自发形成的球状体从老鼠紧凑Bone-Derived细胞保持高度有效的干细胞具有增强的分化能力

文摘

从我们最近的研究结果显示,两个截然不同的spheroid-forming机制的存在,即、自发和机械。在这项研究中,我们集中在自发形成的球状体,自发形成的球状体的特点从老鼠紧凑bone-derived细胞(CBDCs)探索。细胞(C57BL / 6 j)鼠标腿骨被孤立,和紧凑的bone-derived细胞培养后酶消化。自发形成球体培养板上实现了与特定的水接触角报道。胚胎干细胞标记的表达水平进行了分析使用免疫荧光定量逆转录聚合酶链反应。然后,细胞诱导为成骨的球状体和神经性的血统。自发形成的球状体从CBDCs ES细胞阳性标记,如SSEA1 Sox2, Oct4、Nanog。此外,fucosyltransferase 4的表情/ FUT4 (SSEA1) Sox2, Nanog明显高于单层培养细胞。间充质干细胞的基因表达标记在球状体和monolayer-cultured细胞几乎相同,但在球状体本来就较高的表达。Spheroid-derived细胞显示成骨和神经源性标记表达显著高于monolayer-cultured细胞后诱导。 Spontaneously formed spheroids expressed stem cell markers and showed enhanced osteogenic and neurogenic differentiation capabilities than cells from the conventional monolayer culture, which supports the superior stemness.

1。介绍

成体干细胞有很大的潜在的用于组织修复和再生。其中,间充质干细胞(msc)广泛使用不仅对临床应用基础研究也如骨组织工程(1,2]。贴壁细胞的二维(2 d)文化一直作为标准技术体外扩大msc、这是一个相对简单和普遍接受的协议(3,4]。然而,一些报道显示的直接损失干细胞在文化的特征,如导航能力,复制能力,克隆形成和分化能力(5- - - - - -9]。为了克服这些缺点,小说的潜力已经探索过细胞培养协议(10- - - - - -15]。

体干细胞的一个重要突破文化的发现一个浮动的文化中,这是首次报道对神经干细胞(16]。神经干细胞的存在长期受到质疑。然而,他们孤立于胚胎大脑使用这本小说文化协议,使选择性,细长的神经干细胞的生存和扩张(球状体16- - - - - -19]。此后,这项技术已经应用于选择性文化各种成体干细胞,包括间充质干细胞(20.- - - - - -23]。与传统的二维细胞培养相比,是一种球状体三维(3 d)文化和被认为复制细胞的生理环境的能力,从而更好的保护体干细胞的特点(24,25]。3 d文化的限制包括有限增长间充质干细胞(26)和低文化效率当自发形成的球体27]。

有几种不同的方法来生成球状体(例如,转轮烧瓶法、液体覆盖法,和悬滴法)(28,29日]。然而,球状体之间的差异,来自不同的文化协议,尚未显示。在这项研究中,球体形成在静态条件下实现在盘子里与一个特定的水接触角,这是大约90°。用这种方法因为球体形成自发发生,我们这种类型的球体定为一个自发形成的球体(27]。虽然自发形成的球状体的区别和机械形成球状体(如转轮瓶方法)不是众所周知,自发地形成理想的球状体由一个单纯干细胞群,因为球体形成从干细胞,具有增殖能力足以形成球状体。另一方面,机械形成球状体可能包含各种类型的细胞由于被迫聚合周围细胞(27,30.]。然而,大多数的报道研究没有关注这两个方法的差异,尤其是,自发形成的球状体的特点与间充质干细胞并没有被很好的理解。

最深入研究和广泛使用的细胞来源间充质干细胞是骨髓间充质干细胞(BMMSCs)。然而,一些最近的报告表明,紧凑bone-derived细胞(CBDCs)优越的细胞来源与BMMSCs因为CBDCs拥有更高的增殖和多能分化能力(31日- - - - - -36]。在这项研究中,我们专注于自发形成的球状体从CBDCs潜在特征体干细胞来源。据我们所知,这是第一个报告自发形成和spheroid-forming细胞从老鼠CBDCs球状体。

2。材料和方法

所有程序实验研究中进行按照守则由美国国家卫生研究院(NIH)在美国,关于实验的动物保健和使用程序,和松本牙科大学委员会批准校内的动物使用(289号)。

2.1。制备小鼠CBDCs

培养协议CBDCs是根据我们之前的协议进行的出版与一些修改(31日]。短暂,雄性C57BL / 6 j小鼠(3周大,SLC日本滨松,日本)牺牲了过量的麻醉剂。股骨和胫骨脱离树干,软组织和骨表面彻底删除。松果体被削减,骨髓是取出使用注射器和27-gauge针和培养基组成的α最小必不可少的媒介与谷氨酰胺和酚红(α和光纯化学工业有限公司,mem, kouichi大阪,日本),补充1% penicillin-streptomycin-amphotericin B方案(以色列贝特Haemek生物产业有限公司,基布兹拜特Haemek,以色列)。骨后颜色变得苍白,骨头被安置在磷酸盐(PBS;Wako纯化学工业有限公司,日本大阪),小心翼翼地用剪刀切成1 ~ 2毫米的片段。然后,骨头芯片被转移到50毫升离心管包含20毫升的PBS 0.25%胶原酶(Wako纯化学工业有限公司,日本大阪)和20%胎牛血清(的边后卫;擤鼻涕、法国)。管被放置在一个颤抖的孵化器在37°C的震动速度90 rpm。45分钟的孵化后,细胞被收集和转移到另一个通过40管μm细胞过滤器(猎鹰®,康宁,纽约,美国)。管离心5分钟在300 g在4°C。上层清液被免职,细胞颗粒轻轻resuspendedαmem补充10%的边后卫,1% penicillin-streptomycin-amphotericin解决方案,和10 ng / ml重组人类basic-fibroblast生长因子(bFGF;PeproTech,落基山,新泽西,美国),用作基本培养基。细胞悬液被播种到培养皿(美国康宁猎鹰®)的密度 。收集并放置在一个骨片 细胞培养皿2毫升的基本培养基收集额外的细胞。主细胞培养在37°C公司5%₂湿润孵化器。媒介是改变每三天。当细胞融合达到70 - 80%,0.25%的细胞分离trypsin-EDTA (Gibco:生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)和亚文化在新的培养皿的密度 细胞/厘米²直到subconfluent。

2.2。CBDC球体形成

球体形成的方法是根据我们之前的协议进行的出版(27]。简而言之,通过2 CBDCs resuspended在基本培养基和转移到 粘附力减小培养皿(1、大阪、日本)的密度 细胞/厘米²对球体形成,在37°C的环境有限公司5%₂湿润孵化器。我们初步的密度进行优化实验(数据未显示)。球状体的大小和数量是使用一个倒置显微镜观察(奥林巴斯IX70,奥林巴斯光学有限公司,东京,日本)在12日24,72小时。在每个观测时间点,大小的球状体测量使用6个随机选择的字段(100 x放大)培养板的5个独立的实验。显微照片拍摄和用于测量球状体的直径1.15使用奥林巴斯cellSens标准软件。球状体的数量计算使用相差显微镜40 x放大,覆盖整个盘子。

2.3。成骨和CBDCs神经性的感应

经过24小时的球体形成球状体都被转移到新的传统文化菜肴让球状体高度和传播在培养皿底部的单层生长。当CBDCs在单层培养或球状体达到50 - 60%融合,基本培养基是取代成骨诱导介质(基本培养基,补充了100 nM地塞米松(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),50μ和光纯化学工业,M L-ascorbic酸磷酸(kouichi有限公司),和10毫米甘油磷酸二钠盐水合物(Sigma-Aldrich))或神经性感应介质(基本培养基,补充50 ng / ml重组神经生长因子,50 ng / ml重组脑源性神经营养因子,和10 ng / ml重组NT-3(所有三个试剂从PeproTech岩石山,新泽西,美国))。在诱导过程中,媒体改变了每两天。

2.4。碱性磷酸酶(ALP)活性测定

经过7天的成骨诱导,高山活动测量证实成骨的感应。Noninduced细胞被用作控制,不断在基本培养基培养。一个酶测定(细胞计数kit-8 (CCK-8);对硝基苯磷酸Dojindo实验室、熊本、日本)和(SIGMAFAST^TM对硝基苯磷酸平板电脑;Sigma-Aldrich有限公司LLC)被用来评估细胞增殖和高山活动根据制造商的指示。对硝基苯磷酸甲瓒以450海里,在405 nm量化使用iMark™微型板块吸光度读者(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。

2.5。免疫荧光显微镜

与胚胎干细胞标记免疫荧光染色法进行。球状体收集24小时后播种粘附力减小板和固化iPGell (Genostaff、东京、日本)根据制造商的指示,与4%多聚甲醛固定在磷酸盐缓冲剂,嵌入在石蜡,切割厚度为8μ米,如前所述31日]。部分permeabilized和屏蔽5% BSA, 5%山羊血清,0.5%在PBS Triton x - 100。孵化后主要抗体在一夜之间在4°C,部分是用PBS三次,其次是孵化与相应的二次抗体2小时。核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole解决方案(与DAPI Fluoroshield安装介质、ab104139 Abcam) 30分钟。

确认神经性的归纳,为神经细胞标记免疫荧光染色后进行14天的归纳。CBDCs从单层培养和在磷酸盐缓冲剂和4%多聚甲醛固定的球状体在室温下20分钟之后,与PBS清洗三次。细胞治疗5% BSA, 5%山羊血清,0.5%在PBS Triton x - 100 25分钟在室温下渗透和块非特异性结合的抗体。主要抗体与细胞孵化一夜之间在4°C。与PBS冲洗三次后,这些细胞被各自的二次抗体孵育2小时在室温下在黑暗与PBS然后洗了三次。核与DAPI复染色30分钟。总结在表使用的抗体1。

荧光成像是用荧光显微镜(日本基恩士BZ-X710,日本基恩士,大阪,日本)有20或40 x客观的放大。与二次抗体细胞孵化,没有主要抗体孵育,作为消极的控制。

2.6。RNA提取和存在

确定执行中存在干细胞标记物的表达水平,在球状体成骨和神经源性标记,CBDCs球状体或单层培养。简而言之,总RNA提取使用试剂盒试剂(Ambion®;美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。量化后的总RNA分光光度计(NanoDrop®nd - 1000热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),RNA样本反向转录成互补DNA(互补)使用益生元(dT) 12 - 18引物(技术)、核苷酸(Toyobo有限公司,大阪,日本),和ReverTra Ace®(Toyobo有限公司)根据制造商的指示。在热循环中存在执行(热循环骰子实时系统II tp - 900,豆类生物,日本)使用SYBR预混料交货TaqII试剂(豆类生物、Kusatsu、日本)根据制造商的协议。底漆(Sigma-Aldrich有限公司)用于PCR实验表中列出2。

2.7。统计分析

给出的结果 错误的方法(SEM)。使用学生的进行了统计分析 - - - - - -两组之间的测试。一个小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。代的自发的从CBDCs球状体

当鼠标CBDCs被播种到传统塑料培养皿通道2,塑料和显示坚持组织培养的细胞呈形态(图后12个小时1(a))。CBDCs稳定的增长,细胞密度增加(图24小时后1(b))和近72小时后达到融合(图1(c))。在12小时后播种到粘附力减小文化板块,CBDCs开始形成多细胞聚集,逐渐成为球状体(图1(d))。这些球状体保持在观察期间(图1(e)和(f))。盘子上有一些球状体,重新接好,失去了球体形态。然而,没有明显的细胞死亡在观察球状体。球状体的数量从12到24小时后细胞增加播种。在球状体的数量远远大于24小时,12小时( )。然后,球状体的数量趋于稳定(图1(g))。球状体的平均直径逐渐降低,但差异不显著(图1(h))。

3.2。在球状体干细胞标记物的表达

球状体的免疫荧光结果显示阳性胚胎干细胞(ES细胞)标记,如SSEA1 Oct4, Nanog Sox2,染色是独家spheroid-forming细胞。阳性细胞出现在几乎所有的球状体和均匀分布研究ES细胞标记(图2)。

的结果中存在显示的相对表达FUT4 (SSEA1)(图3(一个)),Sox2(图3 (b)),Nanog(图3 (d))明显高于在球状体检查在任何时间点。Oct4在球状体的表达显著高于monolayer-cultured细胞在72小时(图3 (c))。表达式的ES细胞标记发现了多达120小时(数据未显示)。HIF-2的表达α在球状体显著高于monolayer-cultured细胞在12日(图24,72小时3 (e))。

另一方面,MSC标记的表情如CD105、CD44、CD29, KLF4几乎相同的球状体和monolayer-cultured细胞(人物之间4(一)- - - - - -4 (c)和4 (e)),除了本来就显示,高表达在各个时间点上均比monolayer-cultured细胞球状体检查(图4 (d))。

3.3。成骨诱导

高山化验和存在进行确认在第七天成骨的感应。高山活动诱导组显著高于noninduced组对单层和spheroid-derived细胞(图5(一个))。诱导的高山活动spheroid-derived细胞明显高于诱导monolayer-cultured细胞( )。

相对成骨的使用中存在标记基因表达水平进行了分析。的相对表达水平osterix spheroid-derived细胞高出5.65倍,在monolayer-cultured细胞(图5 (b))。同样,BSP和DMP1的表达水平高于monolayer-cultured细胞,和差别增大4.21倍和2.98倍,分别为(数字5 (c)和5 (d))。

3.4。神经性的感应在体外

中存在的结果表明spheroid-derived细胞巢蛋白表达有显著提高(2.35倍)后2周的神经性感应(图6(一))。MAP2和NGRF诱导spheroid-derived细胞的表达是2.62——2.38倍高于诱导单层细胞,分别为(数字6 (b)和6 (c))。NeuroD的表达诱导spheroid-derived细胞(3.10倍)也显著高于诱导单层细胞(图6 (d))。

此外,采用免疫分析研究神经细胞标志蛋白的分布诱导spheroid-derived细胞和monolayer-cultured细胞。表明,巢蛋白的表达和Immunofluorescent图像βIII-tubulin观察与neuronal-like形态只有在spheroid-derived细胞,尽管阳性细胞的比例相对较小(巢蛋白和0.13%和0.053%β分别为III-tubulin)(图7(一))。相比之下,monolayer-cultured巢蛋白或细胞没有表现出积极的染色βIII-tubulin(图7 (b))。

4所示。讨论

从观察CBDCs球体形成早在12小时和24小时达到峰值。相比之下,从神经细胞和皮肤取出细胞自发形成球体,它发生相对较早。因为我们spheroid-forming方法利用粘附力减小文化菜肴,球体形成早期从CBDCs可能反映spheroid-forming细胞的依从性相对较低(可能是成体干细胞)CBDCs相比与神经或皮肤取出细胞。支持这个想法,从CBDCs(球状体的平均大小 微米直径)小于从烹饪和细胞(约100微米)。随着时间的推移球体直径减小。这一发现可能是由于冷凝spheroid-forming细胞聚集,也观察到球状体从其它来源的细胞,如牙周ligament-derived细胞(37]。

我们所知,这是第一个研究表明在CBDCs ES细胞标记物的表达。从CBDCs球状体阳性SSEA1 Oct4, Nanog, Sox2,这表明从CBDCs spheroid-forming细胞是高度有效的干细胞。中存在的结果证实了这一结果,具备干细胞标记物的表达,比如FUT4编码SSEA1, Nanog Sox2在球状体,是spheroid-forming细胞明显高于单层细胞。目前,它不是完全理解为什么球体形成可以打开这些ES细胞标记物的表达。虽然自发形成球体是一个选择性的过程文化的多能干细胞,它可能不完全解释直接增加在球状体的ES细胞标记基因表达。一种可能性是茎(或者更有区别)细胞的去分化。已经指出,球体文化条件可能恢复msc表观遗传变异更原始的状态和原因。例如,据报道,hMSCs球状体显示更高的mir - 489, mir - 370, mir - 433水平,扮演了一个重要的角色在维持成人干细胞的静止状态38- - - - - -40]。郭等人还显示,组蛋白的变化H3K9乙酰化状态球状体的变化,也可能改变spheroid-forming细胞的表观遗传状态(38]。低氧诱导因子(HIF)是一个大师hypoxia-associated基因的转录因子,和HIF-2α报道的msc的多能性影响因素41]。虽然从CBDCs球体的大小相对较小,内部的球状体可能会缺氧。这个想法得到了更高的HIF-2表达式α本研究中所示。缺氧条件以及随后感应的低氧诱导因子可能是另一种机制影响spheroid-forming具备干细胞的细胞(4]。

ES细胞标记相比,MSC标记的表达spheroid-forming细胞和monolayer-cultured细胞之间几乎是相同的,证实了前面的出版物报道关于MSC源自牙周韧带细胞(37]。一个例外是本来就显示,高表达比monolayer-cultured细胞球状体。本来最初确定为造血干细胞的标志(42,43已知,Sca-1-positive细胞可塑性高,如可能分化成心肌细胞(44]。因此,自发形成的球状体的本来的高表达可能也反映了更高的可塑性。

从骨髓msc和脂肪组织,已报告球状体拥有增强的抗炎、血管生成、组织移植后再生效果与monolayer-cultured细胞(45- - - - - -47]。然而,从msc spheroid-forming细胞的性质只是最近已被调查,和信息是有限的。此外,没有报告从CBDCs spheroid-forming细胞。与ES细胞标记基因的高表达从CBDCs spheroid-forming细胞,他们表现出更高的成骨分化能力和更高的成骨的标记基因的表达,如BSP osterix,比monolayer-cultured DMP1细胞。这一现象显示了潜在的实用性spheroid-forming细胞CBDCs骨组织工程中为未来的临床应用。

在这项研究中,我们还研究了从CBDCs spheroid-derived神经源性分化能力的细胞。免疫荧光染色显示spheroid-derived表达巢蛋白和细胞βIII-tubulin与neuron-like形态后神经性的感应,而他们在monolayer-cultured细胞是负面的。按照免疫荧光染色数据中存在的结果证实了更高的巢蛋白基因表达,MAP2, NGFR, NeuroD spheroid-derived细胞相比monolayer-cultured细胞。这些研究结果将为未来铺平道路的使用从CBDCs spheroid-forming细胞神经退行性疾病。

虽然从目前的研究结果显示,从CBDCs自发形成的球状体的潜在用途,向临床应用有剩余的工作。首先,自发形成球体应该测试的可行性与人类细胞。第二,球体代需要测试的效率。我们协议的优点之一是相对更高的效率,由于自发的球状体可以从monolayer-cultured形成细胞即使在段落。这意味着一个相对大量的细胞可用于球体形成,这可能允许临床细胞CBDCs规模的生产。以来自发的球状体拥有优越的功能与monolayer-cultured细胞相比,它可能是合理的期望更高的导航能力,复制能力,克隆形成和分化能力。还需要进一步的研究来理解自然的功能方面从CBDCs球状体。

安全性和有效性都是临床应用的重要问题。虽然自发的球状体展览ES细胞标记,结果从我们初步体内移植实验显示没有形成畸胎瘤,支持的相对安全的自然自发spheroid-derived细胞(数据未显示)。这种方法的效率与人类细胞应该进一步向临床应用证实。

5。结论

鼠标CBDCs可以自发形成球状体粘附力减小培养板。spheroid-forming细胞表现出更高的干细胞标记基因和基因表达增强成骨细胞和神经源性分化能力比传统的单层培养系统。虽然自发的直接比较和机械形成球状体没有执行,我们的数据支持增强的具备干细胞自发形成的球状体,从而表明未来临床应用的有效性,例如骨再生治疗和治疗神经退行性疾病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢王教授Raorao在第十人民医院同济大学的慷慨支持KC和美智子佐藤女士为她优秀的技术援助。这项工作是支持的部分科研补助金(jsp KAKENHI格兰特数字JP16H05546、JP16K15815和JP15K11230)。

补充材料

流式细胞术结果CBDCs的间充质干细胞造血细胞标记和标记。CBDCs通道1进行了分析。CBDCs是积极的对间充质干细胞标记包括CD29、CD105, CD51,本来就和负CD45和CD11b。(补充材料)

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