人类的月经血干细胞和脐带干细胞相比,抑制通过TGF -海拉细胞的增殖βP21 1-Mediated物/信号通路

文摘

人类月经血液干细胞(hMBSCs)是一种新颖的间充质干细胞(msc)具有高增殖率,multilineage分化潜力,低免疫原性和较低的致肿瘤性,使它们适合再生医学的候选人。的治疗疗效hMBSCs已经证明在某些疾病;然而,其对宫颈癌的影响尚不清楚。在目前的研究中,我们调查是否hMBSCs有抗癌特性对宫颈癌细胞体内和体外,还没有被报道。体外,transwell coculturing实验表明hMBSCs抑制增殖和入侵海拉通过诱导宫颈癌细胞G0 / G1细胞周期阻滞。体内,我们建立了一个异种移植BALB / c裸小鼠模型通过皮下注射coinjecting海拉细胞hMBSCs 21天。我们发现hMBSCs显著减少的平均体积和平均体重异种移植肿瘤。ELISA, TGF -β人类TGF - 1抗体,重组β1 (rhTGF -β1)被用来分析是否TGF -β1导致细胞周期阻滞。我们发现hMBSC-secreted TGF -β1,rhTGF -β1诱导细胞周期阻滞和增加的表达phospho-JNK phospho-P21海拉细胞,主要是逆转的TGF -β1抗体。这些结果表明,hMBSCs抗肿瘤特性宫颈癌在体外和体内的TGF -β1 /物/ p21信号通路。总之,这项研究表明hMBSC-based治疗宫颈癌的治疗是有前途的。

1。介绍

宫颈癌是一种常见的恶性肿瘤,已列为女性癌症相关死亡的第二大原因(1),每年约有52900新发病例和275000例死亡(2,3]。尽管改善预防、诊断和治疗策略,晚期患者的五年生存率仍然低至40%,导致大量的癌症相关死亡(4,5]。因此,小说宫颈癌的治疗策略很大程度上是需要的。目前,正在探索干细胞作为癌症治疗的一个有前途的候选人。

人类间充质干细胞(msc),与低免疫原性和低致肿瘤性细胞群(6),多功能细胞自我更新能力和分化成脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞谱系(7- - - - - -9]。一系列的研究表明,msc发挥重要作用在调节肿瘤的发生和发展影响入侵,迁移,或者肿瘤细胞凋亡阻力;然而,仍有争议的影响。唐等人证明了msc增强肝细胞癌的生长(10]。丁等人发现,卵巢间充质干细胞促进增殖、球体和集落形成,肿瘤发生卵巢癌细胞(11]。其他研究已经表明,msc在多种肿瘤发生的影响癌细胞体外肿瘤并招募网站和导致体内肿瘤的生长和发展,如在乳腺癌(12,13),前列腺癌(14),肝细胞癌(15,16],头部和颈部癌症[17),和胃癌18]。相比之下,一些报告表明hMSCs抑制肿瘤生长,可用于有效cytotherapy在不同肿瘤模型(19,20.]。例如,何鸿燊等人表明,肿瘤骨骨髓来源msc可以专门招募网站和减少神经胶质瘤的肿瘤体积(21]。Yulyana等人肝癌模型表明,条件媒体源自人类胎儿msc可以抑制肝癌癌细胞增殖,减少肿瘤负荷(22,23]。马等人发现,人类脐带间充质干细胞显著抑制乳腺癌细胞的生长在体外和体内,可能在细胞周期arrest-related方式(24]。另外,羊水和羊膜membrane-derived msc可以诱导细胞周期阻滞于G0 / G1期,并显著降低不同肿瘤细胞株的增殖,包括海拉细胞(人类细胞系宫颈上皮癌),圣细胞(人类骨肉瘤细胞系)25,26),Skov-3(人类卵巢癌上皮细胞系)27),KG1细胞(人类急性髓系白血病细胞株),Jurkat细胞(人类t细胞白血病细胞系),和U937细胞(人类单核细胞的细胞系获得组织细胞的淋巴瘤)。虽然来自不同来源的msc的抗癌作用的研究已经广泛报道,很少有人关注人类的月经血干细胞和脐带干细胞相比,(hMBSCs)。hMBSCs表型和属性类似于骨髓(BM) msc,包括高增殖能力,multilineage分化潜力,和表面标记表达式(28,29日]。hMBSCs具有低免疫原性、低致肿瘤性和非凡的再生能力(30.,31日]。此外,隔离hMBSCs程序是安全的,简单的,没有伦理问题(32]。大量报道了hMBSCs的治疗潜力在不同的疾病,如阿尔茨海默病(29日),急性肺损伤(33心脏纤维化(),28,34],暴发性肝衰竭[35),和糖尿病(36]。然而,hMBSCs在癌症治疗的治疗潜力,包括宫颈癌,尚未报道。

我们组最近从女性的经血和孤立hMBSCs特征形态,表型资料、多能性和增长潜力。确定hMBSCs是否具有对海拉细胞体外抗肿瘤的影响,hMBSC-conditioned介质(CM)和transwell coculture系统被用来检测hMBSC-secreted因素对扩散的影响,入侵,海拉细胞的细胞周期进程。在体内,我们建立了海拉/ NIH 3 t3 -和海拉/ hMBSC-coinjected异种移植BALB / c裸小鼠模型。我们发现hMBSCs抗癌效果当cocultured或coinjected海拉细胞诱导细胞周期阻滞。ELISA, TGF -β人类TGF - 1抗体,重组β1 (rhTGF -β1)被用来确认TGF -β1的细胞周期调控细胞因子分泌hMBSCs施加海拉细胞的抑制作用。我们还发现TGF -β1可以移植的表达phospho-JNK phospho-P21海拉细胞。总的来说,结果表明TGF -β1 hMBSCs释放的抑制宫颈癌增长体内和体外通过激活物P21 /信号。

2。材料和方法

2.1。隔离hMBSCs和厘米的生产

hMBSCs被孤立的从女性捐赠者如前所述28,36用细微的修改。隔离过程和知情同意签署形式志愿捐献者都是南昌大学的伦理委员会批准。月经的血液样本收集DivaCup(厨师、在加拿大)从健康女性月经来潮。单核细胞通过密度梯度离心法分离Ficoll-Paque(热费希尔科学生命科学的城市村庄,哦)。简要8毫升经血在慢慢之上4毫升Ficoll-Paque高端解决方案在一个15毫升聚丙烯离心管。管放入摆动斗离心机在1800 rpm 20分钟,将样本划分为三层:上层包含等离子体中,单核细胞在夹层原状,底层主要含有红细胞。然后小心的上层。PBS的层间细胞被收集和清洗三次。纯化单核细胞培养αmem培养基(热费希尔)含有10%的边后卫,谷氨酰胺1%和1%青霉素和链霉素(热费希尔),补充18% Chang B和2% Chang C在37°C(欧文科学)5%的股份有限公司₂湿润的气氛。媒体改变了每2 - 3天,直到贴壁细胞confluency -90%增长到80%,然后是细胞用0.25%胰蛋白酶(热费希尔)亚文化。细胞在段落2到5用于后续实验。

hMBSC-CM准备如下: hMBSCs被放置在一个10厘米菜(美国纽约康宁)和正常培养基培养。confluency一旦细胞达到80%,中改为H-DMEM(热费希尔)含100 U /毫升青霉素和链霉素。hMBSC-CM收集48 h后,离心机在室温下5分钟,每分钟1000转的上层清液收集和集中十倍(10 x)使用一个Amicon®超3 k设备(美国MilliporeSigma)。

2.2。通过流式细胞术hMBSCs的识别

表型分析培养hMBSCs进行使用标准的流式细胞术方法。通过收集3 hMBSCs fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)管(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)的浓度 细胞/毫升染色流式细胞仪缓冲区(PBS包含2%的边后卫),然后沾FITC-conjugated抗体人类CD29, CD90、CD45、HLA-DR, CD80、CD40,藻红蛋白——(PE)共轭抗体人类CD73 CD105、CD34, HLA-ABC CD86和他们同形像控制(所有从BD生物科学)在4°C在黑暗中30分钟。洗两次后,这些细胞被resuspended在200年μl PBS和收购FACSCalibur仪器(BD生物科学)。日期进行了分析使用FLOWJO™软件(TreeStar, Inc .,亚什兰,或者,美国)。

2.3。免疫荧光

免疫荧光实验进行按照我们之前报道的协议(37]。简单地说,细胞生长在载玻片和4%多聚甲醛固定15分钟和permeabilized使用0.25% Triton x - 100在室温下在PBS稀释了10分钟。阻止非特定的抗原表位,细胞被孵化与含有1% BSA和0.1%的PBS Tween-20 1 h。为了评价hMBSCs的多能性,我们使用以下抗体:兔子anti-OCT₄(5μg / ml, Abcam,南昌,中国),鼠标anti-SSEA-4 (15μg / ml, Abcam),兔子anti-Nanog(1: 200年,Abcam)。固定细胞孵化一夜之间在4°C主要抗体其次是孵化与次要驴anti-mouse或anti-rabbit抗体共轭Alexa萤石488或Alexa萤石568(杰克逊,南昌,中国)。核与DAPI复染色(热费希尔)。

2.4。脂肪形成的和成骨分化

通过3 hMBSCs被播种密度 细胞/在six-well板。融合细胞达到100%时,OriCell™人类间充质干细胞脂肪形成的分化培养基(Cyagen生物科学,中国上海)添加到井根据制造商的指示。28天的感应后,油红O染色(Cyagen生物科学)进行评估的分化潜能脂肪形成细胞内脂滴的形成。成骨分化,hMBSCs培养了OriCell™人类间充质干细胞成骨分化培养基(Cyagen生物科学)10天,21天分析中期和后期的成骨分化阶段。骨分化潜力评估通过碱性磷酸酶(ALP) (Cyagen生物科学)染色在中间阶段和茜素红(pH值4.2,40毫米)在后期阶段(Cyagen生物科学)染色。

2.5。体外Coculture实验

人类宫颈癌NIH 3 t3细胞行海拉和成纤维细胞系得到来自美国类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)和培养high-glucose DMEM(热费希尔)含有10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素在37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂。

海拉细胞被使胰蛋白酶化和播种6-well菜 细胞/。接受pbs对照组,细胞被孵化与3毫升H-DMEM含有青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。hMBSC-CM集团海拉细胞培养了3毫升H-DMEM补充10% hMBSC-CM(10倍),10%的边后卫,1%青霉素和链霉素。为coculture集团coculture transwell室(直径2.4厘米,0.4μ米孔隙大小;康宁)被用来评估hMBSCs海拉细胞在体外的影响。海拉细胞被播种到众议院的浓度 细胞/在2.0毫升H-DMEM以10%的边后卫 hMBSCs被播种在上层舱中(图1.0毫升的相同1(一))。样本收集后培养24、48和72 h。

2.6。肿瘤细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期分析

细胞增殖是在表示时间点确定使用CCK-8工具包(Dojindo实验室、熊本、日本),制造商的协议。我们增加了10%的CCK-8解决每个对3 h之前使用微型板块分光光度计测量吸光度在450海里(Bio-Rad)。

细胞凋亡的检测, 细胞从每个样本收集和resuspended在100年μ包含5 l膜联蛋白V绑定解决方案μl膜联蛋白V-FITC和5μl propidium碘(π)解决方案(Dojindo)。孵化后在室温下15分钟,细胞在PBS洗,在100转离心5分钟,并在400年resuspendedμl膜联蛋白V绑定缓冲。细胞周期检测,细胞被固定在冰预冷乙醇70% 2 h,在100转离心5分钟,resuspended 400μlπ和100μl RNaseA (Dojindo)。30分钟后孵化在4°C,细胞被洗和resuspended PBS。检测细胞凋亡和细胞周期运行化验和分析与BD爵士乐。

2.7。愈合试验

海拉细胞被播种在6-well板的浓度 细胞/。confluency当细胞达到100%,200年无菌μl吸管提示被用来创建一个伤口在细胞单层。与PBS细胞碎片被轻轻地,PBS的细胞治疗,hMBSC-CM或hMBSCs。37°C的菜肴是孵化有限公司5%₂空气气氛24小时和48小时。图像是在24小时和48小时时间点和测量使用Image-Pro + 6.0软件。

2.8。入侵检测

BD基底膜基质™入侵钱伯斯(8μ孔隙大小,妈,美国)被用来调查hMBSC-CM的影响和hMBSCs海拉细胞入侵。海拉细胞( )被添加到参议院,hMBSCs或条件媒体来自hMBSCs被添加到底层。控件包含只有DMEM 10%的边后卫在底部。孵化后48 h在37°C,钱伯斯是固定的。Noninvaded细胞刮掉上面的室,和插入与结晶紫染色。图片使用相差显微镜拍摄。

2.9。免疫印迹分析

蛋白质提取准备从海拉细胞裂解缓冲包含25毫米玫瑰(pH值7.4),1% NP40, 137毫米氯化钠,10%的甘油,50 mM氟化钠,和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,曼海姆,德国)。细胞提取物在4°C在13000转离心10分钟去除不溶性碎片和染色体DNA。总的来说,60μg细胞总蛋白质的变性运行在10% sds - page凝胶,然后转移到硝化纤维素膜(Bio-Rad),与初级抗体anti-GAPDH孵化(1:1000年,兔单克隆,Santa Cruz), anti-Bax(1: 1000年,兔多克隆,细胞信号技术),anticaspase 3(1: 1000年,兔多克隆,Abcam), anti-PCNA(1: 1000年,鼠标单克隆,Abcam),和anti-BCL2(1: 1000年,兔单克隆,Abcam)一夜之间在4°C。墨迹检测辣根过氧化物酶,(合)共轭山羊anti-rabbit或兔子anti-mouse二级抗体(英杰公司)在室温下1 h。图像量化使用SuperSignal西Pico或毫微微化学发光检测系统(皮尔斯)。

2.10。海拉细胞异种移植模型和全身荧光成像

雄性BALB / c裸小鼠(8周)从长沙SLAC实验动物购买公司(长沙,中国,http://www.hnsja.com/)和保持在12 h与食物和水可用光/暗周期随意南昌大学实验动物中心。综述了所有动物这里描述程序和批准的动物保健和使用委员会南昌大学。

为目的的细胞跟踪,hMBSCs和NIH 3 t3细胞被贴上PKH26红色荧光染料(σ,奥尔德里奇)之前coinjection海拉细胞。海拉细胞被混合了NIH 3 t3细胞(对照组)或hMBSCs(实验组)1:1的比例( : 细胞; )和皮下注入背地区BALB / c裸小鼠。小鼠麻醉后7天、14天、21天全身的细胞注入和可视化荧光成像系统(LB983;贝特,德国)。小鼠安乐死21天的细胞注射后,和肿瘤被收获,用游标卡尺测量(三丰公司有限公司,日本东京)。肿瘤体积计算使用以下公式: ( :最长的大小的肿瘤, :最短的大小的肿瘤)。

2.11。组织病理学和TUNEL分析

经过21天的海拉/ NIH 3 t3或海拉/ hMBSC coinjection,小鼠安乐死与戊巴比妥和肿瘤组织被孤立和固定在4%多聚甲醛,嵌在石蜡中。组织切成5μ米厚的部分。deparaffinization和补液后,部分是在PBS冲洗,然后孵化3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶解决方案。与5% BSA孵化后30分钟来阻止非特异性抗体结合网站,增殖细胞核抗原主要样本沾抗体(1:1000年,鼠标单克隆,Abcam)一夜之间在4°C。样本冲洗两次与PBS和孵化HRP-conjugated山羊anti-mouse二级抗体(MaiXin生物技术,中国)其次是可视化与3、3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (MaiXin生物技术)。最后,部分与苏木精染色,光学显微镜下检查。

细胞凋亡分析对石蜡的肿瘤组织的部分海拉/ NIH 3 t3 -海拉/ hMBSC-coinjected组TUNEL分析工具包(美国微孔)。三个部分被选为每个鼠标和使用TUNEL染色试验设备制造商的协议。在显微镜下,细胞与深棕色核标记为积极和统计每裸鼠随机挑选的10个领域里共有4裸体小鼠每组中。

2.12。酶联免疫吸附试验(ELISA)

TGF -β1表达hMBSC-CM使用定量执行人类酶联免疫试剂盒(研发系统)后,制造商的协议。

2.13。体外治疗TGF -β1抗体和rhTGF -β1

TGF -β1抗体和rhTGF -β1被用于治疗海拉细胞和评估是否TGF -β1导致细胞周期阻滞。中和TGF -β1,TGF -β这个例子抗体被添加到transwell系统的最终浓度10 ng / ml 48 h。特异性的兔免疫球蛋白作为消极的控制。rhTGF -β1是用来治疗海拉细胞48 h,然后细胞生存能力和细胞周期进行了分析。

2.14。统计分析

结果给出了平均水平 偏差(SD)。学生的 - - - - - -两组之间的测试是用于分析。单向方差分析(方差分析)是用于比较数据三个或更多人群。差异与< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。形态和Immunophenotyping hMBSCs

培养小学和通道hMBSCs纺锤状,呈形态学,同质层的增长。在bFGF (10 ng / ml),强劲hMBSCs增殖和平均倍增时间为2天(图2(一个))。hMBSCs间充质干细胞阳性标记CD29, CD73 CD105, CD90和负造血干细胞标记CD34、CD45由流式细胞术(图2 (b))。hMBSCs还表示的主要组织相容性蛋白质HLA-ABC但costimulatory CD80分子,CD86和CD40和主要组织相容性蛋白质HLA-DR(数字2 (b)和2 (c)),这表明这些细胞具有低免疫原性。胚胎干细胞表面标记物的表达Nanog, Oct4、SSEA-4被免疫荧光分析。我们的研究结果表明,hMBSCs表达这些多能标记(图2 (d)),表明hMBSCs有能力自我更新以及multilineage分化潜力。脂肪形成的和成骨分化条件下,hMBSCs能够分化成脂肪细胞和骨细胞,分别(图2 (e))。

3.2。hMBSCs抑制增殖、迁移和入侵海拉细胞在体外以旁分泌的方式

为了调查的影响hMBSCs和hMBSC-CM海拉细胞体外增殖和入侵,我们比较了PBS对照组,hMBSC-CM组和hMBSC coculture组(图1(一))。细胞计数分析表明,hMBSC-CM(10%)和hMBSC coculture(海拉细胞比率:hMBSCs 1: 1)显著降低细胞的海拉细胞48 h和72 h(数字1 (b)和1 (c)),这表明hMBSC-secreted因素影响了海拉细胞的增殖。CCK-8试验进一步证实,显著抑制活力海拉细胞被hMBSC-CM诱导,hMBSC coculture相比控制48 h和72 h(图1 (d))。确定的影响hMBSC-CM海拉细胞增殖的摄入量有关,海拉细胞培养了3毫升H-DMEM完全培养基补充了越来越多(2.5%、5%、10%、20%)的hMBSC-CM (10 x) 48 h。我们发现,海拉细胞表现出显著降低扩散为5%,10%和20% hMBSC-CM(10倍)( )。相比之下,2.5% hMBSC-CM (10 x)没有显著抑制海拉细胞的生长。10% hMBSC-CM治疗组相比,略有下降但无意义的海拉细胞扩散也观察到20%的hMBSC-CM治疗组(图1 (e))。为体外transwell coculturing实验,海拉细胞被培养在不同浓度的hMBSCs(海拉细胞比率:hMBSCs 4: 1, 2: 1, 1: 1,或1:2)。扩散的比例显著降低时,海拉细胞:hMBSCs是1:1和1:2。然而,没有明显的区别1:1组和2组被发现(图1 (f))。因此,在后续的实验中,我们讲究的海拉细胞10%厘米,transwell设置,海拉细胞被培养在1:1与hMBSCs比率。

擦伤的伤口分析是用来确定hMBSC-CM的影响以及hMBSC coculture海拉细胞的迁移。PBS组相比,hMBSC-CM和hMBSC cocultures显著抑制海拉细胞迁移到伤口后24小时和48 h。然而,hMBSC-CM组之间无显著差异,hMBSC coculture组观察(图3(一个))。在24小时,伤口闭合的百分比 % hMBSC-CM组和 %的hMBSC coculture组,而在PBS对照组, %。在48 h,百分比 %, %, 分别为%(图3 (b))。BD基底膜基质™入侵室用于入侵检测。海拉细胞的入侵是显著降低的为期两天的coculture hMBSC-CM和hMBSCs %, %的控制,分别为(数字3 (c)和3 (d))。总的来说,这些结果表明,hMBSCs可以抑制增殖,迁移,和海拉细胞体外入侵,以旁分泌的方式。

3.3。hMBSCs诱导G0 / G1细胞周期阻滞在海拉细胞体外

为了更好地理解所涉及的机制的抗增殖活动hMBSC-CM和hMBSC coculture,我们进行细胞凋亡和细胞周期分析。如图4(一)在观察细胞周期,显著的不同,而大部分hMBSC-CM-treated和hMBSC cocultured海拉细胞显著( )更大比例的细胞在G0 / G1期(被捕 %, 分别为%)比正常的细胞培养介质( %)。与此一致的是,流式细胞仪分析还显示较低比例的海拉细胞的S期细胞周期在hMBSC-CM hMBSC coculture组( %, 分别为%)比PBS对照组( %)(图4 (b))。相比之下,与PBS组相比,在海拉细胞凋亡细胞没有明显不同的反应hMBSC-CM治疗和hMBSC coculture(数字4 (c)和4 (d))。

确认hMBSC-secreted因素可以在海拉细胞诱导细胞周期阻滞,我们检测PCNA的表达KI67(两个扩散的蛋白质)的免疫印迹分析。结果表明,在海拉细胞增殖细胞核抗原、KI67的蛋白质含量显著减少hMBSC-CM和hMBSC coculture治疗,相比之下,接受pbs的细胞。两种apoptosis-related蛋白质的表达,在hMBSC-CM caspase-3和伯灵顿,没有明显不同,hMBSC coculture治疗海拉细胞(数字4 (e)和4 (f))。这些结果表明,hMBSC-CM hMBSC coculture可以抑制海拉细胞的增殖,诱导细胞周期阻滞于G0 / G1期。

3.4。海拉细胞体内hMBSCs抑制增长

hMBSCs和NIH 3 t3细胞的影响在海拉细胞体内被皮下注射测试coinjecting他们与海拉细胞1:1的比例( : 细胞; )在一边的肩胛区BALB / c裸小鼠。海拉细胞仅被用作对照组。细胞跟踪目的,hMBSCs和PKH26 NIH 3 t3细胞被标记。来验证是否hMBSCs和NIH 3 t3细胞存在于肿瘤、小鼠麻醉后7天,14天,21天全身的细胞注入和可视化荧光成像系统。如图5(一个),hMBSCs显然是观察到的肿瘤组织,但逐渐减少了7点,14日,注射后21天。NIH 3 t3细胞也观察到肿瘤在第七天,14天,但是没有NIH 3 t3细胞检测到21天。因此,牺牲的时候(注射后21天),仍有一些hMBSCs但没有NIH 3 t3细胞肿瘤。小鼠安乐死21天的细胞注射后,肿瘤组织是收获。疣状分析表明PKH26-positive细胞也表达了DAPI,这表明hMBSCs肿瘤还活着(图中5 (b))。我们发现hMBSCs显著降低肿瘤异种移植的平均体积和平均体重与海拉细胞单独组和海拉/ NIH 3 t3-coinjected组。相比之下,海拉细胞单独组之间没有显著差异和海拉/ NIH 3 t3组观察(数据5 (c)- - - - - -5 (e))。从免疫组织化学分析结果表明,hMBSCs显著下降的积极利率PCNA在海拉/ hMBSC-coinjected肿瘤组织比仅在海拉细胞组织和海拉/ NIH 3 t3-coinjected肿瘤组织(数字5 (f)和5 (g)),这与体外结果是相一致的。为了测试治疗在肿瘤组织hMBSCs对细胞凋亡的影响,从海拉细胞单独部分,海拉/ NIH 3 t3-coinjected和海拉/ hMBSC-coinjected组TUNEL染色。没有观察到显著减少细胞凋亡在海拉/ hMBSC组相比,海拉细胞单独组和海拉/ NIH 3 t3组,表明hMBSCs不加速海拉细胞体内的细胞凋亡(数字5 (h)和5(我))。无显著差异,观察细胞增殖和细胞凋亡在海拉/ NIH 3 t3组相比单独海拉细胞组(数字5 (f)- - - - - -5(我))。

3.5。hMBSCs在海拉细胞的抑制作用是通过TGF -介导的β1

白细胞介素- 6 (il - 6) (38),α/β干扰素(正α/β)[39],集落刺激因子(gm - csf) [40),dickkopf-1 (shh) [41],TGF -β1 (25,27,42)据报道不断由msc分泌和参与控制细胞增殖的机制。确定哪些hMBSC-derived因素导致海拉细胞的细胞周期阻滞,我们添加了il - 6,正无穷α/βgm - csf,消退,TGF -β1抗体transwell系统。我们发现的抑制作用hMBSC coculture只能抑制TGF -β1抗体,表明hMBSC-secreted TGF -β1中扮演一个重要的角色在海拉细胞诱导细胞周期阻滞(图6(一))。确认是否海拉细胞诱导的细胞周期阻滞hMBSCs被TGF -介导的β1,我们首先发现了TGF -β1浓度hMBSC-CM ELISA。我们的研究结果表明,大量的TGF -β1 (1057 pg / 10⁵细胞,5.29 ng / ml)被分泌到培养基hMBSCs在48 h。中没有的边后卫设置为负的控制。此外,我们添加了TGF -β1抗体(10 ng / ml)向transwell体系和评估海拉细胞的细胞周期进展48 h。我们的研究结果表明,TGF -β1抗体明显减少的比例海拉细胞G0 / G1期 % (coculture组) % (coculture + TGF -β1组)( )。显著增加( )从 %, % S期细胞也观察到当TGF -β1抗体加入transwell系统。这些结果表明,TGF -β1抗体逆转hMBSC-induced细胞周期阻滞。为了进一步确认TGF -的影响β1在海拉细胞细胞周期进展,rhTGF -β1添加治疗海拉细胞和细胞周期被流式细胞术进行评估。与PBS组相比,rhTGF -β1诱导显著降低S期和显著增加在海拉细胞G0 / G1期(数字6 (b)和6 (c))。确认TGF -β1 coculture系统是由hMBSCs分泌而不是海拉细胞,免疫印迹分析用于检测TGF -的表达β1 hMBSCs、海拉细胞和海拉细胞cocultured hMBSCs。我们发现hMBSCs TGF -的高表达β1。相比之下,海拉细胞条件都不利于TGF -β1(图6 (d))。

物与蛋白质的磷酸化稳定P21 [43),这是一种消极监管机构相关的细胞周期和可能的TGF -β1-induced生长抑制(44]。免疫印迹分析表明,hMBSCs显著降低PCNA的表达增加phospho-JNK的表达和phospho-P21 cocultured海拉细胞比PBS对照组。与hMBSCs + TGF -海拉细胞治疗β1抗体,观察phospho-JNK水平的降低和phospho-P21相比,海拉细胞只有hMBSCs处理。phospho-JNK的表达水平和phospho-P21也是调节rhTGF -β1-treated细胞(图6 (e))。这些结果表明,宫颈癌抑制效应来自hMBSCs由TGF -β1,随后upregulation phospho-JNK phospho-P21信号级联。

4所示。讨论

hMBSCs是一种新发现的msc和有许多重要的优势如非侵入式隔离程序,低免疫原性,没有致肿瘤性、高增殖潜能,和没有道德冲突。在这项研究中,我们发现hMBSCs表达高水平的三个核心多能性蛋白质(OCT4、SSEA-4 Nanog)和MSC标记CD29, CD73, CD105、CD29。然而,hMBSCs并不表达CD34、CD45 hematopoiesis-specific标记(图2 (b))。脂肪形成的和成骨分化条件下,hMBSCs有可能分化成脂肪细胞和骨细胞,分别(图2 (e))。这些观察表明,hMBSCs BM-MSCs特征相似,multilineage分化潜能。人类白细胞抗原(HLA)系统代表了基因座的基因扮演着重要的角色在决定捐助者与接受者的免疫相容性在器官移植45]。非常低水平的HLA一级(抗原/ B / C)和II (HLA-DR和DQ)分子在hMBSCs[已报告28]。我们的结果也表明HLA-DR hMBSCs为负,CD80、CD86和CD40 HLA-ABC(数据的低表达2 (b)和2 (e)),表明弱免疫原性和潜在的hMBSCs移植后免疫耐受。这些特征使hMBSCs癌症治疗的理想候选人。

有报告显示,人类子宫内膜间质干细胞来源于经血减弱卵巢癌上皮(转换端)增长通过诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡在转换端细胞体外和体内46]。hMBSCs是否提供其他癌症细胞抗肿瘤特性,特别是宫颈癌,从未被报告过。在这篇文章中,我们测试的抗肿瘤特性hMBSCs对宫颈癌细胞在体外和体内。最近报道,CM来源于脂肪msc (47)和人类的ESCs (48]发现抑制扩散而不是细胞死亡在肝细胞癌(HCC)、卵巢癌和前列腺癌。阐明hMBSCs是否通过旁分泌信号抑制肿瘤增殖,hMBSC是用于transwell coculture系统检测hMBSC-secreted的影响因素对海拉细胞的扩散。首先,细胞治疗PBS或cocultured与NIH 3 t3。与PBS组相比,我们发现NIH 3 t3 coculture并不影响扩散、迁移和入侵海拉细胞。因此,为了减少实验小组,我们只使用了PBS组的负控制体外实验。与之前的报道相一致,我们发现hMBSC-CM和hMBSC coculture可以抑制增殖,迁移和入侵海拉细胞体外(数字1和3)。然而,我们没有观察到显著水平的细胞死亡由hMBSCs(数字4 (c)- - - - - -4 (f))。我们还发现hMBSCs降低PCNA的表达KI67的海拉细胞治疗hMBSC-CM或与hMBSCs cocultured。此外,流仪分析表明,hMBSC-CM和hMBSC coculture显著诱导在海拉细胞G0 / G1细胞周期阻滞在S期细胞明显降低。没有显著差异在海拉细胞治疗hMBSC-CM或与hMBSC cocultured。我们还展示了hMBSCs体内抑制海拉细胞增殖的能力。

我们coinjected海拉细胞NIH 3 t3细胞或hMBSCs BALB / c裸在1:1比例,海拉细胞仅被用作控制。全身荧光成像分析表明,hMBSCs存在于肿瘤组织,逐渐减少了7点,14日,注射后21天。NIH 3 t3细胞也观察到肿瘤在第七天,14天,但是没有NIH 3 t3细胞被发现(图21天5(一个))。肿瘤的平均体积和平均体重减少海拉/ hMBSC组相比,海拉细胞单独组和海拉/ NIH 3 t3组(数字5 (c)- - - - - -5 (e))。这些数据表明,分泌的抑制因素从hMBSCs发挥重要作用在海拉细胞的生长抑制作用27]。

具体由msc分泌可溶性抗增殖因素仍然未知。TGF -β1是公认的有效抑制剂内皮细胞增生,上皮细胞,肿瘤细胞(49]。陈等人发现TGF -β1抑制细胞生长和DNA合成和诱导G0 / G1细胞周期阻滞(50]。部等人发现,人类羊膜上皮细胞分泌大量的TGF -β1,降低卵巢癌上皮细胞的增殖,诱导G0 / G1细胞周期阻滞肿瘤细胞在体内和体外27]。il - 6 (38),正α/β(39],gm - csf [40),和消退41)据报道不断由msc分泌和参与控制细胞增殖的机制。确定哪些hMBSC-derived因素是海拉细胞的细胞周期阻滞,我们添加了TGF -β1、il - 6,正无穷α/β、gm - csf和shh抗体transwell系统。我们发现的抑制作用hMBSC coculture TGF -只能抑制β1抗体(图6(一)),这表明hMBSC-secreted TGF -β1中扮演一个重要的角色在海拉细胞诱导细胞周期阻滞。接下来,我们评估了扩散对治疗的反应的变化与rhTGF——海拉细胞β1。结果表明,rhTGF -β1诱导显著降低S期和显著增加海拉细胞G0 / G1期(数字6 (b)和6 (c))。研究结果证实了我们的假设,TGF -β1由hMBSCs负责分泌的抑制海拉细胞增殖的潜力。

在某些情况下,TGF -β1据报道磷酸化调节物,协调细胞反应压力和影响细胞生长调节和转换(27]。脐带tissue-derived msc诱导细胞凋亡在曲泽前列腺癌细胞的差别通过激活物和对这些PI3K / AKT信号(51]。尽管我们发现hMBSC-CM的抑制效果和hMBSC coculture在海拉细胞施加通过抑制细胞增殖,而不是通过调节细胞凋亡,hMBSC-CM phospho-JNK的表达水平和hMBSC coculture组相比显著增加控制。然而,我们的研究结果表明,PI3K和AKT的表达水平这三个组之间没有显著差异。P21,稳定物(52),是肿瘤发生的重要调节器通过调节和抑制肿瘤细胞周期阻滞和/或细胞凋亡(53]。Magatti等人发现,P21的表达可以通过msc和随后的抑制调节细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs),导致细胞周期阻滞(25]。我们的数据表明,激活phospho-JNK调节phospho-P21 hMBSC-CM和rhTGF——的表达β1-treated海拉细胞(图6 (e))。这些结果表明,hMBSCs抑制通过TGF -海拉细胞的增殖βP21 1-mediated物/信号。

5。结论

我们发现小说内在anticervical癌症hMBSCs体内和体外的属性。此外,我们表明,hMBSCs分泌高水平的TGF -β1、隔离和抑制海拉细胞增殖,诱导细胞周期阻滞。TGF -的抑制作用β1是明显的从phospho-JNK和phospho-P21水平的增加和减少海拉细胞增殖。本研究支持使用hMBSC-based对宫颈癌抗肿瘤治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。任何额外的信息数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者证实不存在利益冲突。

确认

这项工作是由江西省科技部门的支持(20122 bab215021魏L, 2018 acb21043刘QW, 20171 bab215039胡P,和20122 bab215020陈HW),江西省教育部门(GJJ150214刘QW、GJJ14484李司法院,胡和GJJ150195 P),从南昌大学科学基金会赠款(06301204胡刘QW和06301132 P),以及中国的国家自然科学基金(81760118胡刘QW和81760505 P)。作者感谢健康的捐赠者从南昌大学第一附属医院请提供经血。

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