有无损的msc来源孤立与GMP方法更好的成骨的潜力?

文摘

背景。治疗的新趋势唇腭裂患者肺泡结晶包括骨组织工程的使用策略来减少或消除与自体骨移植相关的发病率。使用间充质干细胞cells-autologous细胞从组织如骨髓和fat-combined与各种生物材料已被建议作为一个可行的选择用于裂患者。然而,侵入性程序需要获得这两个来源的间充质干细胞。消除施主能级发病率,无创性如脐带干细胞来源,口轮匝肌的肌肉,落叶研究了牙髓牙槽裂骨组织工程中使用。在这项研究中,我们评估这些不同干细胞的成骨的潜力类型。方法。十细胞压力来自不同来源(脐带、口轮匝肌肌肉或落叶牙髓)诱导成骨分化在体外,骨基质沉积的主要文化是量化。评估是否更建立了间充质干细胞的成骨的潜力菌株与神经嵴基因的表达谱的增加,实时qPCR进行以下基因:SRY-box 9日SRY-box 10,神经生长因子受体、转录因子AP-2α,和配对盒3。结果。落叶的间充质干细胞获得牙髓和口轮匝肌肌肉证明增加成骨的潜力与更多的细胞外骨基质沉积相比,主要从脐带获得文化在文化(二十一天后 和 ,分别)。成对框3基因高表达在msc从落叶中获得牙髓和口轮匝肌肌肉比从脐带获得。结论。这些结果表明,落叶牙髓和口轮匝肌肌肉干细胞展示优势相对于脐cord-derived干细胞成骨分化潜能,这增加了潜在的神经嵴的起源有关。基于这些观察,不同的转化利用将非侵入性组织来源的干细胞纳入组织工程协议,更大的这些特定细胞系研究牙槽裂修复的设置。

1。背景

组织工程生物工程的特点是集成策略,目的是恢复和生物原则,维护,或改善组织的功能受到各种疾病(1,2]。组织生物工程的主要目的就是要克服常规治疗的局限性,基于传统重建手术或器官移植细胞的结合以极大的增长潜力(如干细胞),生物相容性的运载工具,生长因子。许多组织工程协议的目标是创建器官和组织的替代品,具有免疫耐受性,减少劣势与更传统的技术(3]。

生物工程的应用原则已迅速增加在所有医疗和牙科专业(1,4]。先天畸形与裂和颅面综合征都已经被广泛地研究过了这广阔的研究焦点的一部分。具体地说,组织工程方法修复裂口肺泡的唇腭裂患者天生完成(CLP)一直在认真调查的一个区域。目前,“黄金标准”治疗患者肺泡结晶是一个自体移植骨的位置。在这个手术,骨头收获从病人一般从髂嵴和用来填补牙槽裂(5,6]。然而,这种方法有重大缺陷。例如,骨移植物捐助网站提供的数量,和骨头的数量,可以从这些网站采购,是有限的。在大型或双边结晶的情况下,供体区域如髂骨可能无法提供足够的移植材料填补牙槽裂。此外,骨吸收嫁接地区可能发生,需要额外的程序。供体部位感染是现实7),当然,疼痛患者的大量经验髋关节区域不能被低估。

幸运的是,与应用程序的组织生物工程原则这一临床问题,和我们的采购能力自体干细胞在非侵入性方面,我们现在将以创新的方式使用这些细胞可能消除了传统的骨移植的必要性及其相关的缺陷。在这种背景下,间充质干细胞(msc)代表一个有前途的生物基质1]。

msc被定义为细胞增殖和自我更新的能力。他们有能力应对外部刺激和引起众多不同的专门的细胞系。msc被发现在不同的组织,整个身体被安排在利基市场,负责组织维修。msc通常被认为是起源于中胚层。一些作者把各种MSC菌株与胚胎干细胞相关基因的表达以及基因与神经嵴细胞起源(8]。

协议描述从脐带分离MSC种群的扩张,也称为脐带MSC (UC-MSCs),已被描述。几个作者描述UC-MSCs隔离的不同组件的脐带,包括绳上皮和沃顿商学院的果冻。可以使用不同类型的酶消化分离UC-MSCs,特点是UC-CD73 +, CD90 +, CD105 +表达谱。有人描述,各种UC-MSC菌株也表达胚胎干细胞标记,如Podocalyxin (Tra-1-60 /交易- 1 - 81),特定阶段胚胎Antigen-1 (SSEA-1)和特定阶段胚胎Antigen-4 (SSEA-4) [9- - - - - -11]。

多能性标记,如octamer-binding转录因子4 (Oct-4) SRY-box2 (SOX2)和Nanog标记,不是UC-MSCs中找到。中间特色UC-MSCs被描述为成人msc、胚胎干细胞和成年多功能细胞之间可能潜在的比msc与骨髓(BM)或脂肪组织工程(12]。

由于其起源,msc从乳牙脱落,或牙髓干细胞(DPSCs),是值得注意的:他们有一个更快的增殖率比恒牙的牙髓和他们表达原始细胞神经元和神经胶质细胞的表面标记(8,13]。神经元和神经胶质标记的表达在人类脱落乳牙干细胞(棚)与他们的起源,因为它们来源于神经嵴细胞的迁移。这些细胞在胚胎发育发挥基础性作用,引起的所有组织的脸,除了牙齿的珐琅质(8,13,14]。

口轮匝肌肌源性干细胞(OOMDSCs)发现代表一种无创性的msc CLP病人,有可能重建关键尺寸骨缺损动物模型(15]。面部发展,包括口腔和牙齿结构的发展,特点是上皮细胞之间的相互作用的颅面中胚层和神经嵴间质。因此,所有面部组织,包括DPSCs和OOMDSCs,保留一些基因表达在神经嵴细胞细胞人口(16]。

在这项研究中,我们比较三种不同的非侵入性的来源的成骨潜能MSCs-DPSCs, OOMDSCs和UC-MSCs——用于骨组织工程。具体来说,我们评估其适用性在生物工程替代传统在CLP牙槽骨移植手术的病人。我们也量化神经嵴基因的表达谱SRY-box 9 (SOX9) SRY-box 10 (SOX10),神经生长因子受体(NGFR)转录因子AP-2α(TFAP2a)和配对盒3 (PAX3) DPSCs OOMDSCs, UC-MSCs确定这些基因的表达水平在这些人口MSC与成骨的潜力。

2。材料和方法

2.1。获取、隔离和msc的主要文化特征

三十个不同组织的样本来自三十儿科患者在我们的附属机构(落叶牙髓,10个样本;完整的口的肌肉,10个样本;脐带,10个样本)。我们的研究协议被Sirio-Libanes医院伦理委员会的批准,并获得了知情同意的法定监护人的儿科受试者参加本研究。(值得注意的是,这些组织都被丢弃在正常情况下。使用这些组织因此造成任何额外的负担。)根据先前建立的协议(细胞被孤立15,17,18];然而,我们添加了良好生产规范(GMP)级的协议。

手术中心的集合的组织(肌肉碎片和脐带)或牙科诊所(牙髓),基本的护理使用无菌材料实施以避免污染。从组织收集细胞隔离从来没有超过24小时后收集,避免细胞损失和可能的交叉污染。我们的实验室生物安全标准认证用于人体组织的处理和处理(例如,前厅paramentation和HEPA空气过滤器)。从细胞隔离到低温贮藏,无菌试剂,apyrogenic和批处理的可追溯性。有氧、无氧和真菌污染测试(BactAlert bioMerieux)和支原体测试(MycoAlert装备,Lonza)进行了细胞扩张。用积极的结果丢弃任何样品。

2.2。建立主要文化在GMP实验室

我们实验室设施由巴西法律、决议(国家卫生监测Agency-ANVISA-RDC没有214年2月8日,2018)调节先进细胞疗法。根据当地监管委员会,我们的实验室设施定期检查,进行员工培训,进行常规的设备维护和风险和不良事件评估,并使用完全可追踪的试剂和过程(19,20.]。我们推荐的基础设施等洁净室气流和空气微粒控制(HEPA过滤器)和前厅paramentation个人保护。只能处理人类细胞在我们先进的细胞疗法实验室网站。此外,所有试剂从细胞隔离到低温贮藏认证,prion-free, apyrogenic。

2.2.1。DPSCs

落叶牙髓外科收集的标本提取梅尼诺在医院的牙科诊所市政Infantil耶稣从CLP患者,立即添加到无菌容器2毫升的杜尔贝科修改鹰的媒介/营养混合物F-12 (DMEM-F12;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)解决方案补充了100国际单位/毫升青霉素和链霉素(Penicillin-Streptomycin;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。之后,他们被送到医院Sirio-Libanes实验室4到8°C运输箱。落叶牙髓处理平均在15小时后初始集合。

在实验室里,落叶牙髓标本洗两次磷酸盐(PBS, pH值7.4;Gibco表达载体、大岛,纽约)和消化解决方案包含1毫克/毫升的TrypLE™表达酶(Gibco表达载体,大岛,纽约)在PBS 30分钟37°C。组织消化后,样本离心机 5分钟,然后果肉切成两个或两个以上的1毫米³碎片。这些过程后,细胞培养与每个片段12-well板在一个单独的。

2.2.2。OOMDSCs

片段的完整的收集口的肌肉在医院手术提取市政Infantil耶稣从CLP梅尼诺在唇成形术患者,立即添加到无菌收集器管2毫升DMEM-F12解决方案的补充与100国际单位/毫升青霉素和链霉素。轮匝口的肌肉碎片处理平均16小时后集合。

在实验室里,片段的完整的口的肌肉与PBS洗两次和消化解决方案包含1毫克/毫升的TrypLE™表达在PBS 40分钟37°C。酶消化后,样本离心机 10分钟。肌肉片段被分成三个部分,培养12-well板与每个片段在一个单独的。msc被逐出这个过程后的片段10到20天。

2.2.3。UC-MSCs

脐带碎片收集在Maternidade帕罗孕产妇、从母亲曾当选为捐赠脐带血脐带血银行。收集血液后,脐带和洗必泰净化(0.12%)和片段(5到8厘米)立即被添加到无菌收集管2毫升的PBS溶液补充100国际单位/毫升的青霉素和链霉素。碎片处理平均16小时后集合。

在实验室里,脐带片段与PBS洗两次。为了更好的操纵的片段,组织切成小块的两到三厘米,然后动脉和静脉被移除。间质组织切成小块,加入到Falcon-type管2.0毫克/毫升胶原酶溶液NB6 (GMP-SERVA电泳;Nordmark GmBH是一家,新月化学)在PBS稀释2毫米氯化钙与连续运动了两个小时在37°C。把消化解决方案,样本离心机 10分钟。消化组织在10毫升resuspended DMEM-F12培养基补充15%的胎牛血清(的边后卫;我们起源HyClone™,通用电气医疗集团生命科学、南洛根,UT), 100国际单位/毫升的青霉素和链霉素和不必要的氨基酸(MEM非必需氨基酸的解决方案;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约在25厘米)和培养²培养瓶。成功的隔离观察msc 15至20天之后这个过程。这个培养基用于细胞扩张在所有菌株(DPSC、OOMDSCs UC-MSC),直到细胞融合达到大约80 - 90%。

2.3。低温贮藏

30株都冻存前化验使用DMEM-F12稀释1:1的边后卫和10%二甲亚砜(DMSO溶液;CryoPur™100% DMSO溶液;奥利金)。温度逐渐下降了每分钟1°C到-80°C,和细胞被储存在-196°C。

2.4。描述通过流式细胞术

所有30株在第四和第五段之间,immunophenotyping是由流式细胞术在FACSCalibur流式细胞分析仪(BD,正欲富兰克林湖,新泽西)和分析CellQuest项目(BD,正欲富兰克林湖,新泽西)。Immunophenotyping允许细胞的特性在不同的发展阶段通过使用表面标记荧光单克隆抗体(抗原)。

细胞从细胞培养获得的浓度 细胞/ 100μl是用以下标记单克隆抗体:CD29-PE, CD31-FITC, CD34-FITC, CD45-PE, CD73-FITC, CD90-FITC, CD105-PE, CD166-PE, IgG-FITC, IgG-PE同形像(BD生物科学,正欲,富兰克林湖,NJ)在黑暗中在室温下15分钟。五百毫升的PBS然后添加3%的边后卫和孵化在黑暗中在室温下15分钟。首先,清白的细胞进行了分析,从分析中,具体为每个抗体被用于染色同形像,与单克隆抗体作为反应消极的控制,并测量了最小值 事件。

2.5。描述了细胞分化的能力

2.5.1。成骨分化

第四和第五段之间的30株诱导成骨分化。文化成骨的介质后21天,我们评估在体外骨基质的形成通过评估领域的文化有利于钙羟磷灰石。

在12-well板(康宁®®演对手戏),每个30株细胞被播种在同一密度一式三份( 细胞)。DMEM-F12 24小时后的文化,培养基被改变到一个特定的成骨诱导培养基补充与生长因子(StemPro®成骨分化设备;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。

21天后在文化、我们每个培养皿染色茜素红s井与PBS和固定为70%乙醇洗两次(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)30分钟。固定后,井茜素红S沾0.2%解决方案(pH值4.2;西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)30分钟。最后洗,每个洗了PBS (Gibco表达载体,大岛,纽约)三次。我们分析了矿化骨细胞外基质的形成通过显微镜(奥林巴斯CKX31)。

2.5.2。脂肪形成的分化

主要MSC文化是在脂肪形成的诱导培养基培养了十八天。这段时间后,我们观察到的形态变化,在培养细胞胞内脂质囊泡的形成。

12-well板,细胞被播种在同一密度一式三份( 细胞)。24小时后的文化在基本培养基,培养基是改变特定的脂肪形成的培养基补充与生长因子(StemPro®去设备;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。

评价,脂肪形成的诱导培养基中细胞培养,细胞被沾油红(油红O,西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)。染色,井与PBS洗两次(Gibco表达载体,大岛,纽约)和固定60%异丙醇(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)在室温下五分钟。固定后,细胞被沾油红(0.5毫克/毫升)光在室温下15分钟。最后洗,60%异丙醇是使用一次,两次蒸馏水。

染色后的脂质囊泡,细胞结构的观察倒置显微镜下进行(奥林巴斯CKX31)。

2.5.3。Chondrogenic分化

执行chondrogenic分化,msc诱导分化成软骨细胞21天后chondrogenic感应媒介文化的补充和生长因子。

12-well板,细胞被播种在同一浓度一式三份( 细胞)。24小时后的文化在基本培养基,特定的培养基是改变chondrogenic分化培养基补充与生长因子(StemPro®chondrogenic分化设备;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。

评估chondrogenic分化,我们执行与阿尔新蓝染色后21天在分化条件下识别蛋白聚糖(细胞外基质)发布的软骨细胞。

感应介质从细胞培养中删除,这是洗两次与PBS (Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)和4%甲醛固定(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)在室温下20分钟。固定后,细胞染色1毫克/毫升的阿尔新蓝(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)在室温下了两个小时在黑暗中。最后洗,盐酸(0.1米)是使用一次和两次与PBS。

2.6。矿化骨基质的量化

作为本研究的目标之一是评价msc三种不同来源的成骨分化潜力,10 DPSCs的主要文化,10 OOMDSCs的主要文化,和10的主要文化UC-MSCs 24-well板被诱导成骨分化。对于这个实验, 细胞被播种在第四和第五段之间的一式三份。

最初的播种,基本培养基使用24小时后当细胞已经坚持培养板的底部。成骨诱导是由改变基本培养基与成骨的感应介质(StemPro®成骨分化设备;Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)。0后成骨分化过程进行了分析,3、7、14、21天文化在成骨分化培养基中。

骨细胞外基质形成的分析,培养基被和0.5毫克/毫升的茜素红S (pH值4.2;西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)稀释在PBS (Gibco表达载体,宏伟的岛,纽约)被添加到每个。随后,这些细胞被孵化下光在室温下30分钟。

30分钟后,200年μl 20%的甲醇溶液(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)和10%醋酸在PBS稀释(西格玛奥德里奇,密苏里州圣路易斯)添加到每个好然后孵化15分钟在黑暗中溶解形成的晶体茜素红染色。盘子里然后搅拌大约5分钟完全溶解。解决方案被转移到一个96孔板测量板成骨分化的读者(无限200专业版;瑞士Tecan)。结果分析了根据校准曲线先前执行的每个细胞类型。

2.7。信使rna提取

进行RNA提取当主样本提出了MSC等特点被无差异,在同一阶段和通道用于成骨分化实验。的msc在体外诱导分化为成骨细胞,用于实验如前所述。

总RNA提取细胞体外培养使用RNAeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。这个工具包开发总RNA的提取少量的原始材料。这是一个黄金标准的方法,结合了硅胶膜的选择性绑定属性与微型离心机速度。

协议用于提取技术是由制造商提供。

生物分析仪工具包(安捷伦RNA 6000纳米装备)是用来评估RNA质量。这个过程让我们验证的完整性(RIN)和精确量化样本之前任何应用程序依赖的RNA。

互补脱氧核糖核酸的合成进行了上标™很™互补脱氧核糖核酸合成装备(表达载体)后,协议由制造商提供。

2.8。定量实时聚合酶链反应分析

通过实时定量PCR(存在),我们评估基因的表达水平与神经嵴细胞标记的表达SOX9、SOX10, NGFR TFAP2a, PAX3。基因表达的分析用于我们的研究代表感兴趣的基因的相对量化使用一个内生控制(正常化基因)。在这项研究中,基因SDHA和HPRT1作为内生控件(补充材料1)。

对于存在,我们使用SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)核酸的扩增和量化。反应进行了一式三份的最后一卷20μl为每个反应。我们用10μl的实时SYBR绿色PCR大师混合(2 x), 2μ0.2 l的cDNA样品的浓度μ克/μl 2μl(第一次底漆,2μ反向引物l, 4μ超纯水的l。使用应用生物系统公司的量化是由7300实时PCR系统,根据以下步骤:95°C两分钟,40周期在95°C为30秒,15秒和60°C和随后的分离步骤。

2.9。统计分析

分析DPSC之间的成骨分化,OOMDSCs UC-MSC,我们使用了一个双向方差分析统计测试重复措施单因素(时间)。当多个比较是必要的手段,Bonferroni事后测试使用。基因的表达作为标准化因素决定,也就是说,一般基因表达在msc。表达分析计算出每个探测的效率,提升到引用的Ctδ- Ct三角洲每个样本的基因,如本构所示在2001年提出的公式Pfaffl (21]。

评估是否存在区别组织关于基因表达,克鲁斯卡尔-沃利斯测试使用。当多个比较需要,邓恩测试使用。类型I (α)0.05被认为是在所有错误的概率推理分析。描述性和推论与SPSS统计分析软件版本21 (SPSS 21.0对Windows)的显著性水平 。

3所示。结果

我们收集了10个落叶牙髓样本,12口轮匝肌肌肉样品,和25脐带样本,与MSC隔离率为100%,83.3%,和40%,分别。未能实现隔离100%是由于口轮匝肌肌肉和微生物污染是由于技术问题建立脐带的文学描述的协议样本。我们使用胶原酶开发用于GMP和我们需要增加其浓度在前面描述的协议使用non-GMP胶原酶(18,22- - - - - -24]。

成骨分化进行了10个不同的MSC的菌株,但细胞池不是执行对每个MSC的个性在成骨分化过程。

样品收集落叶牙髓和完整的口的肌肉进行了酶处理和驱逐了msc在细胞培养(图后15天1)。UC-MSCs得到验证后观察MSC隔离协议和在文化20到25天之后酶消化过程(图1)。

3.1。对MSC菌株

所有DPSC、OOMDSC UC-MSC主要文化显示出非常相似的表面标记表达谱通过流式细胞仪分析,如表所示1。标记的表达CD29、CD31、CD34、CD45、CD73, CD90、CD105,存在绘制的补充材料。

所有的主要文化DPSCs ( ),OOMDSCs ( ),和UC-MSCs ( )能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞(见图2)。

3.2。量化的骨细胞外基质

我们观察到成骨分化后21天在所有30株获得;然而,我们观察到更高的细胞外基质沉积OOMDSCs和DPSCs UC-MSCs相比具有统计上的显著差异(图3)。没有统计上的显著差异观察比较DPSCs OOMDSCs时。

当我们观察成骨分化的初始阶段3和7天,生产没有区别之间的细胞外基质组。14天,细胞外基质的沉积OOMDSC菌株与UC-MSC菌株相比具有统计学意义( )。然而,21天的成骨分化,当所有的未分化的细胞已经在成骨细胞阶段产生细胞外基质,观察细胞外基质沉积OOMDSC高和DPSC组比UC-MSC组( 和 ,)(图3)。OOMDSCs没有区别在细胞外基质的形成和DPSCs 21天的细胞分化。

3.3。神经嵴细胞标记基因表达的评估

我们观察到更多的表达PAX3比DPSC OOMDSC菌株( )和UC-MSC ( )菌株。也有增加的趋势和平表达DPSCs UC-MSCs(相比 )(图4 (d))。

NGFR基因表达在所有菌株从DPSCs, OOMDSCs, UC-MSCs(图4 (e))。大大增强该基因的表达在OOMDSCs比DPSCs ( )和UC-MSCs比DPSCs ( )。没有统计上的显著差异观察NGFR基因的表达谱进行对比OOMDSCs和UC-MSCs ( )。

TFAP2a的表达、SOX10 SOX9基因在所有MSC菌株也证明,但是没有显著差异的表达时,三个不同的菌株进行比较( , ,和 ,)(图4(一)- - - - - -4 (c))。

4所示。讨论

msc的寻找新能源来代替msc的隔离BM一直在增加在过去的十年中,主要是作为战略发展再生医学临床问题的解决办法。自2000年以来,研究描述来自不同来源的干细胞的分离,如牙髓,肌肉,脂肪,和脐带13,15,17,18,25- - - - - -27]。

本研究的目的是确定是否有相关性msc的各种来源及其成骨的潜力。具体来说,我们比较神经嵴来源的成骨细胞的潜力msc与脐带。我们关注神经嵴来源特别相关,因为神经嵴负责骨头和颅面结缔组织的发展,其中一个主要的潜在临床应用这种组织工程范例CLP-associated骨缺损患者的治疗。

考虑到不同的潜在来源的干细胞,脐带和落叶牙髓是值得注意的,因为他们很容易获得和被认为是一种非侵入性来源。或是生育的时候丢弃的脐带组织,在早期阶段,乳牙经历的过程自然剥落落叶永久生齿的交换。干细胞的来源都有巨大的潜力为其他组织的形成,如骨骼、肌肉、脂肪、软骨(17,18,28- - - - - -35]。因此,这些组织可以冻存的细胞分离在生物存储银行,以供将来使用。在CLP患者的情况下,这些细胞可能对潜在用途解冻治疗肺泡结晶通过骨组织工程方法(36,37]。

患者颅面畸形,尤其是CLP病人,另一个非侵入性的msc来源是口轮匝肌的肌肉。小片段中可以获得肌肉的唇成形术手术,事实上,往往是丢弃在唇裂修复。msc的成骨分化的能力可以从这些组织分离15]。

这项研究的结果表明,使用良好生产规范(GMP)协议,可以从乳牙纸浆分离msc,口轮匝肌肌肉,和脐带基质用于临床干预措施,确凿的其他的研究在文献中。我们的研究结果提供进一步支持同行的实践这些msc在临床试验中供以后使用,通过细胞疗法(38- - - - - -40]。我们的实验室设施坚持所有巴西法律、法规中使用人体组织研究和先进细胞疗法19,20.,37]。此外,我们小组此前遗传稳定性检测的细胞用于本研究通过通道18;没有染色体异常在1号或者18通过观察(15,41]。在获得msc落叶牙髓,我们没有遇到任何问题与我们的GMP实验室协议;然而,在建立OOMDSC UC-MSC菌株,我们有一些微生物污染问题和验证在文献中描述的协议之前。减少微生物污染OOMDSC UC-MSC菌株,抗生素被添加到培养基当时源组织获取和放置在文化。此外,组织收集和GMP处理之间的时间最终获得msc减少(从平均24小时平均16个小时)。这些策略帮助我们获得免费MSC菌株污染与成纤维细胞的形态学特征和坚持塑料,作为细胞治疗推荐的国际社会(ISCT) [42]。

在我们的研究中,我们使用牛血清在细胞培养中由于我们的观察细胞增殖减少当xeno-free培养基(未发表的数据)。替代品,如血小板溶解产物或人类血清可能更适用于转化研究。进一步调查的影响选择来自人体的文化产品在成骨分化和基因表达是十分必要的。

最初,我们有一些问题在msc的隔离来自以来脐带间质有几种隔离协议可以在文献[11,18,22,43]。这些各种协议调用不同的方法来解剖和移除动脉和静脉,通过消化只有沃顿果冻或简单的外植体线的片段进行处理。协议实现可以影响细胞的数量获得及其潜在的分化为骨,软骨,脂肪和可能改变他们的一些细胞表面标记物的表达11,44]。绳的片段的隔间用于隔离UC-MSCs,沃顿商学院的果冻是最好的选择,在这个研究中,沃顿商学院的果冻和2毫克/毫升胶原酶消化2毫米氯化钙用于获得UC-MSCs GMP条件下。我们演示了UC-MSCs的能力在三行中胚层的分化,这与先前的报道是一致的(11,18,22- - - - - -24]。

msc的immunophenotypic表达谱分析确定的一组在这些细胞表面抗原标记。研究msc来源于牙髓描述了使用不同的流式细胞分析仪面板”来形容这些细胞(45,46]。一些研究显示anti-CD117表面抗原的表达,anti-STRO-1, anti-CD105, anti-CD73,和anti-CD90抗体但没有显示CD45的表达,CD34, CD14造血标记和CD31内皮标记(8,47];然而,没有共识的文学应该使用标记(8,47,48]。

冻融后,DPSCs immunophenotypic表征,OOMDSCs,和UC-MSCs揭示细胞表达高水平的MSC的存在如CD105标记(endoglin) CD73 (ecto-5 - - - - - -核苷酸酶),CD44 (HCAM), CD90 (Thy-1),存在(ALCAM)、CD29和缺乏的表达CD31 (PECAM-1)、CD34、CD45。的表达CD117 (c - kit)很低,与文化也在其他的研究报告不同的msc (13,15]。表达CD117是一种原始标记,可以在第一个段落的文化。在这项工作中,我们通过流式细胞术分析细胞特征在第四届细胞通道,这可能是低表达的标记的原因(8,49]。

的一个重要生物学性质表征的msc分化成是他们能力至少3间叶细胞谱系的组织类型。因此,在目前的研究中,主要文化的研究小组证明了成骨的能力,脂肪形成的,chondrogenic分化暴露在适当的分化培养基。所有实验用冷冻和解冻保存细胞能够分化成三个不同的细胞系。这表明从不同的组织可以获得msc低温贮藏后隔离和存储,直到以后使用。我们的实验细胞5通道和存储用于2年液态氮在-196°C。我们所有DPSC、OOMDSC UC-MSC msc根据菌株符合标准的要求ISCT [42]。

由于msc的成骨的潜力受到不同因素的影响,如组织来源(来源)和异质性的细胞群14),细胞各亚群的预选大成骨的潜力是一个有前途的战略的完整翻译MSC-based疗法临床实践。在这项研究中,我们观察到的成骨潜能DPSCs, OOMDSCs, UC-MSCs和观察到比UC-MSCs DPSCs和OOMDSCs最好成骨的潜力。此外,我们注意到,可以隔离这些msc在GMP条件下的同行和解冻这些细胞成骨分化没有有害的影响。

Fanganiello和他的同事们调查了分子标记的表达可能预测的潜在成骨的msc、比较两个不同的种群msc (lipoaspirate和牙髓)的来源。他们的研究结果表明,流有一个本质上更大的成骨的潜力相比,脂肪tissue-derived间充质干细胞(AD-MSCs)当两个细胞系暴露在相同的控制在体外感应系统。这些细胞的转录组分析在成骨分化显示调节IGF2基因表达谱基因表达可能是最好的预测因素之一的发病之前和期间成骨分化在msc在体外(50]。在我们的研究中,我们表明,DPSCs有更大的比UC-MSCs成骨的潜力。

另一个有趣的发现在我们的研究中是类似的行为从DPSCs获得的菌株和OOMDSCs之间。这些菌株诱导成骨分化时,没有发现显著差异。对于这个发现的一种假说是,这两个组织(来源)有相同的起源从神经嵴细胞16,27]。为了验证这个假设,我们分析基因的表达直接联系的神经嵴细胞群主细胞的三组提出了研究。TFAP2a SOX9, SOX10 DPSCs表达的基因,OOMDSCs, UC-MSCs,但是这些基因没有这些菌株之间的差异表达任何重要程度(51- - - - - -53]。

在一个发表比较DPSCs的成骨的潜力,UC-MSCs, AD-MSCs, msc外周血隔绝,从牙周韧带和msc孤立(PDLSC) DPSCs演示了一个更大的成骨分化能力(54]。我们的研究结果还显示一个更好的比UC-MSCs DPSCs分化能力。然而,在我们的研究结果相比,一个显著差异表达SOX9没有观察到在我们测试细胞系,在Trivanović的研究中,病人DPSCs比另一个更高水平的表达SOX9 MSC,即使它们分化成chondrogenic血统,SOX9染色是作为一个特定的标志(54]。然而,在细胞的脐带,有一个趋势(没有统计差异)有更大的表达SOX9,这可能是一个更好的选择当使用chondrogenic分化,优化协议等具体使用疗法修复软骨。

在我们的结果中,PAX3基因的表达谱DPSCs的主要文化和OOMDSCs高于UC-MSCs,确凿文献,证明这些血统保持更大的表达PAX3细胞群。这个观察表明,这些细胞系保留功能的神经嵴细胞倾向于更大的成骨分化潜能(55,56]。在每一行的发展来源于神经嵴,一些监管相关基因,包括PAX。罗马家庭的基因转录因子至关重要,扮演了一个重要的角色在器官形成和参与这一过程的重要阶段,如细胞迁移,细胞增殖,细胞分化[57]。PAX3基因表达存在于未成熟的神经嵴细胞和神经细胞(56]。在我们的研究中,只有PAX3基因有不同的基因表达谱中细胞从不同的来源获得,证明高表达在OOMDSCs和DPSCs UC-MSCs。由于神经嵴细胞起源的所有面部组织除了牙釉质(55,58),我们建议PAX3是最好的神经嵴细胞的标记骨髓间充质细胞识别用于测试的样本人口成骨分化的倾向更大。在文献中,PAX3基因表达在肌原性的前体细胞胚胎的发展阶段(59]。因为我们使用口轮匝肌肌肉碎片的唇的msc、孤立的唇成形术手术进行中婴儿大约3 - 6个月的年龄,有一个更大的可能性找到更多过早msc PAX3的高表达。纸浆的乳牙,正如文献中所描述的,有一个异构MSC利基,表达了不成熟的标记(8,14]。确凿的这个事实,我们的结果表明在DPSCs PAX3基因的高表达。

在文献中,NGFR基因表达在msc还不清楚,但已被证明是参与神经细胞的存活和分化在体外和对神经系统发育中扮演一个重要的角色60]。这些基因可以表达在骨髓(BM)细胞而不是在造血和内皮细胞(61年]。NGFR抗原也被描述在早些时候BM基质组件出现前的胚胎发展的BM活动和在7 - 11%的细胞附着层的骨髓间充质干细胞(BM-MSC)文化从长远来看,这表明NGFR抗体也可能出现在原始的msc。2010年,Quirici等人所描述的这个标记的存在间充质细胞来源于脂肪组织,观察保留此标记的细胞群分化成骨头(单独使用力量和能力62年]。我们的研究结果表明在DPSC这个基因的表达,OOMDSC, UC-MSC线。然而,在我们的结果中,我们观察到的表达NGFR OOMDSCs和UC-MSCs高于DPSCs。在一些研究中,CD271 (NGFR)被描述为一种选择性标记的纯化和表征msc隔绝BM [63年,64年];然而,在文献中没有描述DPSCs这个标记的表达。因此,劳斯和他的同事试图定义的表达CD271 DPSCs阐明其作用在msc。他们证明了DPSCs CD271 + / CD90 + / CD44 + / CD45−2.4%的细胞群表达谱。与我们的结果一致,这个标志是弱表达DPSC人口。multilineage分化潜能(chondrogenic成骨、脂肪形成的,和肌原性的)CD271 + / DPSC相比的CD271−/ DPSC人口。结果表明抑制成骨的能力CD271 + /摆脱人口相比CD271−/ DPSC文化,展示低水平的钙和碱性磷酸酶。因此,DPSCs表达低水平的NGFR (CD271−)有优越的成骨分化的潜力,并随着时间的推移,NGFR的表达减少CD271 + / DPSCs(劳斯et al。65年])。我们的发现证实了劳斯等人,2011年获得的结果表明DPSCs NGFR基因的表达水平较低和有一个伟大的成骨分化潜能。另一方面,OOMDSCs也显示成骨分化,有很高的潜力,相反,这是高水平的表达的细胞系,NGFR基因(65年]。研究在文献中定义标记CD271 (NGFR)作为潜在的特定的细胞表面标记前体族群的msc (63年]。然而,到目前为止还没有研究证明的实际关联这与增殖细胞的潜力和标记在体外和在活的有机体内分化的能力。这一事实OOMDSCs表现出更高的NGFR基因表达谱和展示相同的成骨潜能DPSCs表明这个基因的特定角色成骨分化的过程。此外,有文献报道表明,最大的潜力来自不同来源的成骨分化的msc与神经嵴基因的表达在未分化的间充质细胞的数量51,65年]。

根据我们的调查结果和相关发表数据,我们建议NGFR标记可能不是一个很好的预测标记选择的最佳来源msc用于骨组织工程。然而,我们建议PAX3基因可能是一个潜在的标志,预测从不同的来源获得的msc的成骨的潜力。在我们的研究中,这种基因的高表达水平观察msc证明大成骨的潜力。因此,我们得出这样的结论:DPSCs OOMDSCs,部分显示PAX3表达式,msc的最好来源是用于骨组织工程中电的病人。这些细胞可以孤立和低温贮藏在GMP条件下用于再生医学,因此代表了一个非常可行的基质用于转化的研究。

5。结论

最好的来源获得msc骨组织工程中电患者牙髓和完整的口的肌肉。msc从这些组织有更好的获得比从脐带获得成骨的潜力。PAX3基因的高表达可能是一个好标志在预测组织将提供最理想的MSC菌株用于骨组织工程。我们的研究结果表明,上级成骨的潜在观察DPSCs OOMDSCs是由于他们的神经嵴细胞的起源。基于这些观察,进一步研究的临床适用性msc孤立的来源,如DPSCs和OOMDSCs创新转化骨组织工程协议修复牙槽骨移植在CLP病人。

数据可用性

在当前的研究中使用的数据集是可从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

这个项目是通过组织巴西这个组织(号码:研究设计院:39830214.7.0000.5461)(可用:http://plataformabrasil.saude.gov.br/login.jsf)有限公司和医院的伦理委员会Sirio-Libanes / Beneficente德夫人(号码:5461)。

同意

获得知情同意的法定监护人捐赠者捐赠组织的研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

对本文的研究,作者贡献如下:研究ibsen Pinheiro概念化是由20,Jarrahy R,布埃诺DF;ibsen Pinheiro方法由20好DF;正式分析ibsen Pinheiro 20;ibsen Pinheiro调查20;ibsen Pinheiro资源20,Leyendecker初级,费雷拉小;收集的样本Tanikawa DY和布埃诺DF;ibsen Pinheiro写作和草稿准备由20;编写和审查和编辑好DF和Jarrahy R;布埃诺DF可视化;布埃诺DF和资金收购和监督。

确认

这项研究受到了巴西卫生部PROADI-SUS。我们感谢医院Sirio-Libanes提供物理结构(实验室)和设备。感谢姐妹Beneficente德夫人做医院Sirio-Libanes并通过医院市政学院Responsabilidade社会Sirio-Libanes Infantil梅尼诺耶稣提供多学科例唇腭裂患者护理在圣保罗,巴西,和无尽的鼓励发展的新策略,提高病人的生活质量和降低发病率的手术。我们感谢护士脐带血库的医院Sirio-Libanes帮助我们在“保护Maternidade孕产妇绳片段的集合。我们感谢所有的患者和家长组织片段捐赠建立MSC菌株和相信我们的研究小组推进科学的发展。

补充材料

补充材料1:所有基因序列用于神经嵴概要文件。补充材料2:R1、R2和R3地区人口的间充质干细胞:R1: OOMDSC, R2: UC-MSC,和R3: DPSC。直方图代表人口选择概要文件标记:黑线:OOMDSC;绿线:UC-MSC;和粉色线:DPSC。所有菌株呈现相同的概要文件标记:积极反应CD29, CD73, CD90、CD105,存在和CD31负面反应,CD34, CD4细胞。(补充材料)

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