可伸缩的文化策略的扩张Patient-Derived癌症干细胞系

文摘

癌症干细胞(二者)最近引起了极大的兴趣,设计有效的癌症治疗的一个有前途的生物系统。二者的不足在活的有机体内和随之而来的低活检得到的数字代表的一个主要障碍等的发展策略。因此有必要设计健壮的可伸缩的方法使善意二者的有效扩张在体外。这里,我们评估的适用性计算机控制生物反应器结合3 d聚合文化和微载体技术,广泛应用于干细胞生物工艺,二者的扩张和浓缩分离出不同类型的固体tumors-colorectal癌症(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)从两个病人。结果表明,这些文化策略改善细胞扩张和CSC浓缩。patient-derived CSC线都能生长在微载体,最好的结果是实现PPlus 102 - l, Pro-F 102 - l,事实上102 - l, CGEN 102 - l珠子(总共5倍和40倍增加细胞浓度对CRC和非小细胞肺癌细胞,分别在6天)。至于3 d聚合文化策略,细胞增殖依赖捐助。NSCLC细胞是唯一能够形成聚集和扩散,乘和生物反应器船配备了梯形叶片叶轮是最有效的配置细胞生长(21-fold增加细胞浓度达到8天)。无血清培养基可以促进CSC浓缩在3 d聚合和微载体的文化。开发的协议在此CSC扩张有可能被转移到临床和工业设置,提供关键的见解指导生物工艺设计对丰富CSC文化的生产更高的数量和提高质量。

1。介绍

癌症干细胞(二者)代表一个有前途的目标有效的抗癌疗法(1,2]随着这些不朽的肿瘤起源细胞有能力自我更新和分化成细胞类型的光谱中观察到肿瘤(3- - - - - -5]。由于其特征(增强的能动性、入侵、肿瘤起源能力和抵抗化疗),二者被认为是肿瘤发生的基础,发展、转移和复发,从而导致传统的癌症治疗的失败(6,7]。

据报道,二者存在于几乎每一个实体瘤(5,6)在一个非常小的数字(< 0.04%)[4]。困难识别这些细胞,减少数量,协议有效CSC扩张和浓缩的缺乏阻碍了有效CSC-targeted疗法的发展。激起了文化系统的使用,以前用于(i)扩张和人类干细胞的分化8- - - - - -11)和(二)培养癌细胞(初级)(12- - - - - -14CSC扩张),可以提供巨大的优势在静态培养系统(15- - - - - -18),包括细胞产量高,再现性、可伸缩性和容易转移到诊所和行业(19]。

在这个工作中,计算机控制搅拌釜生物反应器结合3 d细胞聚合文化以及微载体技术首次应用于扩大和丰富二者从两个不同的patient-derived lines-non-small-cell肺癌细胞(NSCLC)和结直肠癌(CRC)。研究结果报道在此提供新颖知识指导细胞生物工艺设计对CSC的生产数量和提高质量更高,这是其应用的关键要件在药物发现和开发新的癌症疗法。

2。材料和方法

2.1。细胞来源

CSC行成立于默克生物制药,ImmunoOncology,专有协议。肿瘤细胞来自肺癌和大肠癌患者和从Indivumed购买(德国汉堡)。肿瘤的分类是大细胞癌,NOS和结肠直肠癌。CSC线(CRC和NSCLC)经常传播在胶原蛋白I-coated T-flasks补充所述在线数据。

2.2。CSC的文化聚集在搅拌釜生物反应器

CSC线作为单个细胞接种在计算机控制的搅拌釜生物反应器浓度为0.25×10⁶细胞/毫升和培养在8天在两个不同的生物反应器configurations-round-bottom生物反应器容器配有搭4-bladde叶轮(BR-R / P4b)平底生物反应器船配备了梯形叶片叶轮(BR-F / T) (DASGIP CellFerm-Pro生物反应器系统,股份公司)。两种培养基配方(血清中(SCM)和无血清培养基(SFM))和四个细胞聚合分离协议进行测试(可在补充在线数据的更多信息)。

2.3。二者在微载体的文化

CSC线路接种与空的单个细胞微载体(2.0×10⁴cell /厘米²)ultra-low-attachment盘子和培养6天在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂使用单片机或SFM。八个商用微载体进行了测试:Cytodex1™, Cytodex3™, PPlus 102 - l, Pro-F 102 - l, 102 - l, CGEN 102 - l, Cytopore2™,和CultiSpher®- s按照补充在线数据。

2.4。分析方法

协议CSC描述包含在补充在线数据。

3所示。结果与讨论

主要CSC线产生的结直肠癌(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)从两个病人,当常规培养在静态贴壁培养系统中,展示ALDH的百分比⁺细胞高于50%和有能力生成肿瘤领域(学院)(数据未显示)。为他们的扩张,不同的生物反应器构型和骨料分离协议进行评估。此外,microcarrier-based文化研究;八个不同的微载体(选择基于以前的工作表现与人类干细胞(10,11),在线补充表S1)筛查CRC和非小细胞肺癌细胞扩张。培养基成分的影响(血清中(SCM)和无血清培养基(SFM))细胞膨胀比和CSC浓缩也被评估。

非小细胞肺癌细胞可以生长在计算机控制的搅拌釜聚合生物反应器独立使用的介质(SCM或SFM)(数据1(一)和1 (b))。重要的是,细胞生长动力学(图1 (b))和总大小(图1 (c))似乎是由流体动力学,计算通过使用不同的容器设计和叶轮几何图形(见材料和方法)。BR-F / T是最有效的配置,因为它允许(i)细胞生长均匀大小的球形骨料(数字1(一)和1 (c)),(2)21-fold增加的细胞浓度后第八天(图1 (b))。最大的细胞浓度(图1 (b))和细胞扩张因素实现在我们的研究中我们小组报告的值的范围内(10)和其他(20.- - - - - -22)为人类多能干细胞的扩张3 d聚合在生物反应器。小变化观察细胞生长概要文件可能反映了不同的细胞类型和这些研究中使用的不同的文化条件,如培养基配方和喂养策略。低浓度细胞得到BR-R / P4b配置;的细胞生长停止观察到生物反应器在第四天可能与氧气扩散限制在总提出的高异质性和聚合分析(图的大小1 (c)报告的值),并表现出缺氧区域( )(23]。值得注意的,聚集培养BR-F / T ALDH的比例最高⁺细胞(> 70%)(图1 (d))。培养基组成对CSC富集的影响。事实上,ALDH增加1.2倍⁺在SFM观察细胞相对于培养液(BR-F / T;SFM),对比SCM的文化,没有达到增加(BR-F / T;SCM)(图1 (e))。

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图1

生物反应器的配置和培养基成分对非小细胞肺癌细胞的扩张。细胞接种于0.25×10⁶细胞/毫升和圆底生物反应器中培养容器配有搭4-bladde叶轮(BR-R / P4b)或乘生物反应器船配备了梯形叶片叶轮(BR-F / T)使用血清中(SCM)和无血清培养基(SFM)。(a)荧光显微镜图像的非小细胞肺癌文化在1天,4和8的三个生物反应器实验。可行性分析的文化沾荧光素二醋酸盐碘化(FDA-live细胞,绿色)和propidium (PI-dead细胞,红色)。酒吧规模:100μm。(b)生长曲线表达的细胞数量每卷介质(由结晶紫细胞核染色试验;3测量的误差表示SD)。(c)总规模(平均直径的总量测定ImageJ软件;测量的误差表示SD 100总量)。非小细胞肺癌(d)流式细胞术分析文化在生物反应器和单层静态系统:ALDH的百分比⁺细胞在第八天的文化。左边的面板显示的点状ALDEFLUOR™试验与抑制剂(DEAB)和右面板显示了点状没有抑制剂。ALDH的⁺细胞群中标识是绿色的。(e)褶皱ALDH的增加⁺第八天的细胞获得文化在生物反应器和单层静态文化系统与培养液人口。

聚集在两个时间点,收获4和8天,不同的骨料分离协议的影响在非小细胞肺癌细胞的能力readhere胶原I-coated烧瓶内,形成肿瘤球(图调查2)。结果表明,复苏的产量可行的细胞(图(7 - 15%)2(一个))和ALDH⁺亚种群(74 - 83%)(数据1 (d)和2 (b))是独立使用的协议。尽管如此,0.05 + C + D和胰蛋白酶酶解最适合分离的非小细胞肺癌细胞的聚集。协议改进的细胞readhesion和扩张能力(2倍)和增强细胞产生肿瘤领域的能力相比,收获两天的标准协议(数字2 (c)和2 (d))。相比之下,TrypLE选择显示ALDH的比例较低⁺分组人口比+ C + D和胰蛋白酶0.05(图2 (c)),并生成肿瘤领域的能力是微不足道的(数据没有显示)。评估等消化试剂隔离那些最近报道的人类神经胶质瘤干细胞(24]可以考虑在未来改善细胞复苏收益率NSCLC细胞聚集。

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图2

收获的结果研究非小细胞肺癌细胞聚集在搅拌釜生物反应器培养。细胞无血清培养系统在BR-F / T使用(SFM)和收获4和8天的文化使用不同的细胞分离协议,即标准协议,Accutase +胶原酶III + DNase我(A + C + D), 0.05%胰蛋白酶和TrypLE选择。(一)比例的可行的细胞每次分裂后恢复协议。价值观是估计的比,总数量的细胞恢复后离解协议(由台盼蓝排斥试验)和是总生物反应器细胞克隆的数量(由结晶紫核酸染色试验)(2测量的误差表示SD)。(b)流式细胞术分析非小细胞肺癌细胞后其文化聚合分离+ C + D,胰蛋白酶0.05,和TrypLE选择协议:ALDH的百分比⁺4和8细胞恢复天文化。左边的面板显示的点状ALDEFLUOR™试验与抑制剂(DEAB)和右面板显示了点状没有抑制剂。ALDH的⁺细胞群中标识是绿色的。(c) Readhesion和扩张能力的非小细胞肺癌细胞收获天4和8使用不同的离解协议。胶原蛋白细胞分离和镀I-coated烧瓶和培养4天在静态培养条件使用血清培养基。左面板:褶皱增加总细胞浓度(估计结晶紫核酸染色鉴定;2测量的误差表示SD)。右面板:ALDH的百分比⁺细胞决定经过4天的文化(2测量的误差表示SD)。(d)的数量每口井的肿瘤领域所产生的非小细胞肺癌细胞培养液和收获来自生物反应器培养4天(左面板)和8(右面板)使用不同的离解协议。肿瘤领域的数量估计五个段落。测量的误差表示SD 4井。统计学意义是表示如下: , ,和 。

当非小细胞肺癌细胞在微载体培养,提高膨胀比率(48)获得在文化时间(6天)在生物反应器聚合文化相比,除了被Cytopore2™珠子(表1)。此外,细胞有效高度和长在微载体使用SCM和SFM(数字3(一个)和3 (b))。使用SFM不妥协ALDH活动的非小细胞肺癌细胞(ALDH的百分比⁺细胞获得天6是类似于培养液(图)3 (c))。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
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图3

非小细胞肺癌和CRC在四个不同的微载体细胞培养:PPlus 102 - l, Pro-F 102 - l,事实上102 - l, CGEN 102 - l。细胞接种于0.2×10⁴cell /厘米²和培养6天在静态培养系统使用两种不同的培养基:血清中(SCM)和无血清培养基(SFM)。(a)褶皱增加非小细胞肺癌(上半部分)和CRC(下图)细胞浓度的6天文化微载体使用这两种培养基。总细胞浓度是由结晶紫核酸染色试验。(b)相差和荧光显微镜图像的非小细胞肺癌和CRC PPlus 102 - l微载体细胞培养。可行性分析的文化沾荧光素二醋酸盐碘化(FDA-live细胞,绿色)和propidium (PI-dead细胞,红色)。酒吧规模:100μm。(c)流式细胞术分析非小细胞肺癌和CRC在培养液的细胞群,6天后文化在微载体使用无血清培养基。左边的面板显示的点状ALDEFLUOR™试验与抑制剂(DEAB)和右面板显示了点状没有抑制剂。ALDH的⁺细胞群中标识是绿色的。

Microcarrier-based文化也适合CRC细胞的扩张,和最高的增加细胞浓度(>三倍)观察PPlus 102 - l, 102 - l, 102年CGEN, Pro-F(表102 - l珠子1)。培养基似乎对膨胀率的影响微乎其微,微载体殖民(数字3(一个)和3 (b))。特别是,ALDH的比例更高⁺亚种群与培养液使用SFM(图被观察到的文化3 (c))。两个大孔微载体评估(CultiSpher®- s和Cytopore2™)不支持CRC细胞扩张。虽然最初的细胞对珠表面观察,细胞增殖在微载体没有发生(补充网络图S1、表1)。此外,这些patient-derived CSC线没有增殖培养在计算机控制的搅拌釜聚合生物反应器时,显示低聚合和扩张能力无论不同媒体和培养液浓度(0.1,0.25,和0.4×10⁶细胞/毫升)在线测试(补充图S2)。聚合的差异和经济增长之间观察到的非小细胞肺癌和CRC细胞可能与不同来源(组织和患者)的细胞。替代/补充方法(如细胞微型胶囊水凝胶作为人类癌症细胞系的报道(13,14)可能被认为在未来的可伸缩扩张CRC细胞。

4所示。结论

本工作描述,首次成功应用计算机控制的搅拌釜反应器结合3 d聚合文化以及人类二者微载体技术拓展和丰富。尽管没有统一的文化策略能够接受不同类型/ patient-derived二者,所开发的协议在此CSC扩张可以很容易地检查前转到临床和工业设置。这项研究还提供了关键的见解指导生物工艺对可伸缩设计生产patient-derived二者改进质量。这将加强他们的应用程序在药物发现和开发新的癌症疗法。

数据可用性

没有数据被用来支持本研究。

的利益冲突

作者指出任何潜在的利益冲突。安妮塔Seshire和塔玛拉Brckalo是默克公司的员工。这并不改变作者的坚持的政策对共享数据和材料》杂志上。

确认

作者承认Eng。马科斯苏萨(我打赌)在生物反应器实验技术支持。作者承认iNOVA4Health-UID /多/ 04462/2013,一个项目财务支持的FCT / Ministerio da Educacao e Ciencia,通过国家基金,得到菲德尔PT2020合作协议。

补充材料

图S1:相差和荧光显微镜图像的CRC大孔微载体细胞培养,Cytopore2™和CultiSpher®- s,天1,4,6。可行性分析的文化沾荧光素二醋酸盐碘化(FDA-live细胞,绿色)和propidium (PI-dead细胞,红色)。酒吧规模:100μm。图S2:荧光显微镜图像的CRC文化在第四天BR-F / T使用培养基和血清无血清培养系统(a)和(b)。可行性分析文化沾荧光素二醋酸盐碘化(FDA-live细胞,绿色)和propidium (PI-dead细胞,红色)。酒吧规模:100μm。图S3:代表图像ImageJ面具的总大小分布分析。表S1:测试微载体的主要特征。微载体类型表示的分类根据陈et al。11]。ECM:细胞外基质。(补充材料)

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