SPL、韩国)2 d ( )或3 d内纤维蛋白水凝胶( )培养7天。
评估的能力建设工作增长浮动neurosphere-like结构,每口井的1000个细胞被播种到超低附件24-well板(美国康宁公司)以下无血清培养基:neurobasal介质(英国Gibco), 2% B27补充(英国Gibco), 1% N2补充(英国Gibco), 20 ng / ml bFGF(英国Gibco), 40 ng / ml EGF(英国Gibco), 2毫米稳定l谷氨酰胺(擤鼻涕、法国),1%的抗生素/抗真菌的解决方案(擤鼻涕、法国)。
细胞群数量翻倍(生产)和细胞群体倍增时间(PDT)按照下列标准计算公式(46]: 在哪里获得的细胞的数量;是电镀的细胞的数量;是细胞培养时间。
2.3。CFU化验和自我更新能力
单独使用评估的潜力,在最后一段的建设工作(P3)被播种在100 - 300细胞的数量collagen-coatedø100毫米培养皿(SPL、韩国)在生长培养基补充20%的边后卫PharmaGrade(美国Sigma-Aldrich)和培养14天。要么是固定和染色细胞克隆形成单位(CFU)测定或subcloned自我分析。集落形成的有效性(电镀效率、PE)使用标准的公式计算(46]:
无性繁殖群体的转移(subcloning)使用克隆气缸执行(美国Sigma-Aldrich)。这些细胞被培养14天,固定和染色分析二级cfu的形成。
2.4。采用免疫分析
采用免疫分析,细胞与冷的4%多聚甲醛固定的20分钟,permeabilized为细胞内染色与0.1% Triton x - 100 20分钟,PBS渐变20 0.2%,和阻塞30分钟在PBS 1% BSA, 5%的边后卫(美国:Sigma-Aldrich)。幻灯片是孵化主要抗体在一夜之间在4°C,洗了三次与PBS、孵化与二次抗体室温1小时,洗两次PBS,沾染了赫斯特33342(美国Sigma-Aldrich) 5分钟,洗两次与PBS(美国Sigma-Aldrich)和安装在Mowiol安装介质(美国Sigma-Aldrich)。抗体是在表的详细信息S1。
2.5。流式细胞术分析细胞表面和细胞内标记表达式
成人成都市immunophenotype评估最后一段(P3) fluorochrome-conjugated鼠标CD34单克隆抗体,CD45 CD56、CD73, CD90、CD105, CD117, CD140a, CD140b, CD146, CD166 CD271,巢蛋白按照制造商的指示(美国BD生物科学)。检测SOX10和CD349 (FRIZZLED-9)主要非结合的抗体和次要alexa - 647共轭单克隆抗体(热费舍尔,美国)。抗体是在表的详细信息S1。细胞内染色,细胞被固定Cytofix解决方案,permeabilized,彩色PhosFlow缓冲区(美国:BD生物科学)根据制造商的指示。执行试验使用流cytometer-sorter BD FACSAria™我和BD流式细胞仪天后6.1软件(美国BD生物科学)。直方图生成了与Cyflogic v.1.2.1软件(美国CyFlo有限公司)。
2.6。qPCR
总RNA是孤立的从106成都市新使用NucleoZOL (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co . KG、德国)根据制造商的协议。用分光光度法测定RNA质量和浓度NanoDrop™1000(美国热科学)。2μg孤立的RNA是反向转录cDNA使用RevertAid第一链互补脱氧核糖核酸合成装备(美国热科学)。qPCR 7500执行实时PCR系统(应用生物系统公司、钙、美国)使用5×热FIREPol®EvaGreen®qPCR混合+(火箭)(索利斯生物因素、爱沙尼亚)。应用生物系统公司7500系统软件(1.3.1)是用于数据分析。引物序列表中列出S2。以下应用PCR循环条件:10分钟在95°C, 40周期10 s在95°C,和40分钟60°C。TATA框结合蛋白的表达水平(真沸点)用作内部控制。目标基因正常Ct值与真沸点的Ct值相同的阈值水平。相对量化(比较Ct(ΔΔCt)方法)是用来比较的目标基因的表达水平与内部控制。解离曲线分析在每次运行后检查引物特异性。结果相对单位。所有细胞类型、反应进行三次(每个基因一式三份)。美国GraphPad棱镜4 (GraphPad软件)和MS Excel是用于统计分析和图形数据表示。盒印迹显示累计数据相对mRNA表达在高频成都市和SD成都市新细胞培养分离出5个捐助者。 In box plots, bars mean maximum and minimum values, the line within the rectangle shows the median, and the top and bottom of the rectangle represent the third and first quartile, respectively.
2.7。生产的细胞因子,趋化因子,生长因子通过高频和SD建设工作
目标蛋白质的含量采用无血清细胞培养24小时后上层清液栽培技术测量了连续流荧光测定术与双光束激光自动分析仪Bio-Plex蛋白质分析系统(美国Bio-Rad)使用商业套装(美国Bio-Rad Bio-Plex Pro 27-Plex和21-Plex化验)按照制造商的指示。
2.8。导演Multilineage分化分析
我们协议直接multilineage分化分析成人成都市早些时候描述详细(45]。简单地说,我们使用以下微分媒体和胶基质:脂肪形成的分化培养基:DMEM高葡萄糖(4.5 g / l)(擤鼻涕、法国)补充10%的边后卫,1μ50 M地塞米松,μindomethacine, 250μM isobutylmethylxanthine 5μg / ml胰岛素(美国:Sigma-Aldrich),和5%马血清(擤鼻涕、法国);成骨分化培养基:DMEM低葡萄糖(1.0 g / l)(擤鼻涕、法国)补充10%的边后卫,100 nM地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐,50μg / ml ascorbate-2-phosphate(美国:Sigma-Aldrich);神经元分化培养基:neurobasal介质(英国Gibco), 2% B27补充(英国Gibco), 1% N2补充(英国Gibco) 5μM ec32合成维生素a(英国AMSBIO), 1μM forskolin(美国Sigma-Aldrich), 20 ng / ml神经生长因子(美国PeproTech), 20 ng / ml BDNF(美国PeproTech), 20 ng / ml GDNF(美国PeproTech)和20 ng / ml IGF(英国Gibco);神经胶质分化培养基:neurobasal(英国Gibco)和DMEM: F12(英国Gibco)媒体比1:1,B27补充(英国Gibco) 2%, 1% N2补充(英国Gibco), 1μM ec32合成维生素a(英国AMSBIO) 5μM forskolin(美国Sigma-Aldrich), 20 ng / ml neuregulin 1(英国Gibco), 10 ng / ml PDGF-BB(美国PeproTech)和20 ng / ml IGF(英国Gibco)。
脂肪形成的和成骨分化化验成人心力衰竭和SD成都市新胶原蛋白基质上进行。神经元和神经胶质差异化测试是在保利-l赖氨酸和laminin-coated表面。
2.9。细胞化学
CFU染色,细胞殖民地固定与冷乙醇20分钟,用水洗,沾azure-eosin Romanowsky-Giemsa方法(:Makrokhem、乌克兰)20分钟。确认成骨的脂肪形成的分化,细胞被固定的20分钟10%福尔马林(Makrokhem、乌克兰),用PBS(美国Sigma-Aldrich)和染色茜素红S 20分钟2%解决方案(pH值4.1;检测钙化的细胞外基质沉积)或0.5%解决方案油红O染色的(中性脂质)和azure-eosin Romanowsky-Giemsa对比染色,分别(美国:Sigma-Aldrich)。确认的成骨分化的检测碱性磷酸酶(ALP) BCIP®美国/电视台液体基质系统(Sigma-Aldrich)也执行。细胞生存能力在证实了纤维蛋白水凝胶结合染色和荧光素二乙酸(FDA, 2μg / ml) /碘化propidium(π,2μg / ml)荧光染料(美国Sigma-Aldrich)。这些细胞被染色与FDA /π在RT为5分钟,然后洗两次DPBS和混合血浆纤维蛋白水凝胶聚合的孵化器在37°C。
2.10。显微镜
显微镜检查的活细胞,细胞培养,和细胞学的幻灯片进行反向AxioObserver A1显微镜配有AxioCam ERc 5 s数码相机和禅宗2012软件。共焦显微镜检查和LSM蔡司LSM 510元显微镜图像浏览器软件(德国:卡尔蔡司)。
2.11。统计数据
并给出了数据 偏差( )。Kolmogorov-Smirnov测试是用来评估变量的常态分布。学生的 - - - - - -测试和Mann-Whitney测试被用来确定统计学意义的差异。显著性水平是设定在 。
3所示。结果
3.1。成人成都市来自毛囊和皮肤真皮表达相同的关键标志
成人成都市的高频和SD是众所周知的来源在人类和其他哺乳动物。我们使用两种不同的技术高频成都市和SD成都市隔离,培养和扩张。外植体技术结合特定的生长介质应用于获得成人高频建设工作。特定的生长介质提供了合适的条件比目标建设的人口增长比较角化细胞和黑色素细胞,也可以获得相同的高频外植体。应该注意的是,在我们的研究中使用的特定的生长介质是没有选择性,不排除角化细胞的产物HF外植体的可能性。同质成都市人口是通过微分胰蛋白酶化使主细胞培养时,如前所述[45]。
在SD成纤维细胞是主要的细胞类型,具有高粘性塑料文化。这个属性允许它们附着在培养皿中没有任何额外的涂层胶基质。同时,成人成都市胶粘剂属性较少,需要使用不同的粘附蛋白成功培养,像纤连蛋白、层粘连蛋白、或胶原蛋白。基于不同的粘性纤维母细胞和建设工作,我们执行preplating技术48 h,紧随其后的是独立的细胞转移到特定的微环境的粘合剂。对于后者,我们使用3 d plasma-derived血纤维蛋白水凝胶(PDFH),这是宽容的成人成都市粘附和支持他们的增长在3 d细胞培养系统47,48]。
代表图像的成年成都市主要文化移植的高频和分离SD在数据提出了三维纤维蛋白水凝胶1(一)和1 (b)。应该注意,成人心力衰竭和SD成都市时稍微不同的形态在相同条件下培养的(相同生长介质和2 d文化collagen-coated文化塑料P1):成年SD成都市具有紧凑的多边形形态(图1 (d)),而成人高频成都市演示更细长呈形态(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
确认数控起源,我们执行一个采用免疫分析数控标记表达式的细胞分离后的高频和SD主要文化。大多数细胞内人群成人心力衰竭和SD成都市表示SOX10 CD271(我LNGFR)、巢蛋白,SOX2, CD349 (FRIZZLED-9)蛋白水平。这些是基本建设标准标识(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
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(g)
(h)
因此,细胞分离过程从SD和高频使用不同的方法论的主要技术允许获得成都市文化基于关键数控标记的表达模式。
3.2。隔离和扩张效率的成年成都市从毛囊和皮肤真皮
基本增长率数据和细胞产量值在大规模扩张的成年SD和高频成都市从主文化P3展示在表1。应该注意的是,很难正确比较成人建设隔离的两种方法(特别是关于主文化的一步)由于显著的内部差异方法(外植体技术与酶的隔离;2 d和3 d的条件主要文化)和由于缺少数据的确切数字成人毛囊和皮肤真皮内成都市活检。
在我们的研究中,获得原代细胞培养的时间来自高频外植体和真皮使用酶隔离,preplating,和随后的细胞培养3 d纤维蛋白水凝胶为14天。然而,这两种方法显示在总细胞产生显著差异的主要细胞培养步骤。总细胞产量数后,小学文化 高频成都市vs。 SD建设( )(表1)。SD成都市新号码在P0已经够播种五multiflask增长领域875厘米2考虑到电镀密度为后续章节的成人建设工作是每1厘米1000个细胞2。相比之下,高频建设需要一个额外的通道在继续之前的大规模扩张五multiflask。由于使用不同的文化在P1血管生长的高频成都市和SD成都市(T25烧瓶vs。镀五multiflask)相同的其他参数(密度、生长介质变化的频率,和培养时间),也应该用比较谨慎。SD成都市显示增长速度高于高频成都市在P1,反映在人口数量翻倍(生产)和人口倍增时间(PDT)值。生产是 SD成都市vs。 对于高频建设( ),PDT是 SD成都市vs。 对于高频建设( )(表1)。这些差异在增长率被保留在P2和P3完全相同的细胞培养条件下(表1)。同时,应该注意的是,当收割支流文化P2和P3 SD成都市产生更高的平均每五细胞产量multiflask: 在P2和 在P3 vs。 在P2和 在高频成都市P3 ( )(表1)。支流文化中的近似细胞密度是每厘米67400个细胞2对SD建设工作vs。51400细胞/厘米2对于高频建设( )。这种差异可以被解释为SD的较小规模比高频成都市建设工作。此外,任何试图文化从皮肤内三维解剖HFs纤维蛋白水凝胶并没有透露任何心力衰竭细胞产物(数据没有显示)。
除了更高的增长率的SD成都市P3,他们也显示出更高的PE值: 相比 高频建设( )(表1)。同时,SD成都市和高频成都市展示了类似的自我更新能力,由subcloning cfu的评估形成二次殖民地(数据未显示)。重要的是,所有的高频和SD成都市文化大规模扩张后P3 GTG-banding后正常核型分析(数据没有显示)。
然而,评估这种差异是否在高频的增长率与SD成都市是由于三维培养步骤,我们比较有针对性的建设工作人口的增长率在2 d和3 d的文化。我们镀104培养细胞从每35毫米P3培养皿(2.0毫升)或无纤维蛋白水凝胶( )。高频和SD成都市容易扩散三维纤维蛋白水凝胶作为活细胞荧光素二醋酸盐染色证实24 h和72 h postplating(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。细胞培养时间为168 h和PDT值 vs。 在2 d反对 vs。 分别在3 d高频和SD(图3 (e))。显然,三维培养条件显示较低的PDT值成都市人口在168 h后培养。然而,PDT在3 d值与高频和SD建设工作,而在二维培养系统SD成都市证明略高增殖率。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
因此,在我们的文化条件,SD建设工作的特点是数量明显高于总细胞的数量,潜在增长率,单独使用高频成都市相比可能主要由于三维培养的步骤。
3.3。Immunophenotype毛囊和皮肤真皮的培养建设工作
高频和SD成都市有相似的表型和表达在P3以下标记:CD271(我LNGFR) SOX10和巢蛋白(神经嵴来源的标记);CD73、CD90、CD105(多功能间充质干细胞/基质细胞标记);CD349 (FZD-9 WNT家族的生长因子受体),CD140a (PDGFRα)和CD140b (PDGFRβ)(对pdgf受体);粘附分子CD146 (MCAM)和存在(ALCAM)(数据4和5;表2)。大约7% SOX10- - - - - -,20% CD271- - - - - -,10% CD105- - - - - -细胞被发现在细胞培养的成年高频成都市(表2)。几乎所有细胞内高频成都市和SD成都市人口表示CD73和CD90。SOX10 CD271被标记的成人成都市神经性和转变潜力(10]。因此,SOX10维护multipotency建设(49),但TGFβ介导SOX10抑制控制从成都市新一代的间叶细胞祖细胞50]。这可能说明细胞亚群的出现具有分化潜力有限只能由间充质细胞的命运。此外,由于已知CD105函数(51),这个标记的细胞亚群,是负的可能降低成骨的潜力。
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(我)
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(b)
高频和SD成都市为阴性以下标记:CD34、CD45、和HLA-DR(造血和免疫细胞标记)、CD56 (NCAM)成熟的神经元和神经胶质细胞的标记;自洽场CD117 (c - kit)受体,黑色素细胞和黑素细胞干细胞的标记。这表明成都市文化的缺乏污染由造血细胞和任何重大自发分化为神经元,神经胶质细胞,黑色素细胞在大规模扩张。
以通用的方式,SD成都市人口在P3具有明显更大的细胞数量呈阳性以下标记:SOX10, CD271, CD105, CD140a, CD146, CD349相比高频成都市( )。
3.4。基因表达分析在高频成都市和SD成都市文化
获得进一步了解成都市孤立的分子特性从高频和SD,我们评估的关键基因的信使rna表达水平与多能性,具备干细胞,数控的身份,和生长因子。高频成都市和SD成都市表达相似的转录因子OCT3/4,SOX2,KLF4,原癌基因,NANOG必不可少的诱导和维持多能性状态的在胚胎发育和iPS / ES代[52)(图6(一)- - - - - -6 (e))。与此同时,信使rnaLIN28A参与多能性的规定,重新编程,和干细胞代谢53),没有发现无论是在高频建设还是在SD建设工作。数控的mRNA表达身份标记评估证明的起源细胞培养分离出高频和SD。所有高频分析成都市和SD成都市文化表达的关键数控身份标记,如SOX9,SOX10,TFAP2A,LNGFR (CD271 /我),巢蛋白,SNAIL1,SNAIL2(弹头),TWIST1(数据6 (f)- - - - - -6 (m))。mRNA水平的显著升高SOX9是专门针对高频成都市(图6 (f))。应该注意的是,SOX9,TFAP2A,NGFR (CD271 /我),巢蛋白,TWIST1更均匀表达SD成都市相比高频建设(数据吗6 (f),6 (h)- - - - - -6 (j),6 (m))。这表明成都市的隔离和扩大使用新方法从SD方法允许获得更均匀的细胞群与成人建设的特殊的表型特征。
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(j)
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(左)
(m)
许多细胞因子和生长因子参与维持干细胞自我更新属性,调节细胞的命运,和调节干细胞的治疗潜力。高水平的VEGFA和FGF2信使rna在成都市新发现与高频隔离和真皮(数字7(一)和7 (b))。FGF-2生长因子对细胞生存和增殖至关重要,而VEGF-A蛋白质诱导血管生成,成功组织再生是至关重要的。高频成都市和SD建设表达了类似的神经营养因子mRNA水平的神经和神经胶质细胞生存所必需的神经生长因子,脑源性神经营养因子,GDNF,NTF3,NTF4/5(数据7 (c)- - - - - -7 (g))。然而,信使核糖核酸生活没有发现无论是在高频建设还是在SD建设(数据没有显示)。
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(g)
因此,高频成都市和SD成都市新表达OCT3/4,KLF4,NANOG,原癌基因,SOX2多能性标记在mRNA水平。基于数控身份标记表达式模式、细胞培养分离出高频和真皮数控。高频和SD成都市新表达的关键细胞生存,血管生成,神经营养,和增殖促进生长因子,如FGF2,VEGFA,神经生长因子,脑源性神经营养因子,GDNF、NTF3和NTF4/5。
3.5。生长因子和细胞因子分泌模式由高频成都市和SD建设工作
分泌的趋化因子、细胞因子和生长因子通过高频和SD成都市确定使用27-Plex和21-Plex Bio-Plex®多路复用免疫测定。高频和SD成都市15蛋白质从一个工具包的48趋化因子,分泌细胞因子,生长因子进行分析(图8)。尽管共同分泌蛋白的质谱,一个统计上的显著差异之间的定量生产高频和SD成都市新成立。高频建设工作产生更多的促炎的il - 6和引发细胞因子,IL-16多效性的细胞因子,可溶性受体- 2α链(IL-2Ra) MCP-1趋化因子,csf和胶质瘤生长因子( )。另一方面,SD建设工作产生更多IL-3细胞因子,CTACK SDF-1a趋化因子,gm - csf, SCGF, VEGF-A FGF-2,神经生长因子,生长因子。有趣的是,尽管明显高于VEGF-A、FGF-2和SD成都市神经生长因子蛋白的生产,相应的基因的mRNA表达没有统计上的显著差异。
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(我)
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(k)
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3.6。导演Multilineage分化和Sphere-Forming成人高频成都市和SD的能力建设
进一步证实数控的起源和功能性质的评估成人心力衰竭和SD建设工作,我们进行了一项研究的能力成长为neurosphere-like结构和实现定向multilineage分化成特殊的细胞类型数控衍生品。
结果高频和SD成都市分化为间充质细胞谱系(脂肪细胞和成骨细胞)给出的数字9(一个)- - - - - -9 (h)。在特定的无血清条件下,高频和SD成都市证明成长为neurosphere-like结构(数据的能力9(我)和9 (j))。另外,成人培养高频和SD成都市能够分化成神经细胞(神经元和雪旺细胞)类型(图10),是颅数控起源的特点。两种文化分化后表达等关键神经元标记PHOX2b,peripherin (PRPH),βIII-tubulin,神经丝在mRNA水平以及NeuN特异性神经元烯醇酶,βIII-tubulin、和神经丝蛋白水平。至于胶质分化,高频和SD成都市新表达我(CD271),神经营养因子3和4 (NT-3和请),髓鞘碱性蛋白(MBP),胶质原纤维酸性蛋白(GFAP),SOX10,神经生长因子(神经生长因子),早期生长反应2 (EGR2),髓鞘蛋白零(合成)在mRNA水平和S100β信使rna和蛋白质含量。
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4所示。讨论
成人成都市的高频和SD是众所周知的来源。有几个包含成人建设工作在高频领域。因此,Sieber-Blum和合作者的存在高频隆起地区建设工作,最初名叫“表皮神经嵴干细胞”(EPI-NCSCs) [8]。同时费尔南德斯与合著者(9)确定了高频的真皮乳头的利基前所述“烹饪前体细胞(SKPs)和证明了细胞谱系追踪分析数控起源。人类新生儿包皮后,SKPs被隔绝,没有HFs中(43]。并行,王国斌和合作者孤立数控多功能干细胞的起源从成年小鼠和人类的脸部和身体的皮肤(10基于sphere-forming能力)。这些多功能干细胞表达Sox10我抗原,显示领域的文化条件下广泛的自我更新,并有能力接受导演multilineage分化成神经元,神经胶质细胞,黑色素细胞,平滑肌细胞,脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞21,22]。几个成都市在脸部皮肤来源被发现使用细胞命运映射分析:许多间叶细胞结构的高频(被膜、真皮鞘和真皮乳头),神经胶质细胞谱系与神经末梢,黑素细胞细胞谱系。同时,sphere-forming成都市从后面的皮肤只有胶质和黑素细胞的细胞谱系。
几项研究描述成人的生产和大规模扩张建设从人类HFs中通过外植体技术(44,45]。所有作者指出以下这种技术的缺点:高频外植体的超然,从外植体的HFs中角化细胞的自发产物,长期主要文化一步为后续使获得足够数量的细胞。我们的方法隔离和大规模扩张的成都市SD是基于细胞群preplating紧随其后纤维蛋白水凝胶内细胞生长。避免的缺点提出了外植体方法和neurosphere-forming方法中,我们使用了preplating技术作为选择方法的转移不依从细胞群为主要种植3 d PDFH。以前,PDFH被用来扩大成人建设从鼻下鼻甲后隔离的基础上sphere-forming能力(47]。重要的是,我们组和他一一与合著者(47各种方法用于制备PDFH。创建PDFH他一一et al ., 10%血浆加入总血清生长介质,而在我们的协议,10%血清补充CaCl为10%2添加到血浆和生长介质下添加到T25瓶后3 d聚合水凝胶。因此,在这两个协议,纤维蛋白原的用量准备3 d纤维蛋白水凝胶不同约10倍,将会导致水凝胶的形成具有不同刚度和纤维蛋白纤维网络的密度。众所周知,水凝胶的刚度对培养细胞的性质有很大的影响(54]。在进一步的研究中,这将是重要的增长率相比,表型和生物学属性的成年后建设扩张在3 d纤维蛋白水凝胶准备根据这两个不同的协议。应该注意,PDFH可用于大规模扩张的成年成都市不同组织来源。此外,这里提出的三维培养系统可以动物血清,随后可能会发展成完全xeno-free系统,它反映了实际需求的许多监管机构对人类细胞的生产医药产品没有物质的异种的出处。
后获得的成年SD成都市和高频成都市的主要文化有相同的表达式模式特征标记(SOX10, CD271,巢蛋白、SOX2 CD349)但具有稍微不同的细胞形态。进一步扩大显示更快的增长率的SD成都市相比高频成都市新标准2 d细胞培养系统从P1 P3(最终通过我们的研究)。从理论上讲,使用原来的隔离和大规模扩张方法,治疗剂量的SD建设(100 - 300细胞)已经可以获得在P1总共三周后的培养时间。高频建设,需要一个额外的通道在继续之前的细胞培养瓶表面积大增长,这需要一个额外的一周的培养。
一般来说,合成SD成都市人口和高频成都市后获得大规模扩张immunophenotype相同,SOX10+CD271+巢蛋白+CD73+CD90+CD105+CD140a+CD140b+CD146+存在+CD349+CD34- - - - - -CD45- - - - - -CD56- - - - - -CD117- - - - - -HLA-DR- - - - - -显示,类似水平的基因表达,产生相同频谱的趋化因子,细胞因子,生长因子,也有能力接受导演multilineage分化和形成neurosphere-like结构。然而,除了变量增长率、人口之间的SD成都市和高频建设工作,还有其他的显著差异的最后阶段,可能会影响细胞的效力药用产品。这些差异包括菌落的数量和SOX10的内容+,CD271+和CD105+细胞。菌落的数量有直接关系的增殖和修复潜力的细胞群。SOX10和CD271是常见的标记为多功能成人建设(10]。同时,SOX10是关键转录因子决定了成都市的multipotency [49]。关于CD105,结果表明,其表现特征的亚种群人类脂肪中提取干细胞,干细胞从人类脱落乳牙(棚)增加成骨的潜力51]。CD105的成骨的潜力就越大+细胞的功能作用可以解释CD105 (endoglin)作为额外coreceptor从TGF许多生长因子β/ BMP总科(55]。应该注意的是,摆脱来自数控(56的关系),但CD105数控细胞的成骨的潜力并不表示其他组织来源。也知道,在胚胎发育过程中,需要CD105肌原性的分化早期建设的平滑肌细胞(57]。成人心力衰竭和SD成都市的肌原性的分化潜能还没有被测试,需要进一步实验确认。的验证CD105和成人心力衰竭的成骨的潜力之间的关系和SD建设也是一个前景看好的领域未来的研究。关于CD140a CD146 CD349,需要进一步的研究来阐明其生物学作用的成人建设工作,但可能,他们可以与gliogenesis关联,迁移,增殖,从而也能很强烈地影响成人的效力NCSC-based药用产品。
成人心力衰竭和SD建设表现出类似的基因表达分析,除了SOX9信使rna表达水平。在我们的研究中,我们没有发现SOX9蛋白水平和不确定SOX9的数量+细胞的最终数量成人心力衰竭和SD建设工作。这些都是未来研究的重要问题,连同SOX9的生物学作用的定义成人心力衰竭和SD建设工作。一般来说,应该注意的是,SD成都市文化展示更均匀和表面抗原基因表达模式相比,高频成都市,作为评估qPCR和流式细胞仪,这表明更好的再现性SD成都市隔离和大规模扩张preplating / 3 d纤维蛋白水凝胶法与高频外植体法。
分泌趋化因子的概况、细胞因子和生长因子,SD成都市看起来更可取比高频成都市用于再生医学由于低促炎细胞因子il - 6的分泌和引发b和更广为人知的分泌监管者的修复再生,如VEGF-A、神经生长因子、FGF-2, SDF-1a,编排neoangiogenesis,神经纤维生长,增殖,和归航的各种类型的干细胞/祖细胞,分别。
目前,不可能说明确观察到的生物种群之间的差异是否成人心力衰竭和SD成都市(评估通过细胞生长速率,表现型,基因表达,趋化因子/细胞因子/生长因子的生产,和菌落的数量在最后的细胞产品)是他们的内在属性,或者出现由于先前SD成都市PDFH培养一步。从理论上讲,培养在PDFH可以影响成人建设工作的性质,将他们对提高修复潜在的通过模拟伤口床微环境。未来研究的一个重要而有趣的目标是比较高频的大规模扩张的有效性和SD成都市新标准的2 d和3 d neurosphere-like细胞培养系统和PDFH培养和评估生物合成细胞群的属性。成人的后续进展在大规模扩张方法高频和SD成都市发展相关的临床应用也完全xeno-free细胞培养协议。
总结,我们已经表明,高频,特别是SD适合成人的大规模生产的资源建设工作具有相似属性。同时,成人的协议的孤立和扩张建设从SD PDFH方面有巨大的优势获得所需的时间间隔内细胞治疗剂量与高的内容单独细胞最终的细胞内(CFU试验)药用产品。此外,合成SD成都市人口SOX10含量更高,CD271, CD105阳性细胞和揭示更多的同质的基因表达和更好的频谱产生生长因子,细胞因子和趋化因子。
5。结论
相比我们已经成人的生物属性高频成都市孤立通过外植体的方法通过preplating / 3 d与SD成都市孤立的纤维蛋白水凝胶增长的方法。人口都展示了强大的神经嵴来源标记的表达,如SOX10 CD271,巢蛋白,SOX2, CD349。他们也有类似的基因表达分析SOX10+CD271+巢蛋白+CD73+CD90+CD105+CD140a+CD140b+CD146+存在+CD349+CD34- - - - - -CD45- - - - - -CD56- - - - - -CD117- - - - - -HLA-DR- - - - - -immunophenotype和能够接受导演multilineage分化为间充质(骨的adipo)和神经细胞(神经元、神经胶质)。然而,他们显示出了明显不同的细胞因子表达水平。有趣的是,SD建设了高增殖率,形成更多的同质人口在大规模扩张。这些数据使大规模消耗SD建设一个有吸引力的细胞类型不同的临床应用潜力。
缩写
| 高山: | 碱性磷酸酶 |
| 菌落: | 菌落 |
| EPI-NCSCs: | 表皮神经嵴干细胞 |
| 食品药品监督管理局: | 荧光素二乙酸 |
| 心力衰竭: | 毛囊 |
| 高频建设工作: | 头发follicle-derived建设工作 |
| 南: | 国家医学科学院 |
| NC: | 神经嵴 |
| 建设工作: | 神经嵴干细胞 |
| P3: | 细胞培养通道数,例如,通过3 |
| PDFH: | 3 d plasma-derived血纤维蛋白水凝胶 |
| 生产: | 人口数量翻倍 |
| PDT: | 人口倍增时间 |
| 体育: | 电镀效率 |
| PI: | Propidium碘化 |
| SD: | 皮肤真皮 |
| SD建设工作: | 皮肤dermis-derived建设工作 |
| 流: | 乳牙干细胞从人类剥落了 |
| SKPs: | 烹饪前体细胞。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
补充材料
表S1:列表在这项研究中使用的抗体识别的人类培养毛囊和皮肤dermis-derived成人建设及其分化衍生细胞类型。表S2: PCR引物序列在这项研究中用于识别人类培养毛囊和皮肤dermis-derived成人建设及其分化衍生细胞类型。(补充材料)