文摘

主动脉瓣钙化是一种常见的临床疾病,引起的瓣膜间质细胞(vic),然后启动增厚和钙化的阀门传单。古典valve-derived细胞中可以看到不同的细胞群体根据他们不同的形态,但尚不清楚是否存在不同类型的间充质细胞。在这项研究中,文化条件间充质基质细胞被用来选择性分离valve-derived基质细胞(VDSCs)。接种后,形态、增殖、multidifferentiation immunophenotype和基因表达分析孤立VDSCs比较与常规培养维克。VDSCs隔绝人类主动脉瓣均匀纺锤状纤维母细胞,mutilineage分化能力,扩散速度比维克。典型的间叶细胞标记包括集群分化90 (CD90), CD44, CD29积极表达。此外,干细胞标记CD163, CD133、CD106 VDSCs都表达了。RNA-sequencing识别1595个差异表达基因VDSCs和维克其中301之间调节,1294人表达下调。瓣膜细胞外基质等VDSCs基因1型胶原蛋白、α1 (COL1A1) COL1A2,纤连蛋白1是大量表达。此外,runt-related转录因子2和ki - 67蛋白也在VDSCs显著调节,而有不粘着斑的表达基因整合素α和层粘连蛋白αVDSCs维克。 In conclusion, novel rapidly proliferating VDSCs with fibroblast morphology, which were found to express mesenchymal and osteogenic markers, may contribute to aortic valve calcification.

1。介绍

主动脉瓣狭窄是最常见的心血管疾病之一。其患病率之间只有0.2%的成年人50 - 59岁的八旬老人,但增加9.8%的总患病率为2.8%,75岁以上成年人年(1]。许多因素导致主动脉瓣狭窄的发病机制,如先天性二尖瓣和风湿性心脏病,但主要原因是钙化(2]。钙化的主动脉瓣疾病(抽象智力)是一个活跃的pathobiological过程在细胞和分子水平,涉及肝纤维化、钙化的主动脉瓣传单导致心脏血流动力学改变,最终导致心力衰竭(3]。抽象智力假设达到“临界点”,一旦超过,药物干预可能停止,甚至其进展缓慢,和手术可能是唯一的选择。

间叶细胞间质干细胞(msc)被Friedenstein首次发现,他形容的粘着性呈人口骨髓(BM),这可能会分化成骨头,他称为成骨前体细胞。随后的研究表明这些细胞有multilineage分化能力4),可以移植到各种器官组织重构的背景下,从而代表一种多能细胞,修复受损组织的5]。尽管msc最初BM隔绝,类似的人口已经从其他组织包括脂肪组织分离,胎盘、羊水,胎儿组织如胎儿肺和血液,甚至成年组织如跟腱,皮肤和牙齿(6,7]。最近的研究集中在msc在疾病和治疗的作用,因为他们的分化潜能和免疫调节能力8,9]。

正常的主动脉瓣主要居住着瓣膜间质细胞(vic),异构的、多功能的细胞群负责维护阀内稳态(10,11]。多种细胞类型如成纤维细胞、平滑肌细胞和myofibroblasts造成这一人口。主动脉瓣间叶细胞祖细胞丰富,它有一个强大的潜在贡献瓣膜钙化(12]。它也被发现,招聘BM-derived维克是一个正常的稳态过程在BM移植小鼠模型13]。此外,循环内皮祖细胞与成骨细胞的表型似乎导致主动脉瓣钙化(14]。

各种维克亚种群的功能尚不清楚。因此,本研究评估维克族群之一。第一次,一个类似的文化协议用于BM-MSCs用于隔离valve-derived基质细胞(VDSCs)从人类主动脉瓣。然后,这些细胞比较维克关于增殖,分化,immunophenotype和转录的差异。

2。材料和方法

2.1。维克和VDSC隔离和文化

阀门与抽象智力从患者获得了书面知情同意。这项研究是由同济医学院伦理委员会的批准,华中科技大学(武汉,中国)。主动脉瓣传单被切除,冲洗根据我们之前的协议15]。然后,组织被剁碎,放在胶原酶(150单位/毫升)杜尔贝科修改鹰的介质(美国UT HyClone, Logan) 6 - 8 h在37°C。胶原酶消化后,得到细胞悬液通过移除未消化的组织块70μm细胞的过滤器。然后,细胞被分成两个不同的媒体:(1)维克在标准DMEM培养10% heat-inactivated的边后卫(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和150 U /毫升青霉素和链霉素(HyClone)和(2)VDSCs人类MSC完全培养基培养(干细胞技术,温哥华,不列颠哥伦比亚,加拿大),2更易与L谷酰胺。维克和VDSCs被播种在10000个细胞/厘米²在完全培养基组织培养瓶中,每3天了,直到维克汇合的约90%。

2.2。FCM

通过FCM不同的细胞表面标记进行了评估。为此,维克( )100年resuspendedμL磷酸盐和孵化30分钟在冰上共轭抗体群分化29 (CD29), CD44, CD90、CD106, CD117, CD133, CD163, CD146, CD34, CD31, CD11b和CD68(所有从BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。然后,细胞被固定在4%多聚甲醛和洗两次。

2.3。免疫荧光

通过免疫荧光细胞染色(如果)以下标记:α-平滑肌肌动蛋白(αsma;中国武汉博士德)、波形蛋白(博士德),Sry-related HMG盒基因10 (SOX-10;Abcam、剑桥、马、美国),若丹明phalloidin(美国丹佛市细胞骨架Inc .),和ki - 67(细胞信号技术(CST),丹弗斯,妈,美国)。维克播种在48-well板密度5000细胞/洗两次PBS和固定在4%多聚甲醛10分钟。固定剂的解决方案与PBS被清洗三次。细胞permeabilized Triton x - 100 5分钟,0.2%与PBS洗了三次,阻止了30分钟的山羊血清白蛋白(博士德)。后立即阻止,细胞被孵化主要抗体在一夜之间在4°C。与PBS洗涤三次后,样本孵化与二次抗体(CST)在室温下PBS 60分钟。然后,样本洗两次与PBS和孵化与DAPI (BioFroxx GmbH, Einhausen,德国)4分钟细胞核染色。样本与PBS洗两次,然后在Axio观察者Z1显微镜成像(蔡司、从、德国)。

2.4。在体外多能干细胞分化

评估VDSCs的trilineage分化和维克,细胞收获和镀6-well板的密度 。成骨的和脂肪形成的分化,细胞培养介质中,直到他们汇合的80 - 90%。然后,介质被替换为成骨诱导介质(ScienCell研究实验室Inc .)、卡尔斯巴德、钙、美国)或脂肪形成的感应媒体(干细胞技术)。区分维克和VDSCs成软骨细胞,人类MSC chondrogenic分化培养基(干细胞技术)是根据制造商的指示使用。细胞培养与媒体变化每3天21天。维克和VDSCs在DMEM培养有2%的边后卫或人类MSC基础培养基(干细胞技术)在trilineage协议作为一个消极的控制。成功分化被染色评估油红O和茜素红的分化细胞在分化的脂肪细胞和骨细胞的情况下,分别。使用标准方法石蜡包埋颗粒,和6μ米部分与阿尔新蓝染色和核快速红色或苏木精和伊红())。

2.5。FCM分析细胞周期

维克和VDSCs(2)通过培养在60毫米菜肴confluency直到80%,之后,他改变了媒介与2%的边后卫或DMEM MSC基地中8 h。两个细胞系都使胰蛋白酶化然后resuspended在PBS ,其次是固定在70%预冷乙醇在一夜之间在4°C,离心、洗涤、染色π/核糖核酸酶染色缓冲区(BD生物科学)30分钟在4°C。细胞计数在细胞周期的不同阶段分析了FCM如前所述[16]。

2.6。细胞生存能力分析

细胞生存能力评估与细胞计数Kit-8 (CCK-8)试验(http://Bimake.com美国,休斯顿,德克萨斯州)根据制造商的指示。细胞被播种密度的5000细胞/在24-well盘子和培养1 - 6天。在每个时间间隔、细胞样本用无血清培养系统PBS和孵化CCK-8试剂含有10%。4 h孵化后37°C的氛围中5%的股份有限公司₂整除,用移液器吸取到一个96孔板,以450海里使用enzyme-labeling仪器(热费希尔科学)。

2.7。RNA-Sequencing维克和VDSCs

RNA-sequencing (RNA-seq)是利用比较维克和VDSCs之间的信使rna的概要文件。孤立的RNA被送到华大基因研究院科技解决方案有限公司(中国深圳)RNA-seq,进行bgiseq - 500测序仪;为确认目的所有样本测序一式三份。测序结果分析使用“R项目(3.5.1)版”来识别差异表达基因(度)。基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集分析也执行。

2.8。统计分析

RNA-seq结果分析使用R(版本3.5.1)根据一项研究[15),和所有其他数据分析和表达 (SD)。统计比较是由组间方差分析来评估差异。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。细胞形态学VDSCs显然不同于维克

VDSC的培养,形态非常不同于经典的维克,如成纤维细胞。维克有各种形态包括大型和持平或小型公寓和大型主轴或小轴,这意味着它们属于多个细胞群。我们比较VDSCs段落1 - 3和维克使用相衬或水晶紫罗兰色照片(数字1(一)和1(b))。细胞周边地区(图计算1(d))。培养从通道1到3,周长,面积VDSCs在章节2和3 (P2和P3)相比显著降低P1 ( )。维克相比,VDSCs不管周边小得多,区域(^# )。肌动蛋白应力纤维沾罗丹明phalloidin传播领域也显示出不同的细胞(图1(c))。

3.2。比较VDSCs之间的细胞增殖和维克

细胞生存能力分析VDSCs和维克6天表明VDSCs扩散速度比维克在这段时间里(图2(一个))。与维克相比,VDSCs表现出显著差异的增殖率天4、5、6。MKI67如果两种类型的细胞的染色显示,大约80%的VDSCs MKI67-positive 2通道,通道3下降到约60%,而约50%的维克MKI67-positive通道2,只有30%在通道3(数据2 (b)和2 (c))。当维克VDSCs相比在章节2和3,有一个更高的百分比MKI67-positive VDSCs维克( )。FCM的细胞周期分析显示,VDSCs在S期的比例约为20%,这是双维克的百分比(10%)( ),而有显著减少VDSCs在G1期(60%)相比,维克(80%)( ;数据2 (d)和2 (e))。

3.3。不同Immunophenotypes Mutilineage VDSCs和维克的分化能力

由于不同的形态和异常VDSCs维克,我们进一步评估一些标准通过如果维克标记和FCM在细胞通道3。如果结果(图3(一个))表明,VDSCs大多是负面的αsma,而维克大多是积极的αsma。VDSCs波形蛋白和维克都呈阳性,但是有不同的细胞骨架形态,是与罗丹明phalloidin染色的结果一致。VDSCs和维克都部分SOX-10阳性。对于CD146 VDSCs大多是负面的。FCM表面标记表明VDSCs和维克都大多CD90阳性,CD44,和CD29(间充质标记),大多是负面CD34和CD31(内皮标记),CD11b(血液标记)、CD68(巨噬细胞),CD146, CD117(干细胞标记)。VDSCs相对CD163阳性、CD133和CD106(表面标记(图)3 (b))。根据differentiation-inducing实验维克和VDSCs VDSCs multilineage分化的潜力比维克(图3 (c))。与同一differentiation-inducing介质21天培养后,VDSCs有更多的钙结节和更大的脂滴,被茜素红S和油红O染色。VDSCs和维克被颗粒状,生长在chondrogenic媒体28天。的小球VDSCs阿尔新蓝染色阳性,表明对软骨形成蛋白聚糖的存在。

3.4。基因表达谱揭示全球VDSCs和维克之间的差异

箱线图显示,基因表达水平的分布维克和VDSCs之间分布不同;分散分布的VDSCs接近的脂肪msc (AdMSCs)(图4(一))。基因表达水平的系数显示VDSCs高度不同维克(# 1:0.310/0.415和# 2:0.317/0.423),但有点类似于AdMSCs(# 1: 0.766和# 2:0.748;图4 (b))。热图和全球基因表达分析显示两种类型的集群VDSCs和维克(图之间的区别4 (c))。度的散点图( ; )显示301基因调节和1294 VDSCs和维克(图之间的表达下调4 (d))。KEGG通路分析进行上述识别度。我们的结果表明,这些度在功能与溶酶体,高纯度磷酸肌醇3 kinase-Akt,机械的雷帕霉素的目标,粘着斑,细胞外基质(ECM)受体信号通路,和其他人(图4 (e))。此外,功能注释是above-identified度(1595个基因),如图4 (f)。分子功能分析表明,一些上述度高度参与蛋白质绑定。GTPase激活活动,等。这些度浓缩在细胞组件:质膜、胞质,胞外外来体,其中大多数是参与信号转导,积极调节GTPase活性和氧化还原过程(图4 (f))。

3.5。分析和比较选择基因VDSCs和维克之间

探索VDSCs之间的显著差异在形态学和维克,当结合KEGG-enriched通路,ECM-receptor交互,粘着斑和肌动蛋白细胞骨架调节被选为进一步度分析来识别关键目标。51共同度选择基于上述通路有关细胞形状和传播(图5(一个))。在维恩交互(图5 (b)),整合素α(ITGA) 1、2、3、7、8和纤连蛋白1 (FN1)被确定为与细胞粘附和迁移。此外,COL1A1、COL1A2 FN1 VDSCs基因表达水平明显高于在维克,而ITGAs水平和喇嘛都低于维克(图5 (c))。此外,runt-related基因表达的转录因子2 (RUNX2)公认的成骨的标记,MKI67 (VDSCs明显调节细胞增殖标记)相比,维克(补充数据(可用在这里):每千碱基片段记录每百万RNA-seq映射读取)。

4所示。讨论

维克培养在体外10% FBS-DMEM有各种不同形状和大小不同的细胞形态;当阀门血管内皮细胞(vec)完全不同于间质细胞被消灭,多样化的维克的亚种应该存在。我们所知,这是第一次MSC被用来分离形态均匀VDSCs文化条件。这些细胞是小得多的规模无论区域和周长。nuclear-cytoplasmic比率VDSCs类似于msc。从形态学方面,维克分组人口有一个统一的形态类似于msc。

msc具有极强的增殖能力(4,17,18];他们可以建立克隆生长密度独立的方式。我们的研究结果表明,VDSCs比维克增殖能力更强。MKI67如果两种类型的细胞的染色显示,大约80%的VDSCs MKI67-positive 2通道,通道3下降到约60%,而约50%的维克MKI67-positive通道2,在通道3下降到只有30%。维克在章节2和3,相比的百分比MKI67-positive VDSCs显著高于维克。MKI67核内蛋白,细胞增殖可能是必要的,作为细胞增殖的标志。ki - 67蛋白的细胞含量显著增加细胞的S期细胞周期进展(19,20.),这与我们的研究结果是一致的。FCM的细胞周期分析显示,VDSCs在S期的比例大约20%到10%的维克。主动脉瓣钙化的一个重要特征是生产过剩和无序的胶原纤维和其他ECM的蛋白质(21),可能由于快速的细胞增殖和分泌能力强。因此,VDSCs可能有不同的和重要的角色从维克主动脉瓣疾病。

分化是另一个msc的能力。尽管维克multilineage分化潜能(12),我们的研究表明,VDSCs似乎有更强的潜力。在同一differentiation-inducing介质21天培养后,VDSCs有更多的钙结节和更大的脂滴,被茜素红S和油红O染色。生长在chondrogenic媒体后28天,明显的颗粒被认为,阿尔新蓝染色阳性。主动脉瓣狭窄的后传播阶段就是procalcific和proosteogenic接管并最终驱动因素疾病进展(22),因此VDSCs肯定有助于这一过程。FCM表面标记的检测显示,VDSCs CD163和维克有不同的表情,CD133和CD106。CD106,也被称为血管细胞粘附分子1,是一种细胞表面蛋白参与血管内皮的粘附白细胞,也表现在msc的一小部分。先前的研究已经表明CD106⁺人类BM-MSCs显示更高的单独使用能力,表现出更快的增长率和健壮multilineage分化,和有更强的免疫调节活动(23]。因此,CD106⁺VDSCs表现出更多的反应,钙化的主动脉瓣疾病的重要诱因之一是无菌的,未经消毒炎症11]。CD133(也称为prominin-1,五个跨膜域所在细胞表面糖蛋白膜突起。表示在许多干细胞或祖细胞,尽管它的确切功能尚不清楚(24]。因此,它可以用作一个阀祖细胞的特定标记。此外,CD163属于清道夫受体cysteine-rich总科,及其表达仅限于monocytic-macrophage血统高表达,例如,红髓巨噬细胞,BM巨噬细胞,肝巨噬细胞(枯氏细胞),肺巨噬细胞和巨噬细胞的其他几个组织(25]。有趣的是,VDSCs部分CD163阳性。这是一个重要的发现,需要进一步调查。这是暗示CD163⁺VDSCs可能是来源于居民阀巨噬细胞(26]。

根据RNA-seq结果,基因表达水平系数显示VDSCs高度不同维克(# 1:0.310/0.415和# 2:0.317/0.423)但有一些相似性AdMSCs(# 1: 0.766和# 2:0.748),表明VDSCs基本MSC基因表达谱。此外,基因表达水平的ITGA1, 2、3、7和8;COL1A1;COL1A2;和FN1 VDSCs明显高于维克。RUNX2的基因表达和MKI67 VDSCs维克相比显著调节。这个结果也证实了上述细胞学维克和VDSCs之间的差异。

总之,小说,快速与纤维母细胞形态、增殖VDSCs发现表达间充质和成骨的标记,可以作为一种新颖的目标,导致主动脉瓣钙化。

数据可用性

可以按照客户要求所有的数据都包含在本研究通过与作者联系。

的利益冲突

我们声明,作者没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作得到了中国国家重点研发项目(2016 yfa0101100),中国国家自然科学基金(81770387,81770387,81770387,30872540,31330029,81170214,81270297,11602181,11532004),中国博士后科学基金(批准号:2018 m630867),访问学者重点实验室的基础Biorheological科技(重庆大学)和教育部(授予数量:cqklbst - 2018 - 009)。

补充材料

的excel文件是RNA-seq数据样本。为了让评审人员更好地理解我们的全球基因表达谱比较两种类型的细胞,我们提供RNA-sequencing的原始数据。(补充材料)