棕榈酸甲酯诱导G₂/ M逮捕在人类骨骨髓来源间充质干细胞通过p53、p21通路

文摘

骨骨髓来源间充质细胞向脂肪细胞分化(BM-MSCs)有能力,可以分泌发病影响BM-MSC增殖和分化。最近的证据表明,脂肪细胞可以分泌脂肪酸代谢产物,如棕榈酸甲酯(上岛),就是能引起血管舒张和发挥抗炎作用。然而,上岛对BM-MSC扩散的影响尚不清楚。本研究的目的是调查的影响人类BM-MSC上岛(hBM-MSC)增殖和其潜在的分子机制。hBM-MSCs上岛治疗,疗程48 h,然后进行各种各样的分析。从目前的研究结果表明,上岛显著降低G的水平₂/ M阶段调控蛋白,细胞周期蛋白依赖性激酶1 (Cdk1),细胞周期蛋白B1和hBM-MSCs抑制增殖。此外,Mdm2蛋白的水平下降,p21和p53蛋白的水平增加PAME-treated hBM-MSCs。然而,上岛治疗没有明显影响细胞凋亡/坏死,ROS生成和Cdc25C蛋白质的水平。上岛也诱导细胞内酸中毒和增加细胞内钙^{2 +}的水平。Cotreatment上岛和Na⁺/小时⁺换热器抑制剂一起进一步降低了细胞内的pH值,但没有影响细胞增殖的PAME-induced减少和增加的细胞群G₂/ M期。Cotreatment上岛和钙螯合剂抑制细胞内钙PAME-increased放在一起^{2 +}水平,但没有影响PAME-induced细胞增殖抑制和G₂/ M细胞周期阻滞。此外,p53蛋白的半衰期延长在PAME-treated hBM-MSCs。总的来说,这些结果表明,上岛p53诱导稳定,进而增加p53、p21蛋白的水平,减少Cdk1 /细胞周期蛋白B1蛋白质的水平,从而防止Cdk1的激活,最终引起细胞周期阻滞在G₂/ M期。本研究的发现可能帮助洞察上岛的生理作用在调节hBM-MSC增殖。

1。介绍

间充质干细胞(msc),存在于骨髓基质,脂肪,和许多其他组织,组织再生候选人由于其高增殖率和multilineage分化潜力(1]。最近的研究表明,msc不仅可以取代病变的组织,但也产生一些营养,再生和抗炎作用2]。然而,msc的数量可以从捐赠者仍然获得足够的细胞疗法的目的(3]。因此,必须获得最大数量,扩大人口体外为了成为可行的用于临床应用。

人类骨骨髓来源msc (hBM-MSCs)已经被广泛的研究多年,用于多个临床研究和试验。self-renewable和保留可能分化成周,myofibroblasts,骨髓基质细胞,骨细胞、成骨细胞和内皮细胞,所有这些支持造血作用和稳定的骨量(4,5]。在最近的研究中,性别和年龄显著影响的节目hBM-MSCs和增殖能力的数量6,7]。居民msc的数量的减少可能是最重要的因素之一,负责减少骨形成和随后的骨骼脆性增加8]。

骨骨髓来源msc驻留在专门的微环境。这些干细胞利基市场必不可少的保护他们的自我更新和分化能力9,10]。骨髓是由多种细胞类型包括脂肪细胞,这是一种最丰富的成人骨髓细胞类型和构成大约15%的骨髓体积在年轻的成年人,上升到60%的年龄65岁(11]。据报道,脂肪细胞的数量与骨髓的造血活动负相关。Adipocyte-rich骨髓造血干细胞数量下降相比adipocyte-poor骨髓(12]。这些发现表明,脂肪细胞主要是消极的骨髓微环境的监管机构。

已经表明,脂肪组织产生和分泌各种发病和游离脂肪酸(FFA),可能会影响骨髓适合组织的体内平衡和修复(13]。最近的一项研究表明,血管周围脂肪组织可以释放棕榈酸甲酯(上岛),导致血管舒张(14]。上岛是一种内源性脂肪酸甲酯(名声),据报道,已具有强大的抗炎和antifibrotic活动(15- - - - - -17]。然而,上岛在hBM-MSC扩散的影响尚不清楚。

p53蛋白可以诱导细胞周期阻滞和细胞死亡。调节细胞命运决定大量研究的重点。细胞周期阻滞由p53需要p21的转录,这是一个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。p53、p21通路已被证明调制的扮演一个角色的分化和增殖干细胞(18,19]。在正常细胞,p53是保持在低水平的小鼠双2分钟(Mdm2),可以绑定到p53和充当p53泛素连接酶负调节p53功能在几个细胞通路,如细胞周期和细胞凋亡。先前的研究已经表明,Mdm2抑制剂可降低大鼠的细胞增殖BM-MSCs (rBM-MSCs)和hBM-MSCs [20.,21]。然而,机制PAME-induced p53稳定和顺向细胞周期阻滞在hBM-MSCs尚未阐明。在目前的调查中,我们描述中涉及的信号通路PAME-inhibited hBM-MSC增殖。

2。材料和方法

2.1。化学物质

上岛和硬脂酸甲酯(同样的)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国),甲醇溶解在100%。抗霉素A (AMA) cariporide(锄642),1,以叔(2-aminophenoxy) ethane-N, N, N ,N - - - - - -四乙酸脂鲤(acetoxymethyl酯)(BAPTA-AM),放线菌酮(CHX) ionomycin,斑蝥素(CTD)从Sigma-Aldrich购买。SC79从开曼群岛购买化学公司(美国安阿伯市MI);lb - 100从BioVision购买(苗必达、钙、美国);乙基异丙基阿米洛利(EIPA)从研究生化购买注册(美国纳蒂克,MA)。

2.2。准备和rBM-MSCs文化

成年男性Sprague-Dawley老鼠(270 - 350 g)被用作骨髓细胞捐献者。胫骨和股骨的得到了rBM-MSCs麻醉的大鼠使用聚氨酯(1.5 g / kg, i.p。)和牺牲。批准的协议是动物保健和使用委员会制度慈济大学(IACUC批准号107003)。骨髓细胞取出使用磷酸盐(PBS)含1%青霉素和链霉素(Gibco;大岛屿,美国纽约),通过100年μ尼龙网。单核rBM-MSCs被孤立聚蔗糖密度梯度离心法在Ficoll-Paque™+(通用电气医疗集团;乌普萨拉,瑞典)。单核rBM-MSCs用移液器吸取,轻轻地用PBS洗净,然后离心5分钟在1200 rpm的两倍。最后的颗粒是resuspendedαmem (Gibco)补充15%胎牛血清(的边后卫)青霉素和链霉素(Gibco)和1%。rBM-MSCs孵化在37°C在充分湿润的气氛中有5%的公司₂每72 h,媒介改变了。增长到70 - 80%融合后,细胞分离使用0.25% trypsin-EDTA (Gibco),然后通过添加新鲜培养基中和。对实验中,rBM-MSCs被培养αmem补充1%的边后卫,1%,青霉素、链霉素和各种浓度(10、30、50、100μ米)上岛48 h和孵化37°C在充分湿润的气氛中有5%的公司₂。

2.3。hBM-MSC文化

hBM-MSCs从Sigma-Aldrich获得是有文化的αmem补充与青霉素、链霉素的边后卫15%和1%。对实验中,hBM-MSCs被培养αmem补充1%的边后卫,1%,青霉素、链霉素和各种浓度(10、30、50、100μ米)上岛48 h和孵化37°C在充分湿润的气氛中有5%的公司₂。

2.4。MTT试验

5-Dimethylthiazol-2-yl 3 - (4) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT) (Sigma-Aldrich)解决方案在PBS(5毫克/毫升)被添加到每个3.5厘米培养皿和孵化2 h在37°C。然后,1毫升的二甲亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich)添加到溶解甲瓒晶体。吸光度的测定在570 nm使用ELISA板阅读器(Multiskan交货;热,沃尔瑟姆,妈,美国)。

2.5。赫斯特33342年染色

这些细胞被固定在10%甲醛在室温下1 h (RT)然后permeabilized 15分钟在RT Triton x - 100年的0.15%。阻塞后1%牛血清白蛋白(BSA)在RT PBS 15分钟,细胞核被沾染了2μ赫斯特33342 (Sigma-Aldrich),然后孵化15分钟在rt,图片拍摄40 x使用共焦显微镜(尼康C2 Si的放大⁺;美国纽约梅尔维尔)使用NIS-Elements成像和分析软件。

2.6。BrdU化验

细胞增殖是通过测量5-bromo-2评估 - - - - - -脱氧尿苷(BrdU)合并使用细胞增殖试验设备(微孔;美国伯灵顿,MA)后,制造商的指示。短暂,BrdU被添加到每个的96孔板和孵化24 h。PBS的细胞被洗了几次然后固定修复解决方案在RT 30分钟,清洗集中,然后孵化anti-BrdU单克隆抗体1 h RT,洗后,这些细胞被孵化与peroxidase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白在RT为30分钟,用PBS洗净,然后孵化三甲过氧化物酶底物的30分钟在沿板是由ELISA板的读者阅读450海里(Multiskan交货;热)。

2.7。免疫印迹分析

hBM-MSCs提取蛋白质和细胞溶解里帕裂解缓冲(美国微孔)包含1%的蛋白酶抑制剂(Calbiochem;美国圣地亚哥,CA)和0.5%磷酸酶抑制剂(Calbiochem)。蛋白质浓度测定用BSA蛋白分析工具包(Bio-Rad;赫拉克勒斯、钙、美国)。Tris-HCl电泳样品缓冲(1米,pH值6.8,2-mercaptoethanol 5%, 20%甘油、10% SDS和0.5%溴酚蓝)添加到细胞溶解产物和煮10分钟110°C。然后,30μg蛋白的样本装入SDS-polyacrylamide凝胶10%,进行电泳,然后转移到PVDF膜(微孔)。膜处理5% BSA在tween-tris-buffered盐水(T-TBS)缓冲区(200毫米Tris-HCl 0.05%渐变20日,pH值7.4,和1.5 M氯化钠)为1 h RT阻止非特异性免疫球蛋白然后孵化主要抗体稀释T-TBS缓冲一夜之间在4°C。主要和次要的信息抗体用于这项研究显示如下:主要抗体包括anti-Cdk1 anti-p21, anti-cyclin B1, anti-Cdc25C, anti-p53,和1000年anti-Mdm2稀释;反β肌动蛋白从GeneTex购买(美国欧文CA)是在10000年稀释。二次抗体包括peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白和anti-mouse免疫球蛋白在T-TBS稀释缓冲(1:5000)。结果分析了乐队使用Image-Pro +软件和规范化β肌动蛋白。

2.8。胞质活性氧分析

2.5 hBM-MSCs孵化了μM CM-H₂DCFDA(分子探针;尤金,或者美国)为30分钟37°C。图像目标在20 x使用共焦显微镜(尼康C2 Si的放大⁺)使用NIS-Elements成像和分析软件。

2.9。定量实时聚合酶链反应

总rna提取使用试剂盒从hBM-MSCs试剂(Ambion;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)根据制造商的指示。总互补dna合成和封底使用3™cDNA工具包(热)μ克的总rna。定量实时PCR是由混合互补脱氧核糖核酸与Maxima SYBR绿色qPCR大师(2 x)和混合火箭解决方案(热),然后使用ABI棱镜7300实时PCR检测系统(应用生物系统公司;沃尔瑟姆,美国马)。以下使用PCR引物:Cdk1,向前:5 - - - - - -柠檬酸GGA TTT CTC-3甘氨胆酸柠檬酸GAG TGG总部 ,反向:5 - - - - - -GCC ATT TTG CCA棉酚攻击力CGT TTG三大 ;细胞周期蛋白B1,向前:5 - - - - - -TGC CCC TGC AGA AGA AGA有条件现金援助GTG条t - 3 ,反向:5 - - - - - -TGT TTC CAG CTT CCC广汽CCA GT-3 ;p53,向前:5 - - - - - -CCC CTC CTG GCC有条件现金援助GTC ATC TTC-3 ,反向:5 - - - - - -GCA GCG有条件现金援助CAC AAC CTC CGT CAT-3 ;p21,向前:5 - - - - - -GAG GCC GGG ATG AGT TGG GAG GAG-3 ,反向:5 - - - - - -CAG 20 GCG TTT GGA GTG GTA GAA-3 ;和GAPDH,向前:5 - - - - - -TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3 ,反向:5 - - - - - -GGC ATG广汽TGT GGT猫GAG-3 。所有基因表达进行了分析使用比较Ct方法(2^{- - - - - -ΔΔCt}), 相对于GAPDH水平。

2.10。流式细胞术

细胞死亡、ROS和细胞内的pH值分析进行了使用FACSCalibur流式细胞分析仪(Becton Dickinson生物科学;美国加利福尼亚州圣何塞)。细胞周期和细胞内钙^{2 +}分析使用gallio™流式细胞分析仪(贝克曼库尔特;沥青、钙、美国)。

2.10.1。细胞死亡分析

细胞凋亡/坏死是使用膜联蛋白检查V-FITC凋亡装备+ (BioVision)。激发/发射在488/530 nm波长检测。

2.10.2。细胞周期分析

hBM-MSCs被分离成单个细胞用0.25%胰蛋白酶,固定在1毫升70%乙醇在-20°C 1 h,然后离心5分钟在2000 rpm。上层清液被免职,特里同x - 100(0.1%)添加到permeabilize hBM-MSCs,然后处理DNase-free核糖核酸酶A(0.2毫克/毫升)(Sigma-Aldrich)和沾propidium碘(π)(20μg / mL) 30分钟在rt,激发/发射检测在488/585 nm波长。

2.10.3。活性氧分析

2.5 hBM-MSCs孵化了μM MitoSOX™红试剂(分子探针)。激发/发射在510/580 nm波长检测。

2.10.4。细胞内钙^{2 +}分析

2.5 hBM-MSCs孵化了μM Fluo-3-AM(表达载体;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。激发/发射在488/525 nm波长检测。

2.10.5。细胞内的pH值分析

hBM-MSCs与200 nM孵化2 ,7 - - - - - -bis(羧乙基)5,6-carboxyfluorescein acetoxymethyl酯(BCECF-AM;分子探针)。校准缓冲CaCl(140毫米氯化钾,2毫米₂,1.2毫米MgSO₄10毫米玫瑰11毫米葡萄糖,10μ米nigericin)与KOH调整pH值6.5。Nigericin, K⁺/小时⁺离子载体,用于设置内部酸碱外部在缺乏K⁺梯度穿过细胞膜,使[K⁺]_我/ [K⁺]_o等于(H⁺]_我/ (H⁺]_o。激发/发射在488/530 nm波长检测。

2.11。gc - ms分析

河鼠骨髓冲洗方案刷新了使用0.025 mL / g体重PBS补充1%青霉素、链霉素和0.025 mL / g体重αmem补充与青霉素、链霉素的边后卫1%和1%。样本提取与甲醇溶解有机化合物,离心收集的漩涡,用近,据以前的报告(14]。上层清液转移到螺帽与聚四氟乙烯/硅胶隔管帽。样品进行了分析使用惠普(美国惠普,帕洛阿尔托,CA) 6890系列二世色谱仪耦合惠普5973质量探测器配备G1512A自动注射器BPX5 5%苯基polysilphenylene-siloxane毛细管柱( ;膜厚度0.25μ米)。电离能是70 eV。载气是他(流0.6毫升/分钟)。注入块的温度为250 - 300°C。GC烤箱温度程序如下:初始温度为90°C,后跟一个温度升高15°C /分钟到240°C和二流10°C / min的最终温度300°C。质谱是通过扫描 50到550。数据获取和分析使用惠普G1701AA ChemStation软件0.300版本。

2.12。统计分析

给出了实验数据 并与未配对 - - - - - -测试。数据来自三个或更多组受到单向方差分析之后,费舍尔最显著差异测试值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。检测上岛和相同的鼠骨髓

先前的研究表明,饥饿了同样包括上岛和上颈神经节和视网膜22,23]。最初,我们使用气相生成一个五点校准曲线从分析methanol-extracted获得解决方案包含一个标准的上岛,在五个不同浓度(1相同μ5米,μ10米,μ50米,μ米,100μ米),分别为(数字1(一)和1 (b))。校准曲线用于上岛和相同浓度的定量分析骨髓冲洗液体。大鼠股骨和胫骨被切除,河鼠骨髓组织遏制与PBS脸红了。上岛和相同的骨髓冲洗PBS,并用gc - ms检测和量化。冲洗PBS的上岛和相同浓度是51.59μM和32.66μ分别为M(数字1 (c)和1 (d))。之前的研究表明,从上颈神经节释放上岛,视网膜,血管周围脂肪组织是calcium-dependent [14,22,23]。我们也使用中收获疟疾行动,以确定是否上岛,在冲洗介质的浓度不同于那些与PBS刷新。我们的结果表明,上岛和冲洗介质的浓度44.44相同μM和30.87μ分别为M(数字1 (c)和1 (d)),他们并没有统计上显著不同的浓度从法拉盛获得PBS。这些数据表明,骨髓含有饥饿,包括上岛和相同。

3.2。上岛对rBM-MSC扩散的影响

上岛的影响在rBM-MSC扩散使用MTT试验评估。如图1 (e)、治疗与上岛(10 - 100μ米)介质中含1%的边后卫48 h显著降低rBM-MSC扩散浓度的方式。进一步检查上岛的特异性rBM-MSC增殖抑制,相同的扩散效应,名声的结构模拟,进行了测试。治疗与相同浓度范围(10 - 100μM) 48小时没有明显影响的扩散rBM-MSCs(图1 (e)右面板)。甲醇(1:1000),孵化介质中使用的车辆,没有明显影响的可行性rBM-MSCs(图1 (e)左面板)。

3.3。上岛对hBM-MSC扩散的影响,细胞凋亡和坏死

hBM-MSCs上岛的增殖的影响被评估使用MTT,赫斯特33342染色,BrdU化验。为了检查适当的边后卫浓度所需的培养基PAME-induced增殖抑制,hBM-MSCs孵化的培养基补充了上岛(50μ的边后卫M)和不同浓度(0%,1%,3%,5%,10%,和15%)48 h。我们的结果表明,上岛培养基含有1%或3%的边后卫显著地抑制hBM-MSC扩散,和上岛最强的抑制在中包含1%的边后卫(补充1)。此外,治疗上岛(10 - 100μ米)在中含有1%的边后卫48 h显著降低hBM-MSCs扩散浓度的方式(图1 (f))。另一方面,相同的治疗(10 - 100μ米)在中含有1%的边后卫48 h hBM-MSC扩散(图没有明显影响1 (f)右面板)。甲醇(1:1000),孵化介质中使用的车辆,没有明显影响的可行性hBM-MSCs(图1 (f)左面板)。我们也评估的影响上岛的增长由赫斯特33342年hBM-MSCs染色试验。如图2(一个)治疗50或100年μM上岛48 h显著降低hBM-MSCs的数量。上岛的hBM-MSC增殖的抑制作用是进一步证实了采用免疫检测BrdU合并。如图2 (b)BrdU合并,DNA合成指标,显著降低了hBM-MSCs暴露48 h - 50μM上岛,而不是汽车。数量的减少确认PAME-induced hBM-MSCs不是由于细胞凋亡和坏死检查通过流式细胞术使用膜联蛋白V-FITC凋亡装备+,其中包括膜联蛋白V-FITC检测细胞凋亡和SYTOX绿色染料检测坏死。图2 (c)显示的直方图代表PAME-treated hBM-MSCs沾膜联蛋白+ V-FITC凋亡工具包。治疗hBM-MSCs 50或100μM上岛48 h的数量并没有显着影响的可行的细胞(图2 (d)(图),凋亡细胞2 (e)(图),坏死细胞2 (f))。相比之下,治疗3 h和20μM AMA,作为一个积极的控制细胞死亡感应,可行的细胞的数量减少和增加凋亡和坏死细胞的数量。这些结果表明,PAME-reduced hBM-MSC细胞数量是由于抑制增殖,但不能诱导细胞死亡。

3.4。影响细胞周期进程hBM-MSC上岛

hBM-MSCs对细胞周期的影响是研究使用π核酸染色流仪结果紧随其后。上岛(50μ米)显著增加的细胞群G₂G / M期和减少₀/ G₁阶段,但没有显著影响S期和sub-G₁阶段(数据3(一个)和3 (b))。这些结果表明,上岛诱导细胞周期阻滞在G₂/ M期。确认上岛诱导G₂/ M阶段逮捕,信使rna和蛋白质水平的G₂/ M调控蛋白,Cdk1和细胞周期蛋白B1, hBM-MSCs检查。定量rt - pcr分析表明,Cdk1和细胞周期蛋白B1的mRNA水平显著降低PAME-treated组与对照组相比(图3 (c))。的蛋白质含量Cdk1(图3 (d))和细胞周期蛋白B1(图3 (e))检测到免疫印迹分析PAME-treated组也减少了。甲醇(1:1000),孵化介质中使用的车辆,没有明显影响的蛋白质含量Cdk1(图3 (d))和细胞周期蛋白B1(图3 (e))。此外,治疗上岛p53的蛋白质含量明显增加(图4(一)p21)和(图4 (b)),但不是Cdc25C(图4 (c)在hBM-MSCs)。

3.5。上岛对活性氧的影响生产

细胞生成的活性氧是氧化还原信号的核心。ROS以来证明作为上游信号触发激活p53,我们接下来研究线粒体ROS生产PAME-treated hBM-MSCs流仪分析使用MitoSOX™红试剂。如图4 (d)、治疗上岛(50μ米)在1% FBS-containing媒介48小时没有明显影响hBM-MSCs线粒体ROS水平。我们还研究了胞质ROS生产hBM-MSCs对待上岛(50μ共焦显微镜使用CM-H M)₂DCFDA。作为显示在图4 (e)上岛不明显影响胞质ROS水平。在这些研究中,作品的ROS hBM-MSCs处理100海里AMA 30分钟和100年μM H₂O₂1 h被用作ROS生产,积极控制。

3.6。影响细胞内酸中毒的PAME-Inhibited hBM-MSC细胞增殖

因为花生四烯酸甲酯(AAME)据报道能够诱导细胞内酸中毒的老鼠心脏细胞和小脑颗粒细胞(24,25),我们检查了上岛能否诱导细胞内酸中毒,因此抑制hBM-MSC扩散。治疗hBM-MSCs上岛(50μ米)48 h BCECF水平显著降低,细胞内的比率酸碱指示剂。此外,cotreatment上岛和Na⁺/小时⁺换热器杀杀杀,cariporide(锄642)或乙基异丙基阿米洛利(EIPA),进一步减少BCECF水平(图5(一个))。甲醇(1:1000),孵化介质中使用的车辆,没有明显影响的细胞内酸中毒hBM-MSCs(图5(一个))。然而,cotreatment上岛和锄头642或EIPA没有进一步减少PAME-induced hBM-MSC细胞数量减少(图5 (c))。此外,cotreatment一起上岛和锄头642没有进一步增加PAME-increased G细胞数量的百分比₂(图/ M阶段5 (d))。综上所述,这些数据显示,PAME-induced hBM-MSC增殖抑制并不是由于细胞内酸中毒。

3.7。细胞内钙的影响^{2 +}在PAME-Inhibited hBM-MSC细胞增殖

胞质钙^{2 +}浓度波动以有序的方式沿着细胞周期,这表明Ca^{2 +}可能参与调节细胞增殖。因为p53可以调节细胞内Ca^{2 +}体内平衡(26),我们检查是否上岛可能影响细胞内Ca^{2 +}的浓度,从而抑制hBM-MSC扩散。治疗hBM-MSCs上岛(50μ米)48 h Fluo-3水平显著增加,细胞内的钙^{2 +}指标。甲醇(1:1000),孵化介质中使用的车辆,没有明显影响细胞内Ca^{2 +}hBM-MSCs(图5 (b))。此外,cotreatment上岛和BAPTA-AM (0.5μ米),Ca^{2 +}螯合剂,废除了PAME-increased Fluo-3-AM水平(图5 (b)),但没有显著影响在hBM-MSCs PAME-induced增殖抑制(图5 (c))和PAME-increased G细胞数量的百分比₂(图/ M阶段5 (d)),这表明PAME-induced hBM-MSC增殖抑制并不是由于增加细胞内钙^{2 +}浓度。

3.8。上岛对p53蛋白的影响稳定

我们进一步调查是否PAME-increased p53、p21蛋白的水平是由于增加的转录和翻译。定量rt - pcr分析表明,上岛p21的mRNA水平显著提高,但不是p53在hBM-MSCs(图6(一))。这些发现表明,上岛可能增加p53蛋白的稳定性。为了解决这个问题,Mdm2蛋白的水平,消极监管机构p53, p53蛋白降解率检查。免疫印迹分析表明,上岛(50μ米)治疗减少了Mdm2的蛋白质含量在hBM-MSCs(图6 (b))。此外,治疗上岛6 h后放线菌酮(CHX),蛋白质合成抑制剂,0.5到6小时的半衰期显著延长p53蛋白(图6 (c))。因此,上岛确实可以减少p53的速度退化,因此导致p53蛋白稳定。

4所示。讨论

hBM-MSCs广泛调查潜在的治疗应用。然而,骨髓的hBM-MSCs数量不是足够高的治疗目的。因此,实验和临床调查人员继续寻找新的方法来扩大孤立hBM-MSCs体外获得足够数量。在目前的研究中,我们表明,上岛显著降低扩散在rBM-MSCs和hBM-MSC(数字1 (e)和1 (f))。这些发现的结果不同于其他两组(27,28]。我们的结果之间的差异和他们的结果可能是由于使用的上岛的浓度的差异。在我们的研究中,使用上岛的浓度是50μ米,接近冲洗介质的浓度检测大鼠骨髓,不引起细胞死亡,但显著降低扩散rBM-MSCs和hBM-MSCs(数字1和2)。另一方面,上岛在他们的研究中使用的浓度是333年μ米以上,远高于在我们的研究中使用的浓度。

上岛,最丰富的脂肪酸在哺乳动物细胞(29日),代表了一种内源性天然名声(30.]。据报道,内生上岛主要鼠枯否细胞中能够抑制吞噬作用(15,31日];抑制纤维化的影响(17,32,33),炎症(16,34),和氧化应激35];诱导血管舒张(14,22,23,36,37];和防止非酒精性脂肪肝炎38]。然而,PAME-induced生物效应的分子机制仍不清楚。在目前的研究中,我们表明,治疗上岛诱导细胞周期阻滞在G₂通过upregulation p53蛋白/ M期,这已经表明在调节压力诱导的G₂/ M有丝分裂细胞周期的过渡。p53的机制调节G₂/ M转型涉及Cdk1的规定,这是至关重要的细胞周期进入有丝分裂(39]。镇压的细胞周期蛋白B1和Cdk1 p53执行逮捕。然而,p53诱导细胞周期蛋白B1的镇压和p21 Cdk1可能涉及upregulation。p21,转录p53的目标,可以抑制Cdks的活动和参与G₂检查点。p21抑制Cdk活动直接绑定到Cdk /细胞周期蛋白复合物。尽管p53 Cdk1活动不影响其他目标,但也导致了G₂逮捕,我们的数据表明,上岛诱导G₂/ M细胞周期阻滞通过p53 / p21-mediated Cdk1蛋白质含量的减少和细胞周期蛋白B1 hBM-MSCs(数字3,4(一),4 (b))。以前的研究已经表明上岛可以增强脑血流量(CBF),从而减轻神经细胞死亡在脑缺血后海马CA1区。此外,上岛还产生其他nonvasodilation-dependent神经保护效应(即。antiapoptosis) (40,41]。在目前的研究中,我们的数据显示,上岛不引起细胞凋亡和坏死hBM-MSCs(数字2 (e)和2 (f)),但增加p21的表达(图4 (b)),表示作为细胞凋亡在许多系统的抑制剂(42]。p21 antiapoptosis /坏死造成的积累可能导致PAME-induced缺血后神经保护。

先前的研究已经表明,CCl上岛减少₄全身或脂多糖(LPS)诱导的磷酸化的抑制κB(我κBα),核易位的核因子-κB (NF -κB),和随后的体外和体内促炎细胞因子的生产15,16,33,34]。然而,背后的机制PAME-regulated NF -κB水平尚未阐明。它已经表明,异位p53的表达增强的NF -κB DNA结合但阻止其transactivation功能(43,44]。在目前的研究中,我们表明,上岛显著增加(图的p53蛋白水平4(一)),它可能参与PAME-reduced核NF -κB级和炎症反应。另一方面,NF -κB可以减少p53的水平上调Mdm2的表达(44,45]。因此,上岛可能通过上调p53蛋白水平表达下调Mdm2的表达减少NF -核易位所致κB。

酸中毒已经证明增加p53蛋白水平和p21和Mdm2的mRNA水平46]。在目前的研究中,我们表明,上岛显著诱导细胞内酸中毒hBM-MSCs(图5(一个))。维持体内酸碱平衡的细胞外液体和细胞质对细胞增殖和分化至关重要。它已经表明,酸度降低rBM-MSCs和人类脂肪细胞的增殖和生存能力msc (47,48]。hBM-MSCs高度敏感的小变化外部博士据报道,孵化PMC-22细胞在pH值为6.5介质48 h导致显著降低的细胞群G细胞的S期和积累₁阶段(49]。应用亚致死的酸性压力(pH值3.3,37°C) 25分钟诱发G₁逮捕在Jurkat t淋巴球和G₂逮捕A301细胞(50]。然而,cotreatment上岛和锄头642或EIPA并不影响PAME-induced G₂/ M在hBM-MSCs被捕(图5 (d)),这表明PAME-induced G₂/ M逮捕并不是由细胞内酸中毒诱导引起的。

尽管PI染色可用于评估细胞周期状态,它不能确定细胞S期实际上是骑自行车。在图2 (b),我们使用BrdU检测S期的进展;结果表明,上岛可以显著抑制DNA合成。尽管使用BrdU脉冲/追踪实验可以更容易地识别细胞G₁,S, G₂阶段和定义细胞周期动力学(51),这种技术可能不适合研究干细胞的细胞周期动力学由于比率很低在S期干细胞。我们试图检测细胞周期动力学hBM-MSCs使用FITC BrdU流工具包(BrdU和7-AAD),但结果显示BrdU-positive细胞的比例很低。因此,前脉冲BrdU不能有效地追逐细胞周期动力学。

细胞内钙^{2 +}增加参与控制许多细胞过程,如细胞增殖、分化和凋亡。据报道,增加细胞内钙^{2 +}导致激活p53、p21和黑色素瘤细胞中诱导细胞周期阻滞52]。此外,人类角质细胞的生长抑制引起的高钙^{2 +}已被证明是由p21 upregulation [53,54]。在目前的研究中,我们表明,上岛增加细胞内钙^{2 +}水平(图5 (b))。然而,cotreatment上岛和BAPTA-AM Ca^{2 +}螯合剂,并不影响PAME-induced G₂/ M在hBM-MSCs被捕(图5 (d)),这表明PAME-induced G₂/ M逮捕并不是由细胞内钙的增加引起的^{2 +}。此外,它已经表明p53可以直接绑定到石棺/内质网钙^{2 +}腺苷三磷酸酶(SERCA)泵在石棺/内质网(SR / ER),改变其氧化状态,从而导致增加Ca^{2 +}负载,紧随其后的是一个增强转移到线粒体(55]。最近这个信号也被证明是重要的有丝分裂期进展(56]。不幸的是,SR / ER线粒体Ca^{2 +}传输BAPTA-AM不敏感。为了进一步排除Ca的变化^{2 +}在SR / ER和线粒体中,这可能影响M阶段进展,我们使用Mag-Fluo4和Rhod-2测量SR / ER和线粒体钙^{2 +}浓度,分别。数据显示,上岛导致显著增加SR / ER Ca^{2 +}但没有显著影响线粒体Ca^{2 +}(补充2)。这些数据表明,PAME-induced G₂/ M逮捕并不是增加引起的线粒体Ca^{2 +}。PAME-increased细胞内酸中毒和细胞内钙的生理意义^{2 +}值得进一步调查。

Mdm2已被证实能发挥重要的作用在调节造血干细胞生存(57]。此外,先前的研究已经表明,Mdm2在rBM-MSCs抑制剂可以抑制细胞增殖和hBM-MSCs20.,21]。功能障碍Mdm2、p53的轴与细胞增殖和细胞凋亡有关。Cdc25C dual-specificity磷酸酶,促进细胞周期进入有丝分裂的抑制Cdks磷酸盐。Mdm2-promoted Cdc25C蛋白质退化已被证明通过G延迟细胞周期进程₂/ M期(58]。然而,上岛治疗没有明显影响Cdc25C蛋白质在hBM-MSCs(图的水平4 (c))。在目前的研究中,我们表明,治疗上岛诱导hBM-MSC G细胞周期阻滞₂通过p53-dependent通路/ M期。

它已经表明,Akt蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶参与调节细胞生长、增殖和凋亡过程,可以提高Mdm2-mediated p53的泛素化和降解59]。Akt激活是由蛋白磷酸酶2 (PP2A)丝氨酸/苏氨酸磷酸酶参与有丝分裂进程和细胞对DNA损伤的反应。最近的一项研究表明,PP2A导致细胞周期阻滞通过p53 / p21通路在肝细胞(60]。另一项研究提供证据表明,PP2A块HA22T细胞增殖通过抑制PI3K / Akt / Mdm2-mediated p53激活(61年]。在目前的研究中,我们表明,治疗上岛的蛋白质水平显著提高PP2A和减少p-Akt的蛋白质水平。然而,cotreatment上岛和PP2A抑制剂,斑蝥素(CTD)或磅- 100,或一种蛋白激酶活化剂,SC79,并不影响PAME-induced增殖抑制hBM-MSCs(补充3)。这些发现表明,激活的一种蛋白激酶和upregulation PP2A可能不参与PAME-induced hBM-MSC增殖抑制。

尽管过度增殖hBM-MSCs尚未与临床疾病相关报道称,之前的研究表明,hBM-MSCs可以招募到肿瘤微环境,随后促进增殖、入侵、生存、致瘤性,在各种癌症和迁移62年,63年]。此外,BM-MSCs提高卵巢癌通过释放的药物抗性mir - 1180和移植糖酵解水平64年]。我们的数据表明,上岛诱导细胞周期阻滞和细胞数量减少BM-MSCs(数据1 (e),1 (f),2(一个),2 (b),3)。我们还发现,上岛能增加癌症细胞系A549的p53表达(补充4)。因此,使用上岛来减少hBM-MSCs可能是一个潜在的治疗癌症疾病的应用。

5。结论

我们的研究结果表明,上岛下调Mdm2,进而导致p53稳定,随后增加蛋白质含量p53、p21和减少Cdk1 /细胞周期蛋白B1蛋白质的水平,并最终引起细胞周期阻滞在G₂/ M期。我们提出一个模型的分子机制PAME-induced细胞周期阻滞在hBM-MSCs如图7。

数据可用性

所有材料都可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究由科技部支持,台湾(格兰特大多数105 - 2320 - b - 320 - 015),由慈济大学、台湾(格兰特tcmrc - p - 103009)。

补充材料

补充1:的边后卫浓度对PAME-inhibited hBM-MSC增殖。补充2:上岛对SR / ER和线粒体的影响(Ca^{2 +}在hBM-MSCs]。补充3:参与的一种蛋白激酶和PP2A PAME-inhibited hBM-MSC增殖。补充4:上岛对A549细胞p53蛋白水平。(补充材料)

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