文摘
卫星细胞(SC)骨骼肌的干细胞。他们在成年动物静止但简历扩散让肌肉肥大或损伤后再生。平衡静止的机制、自我更新和分化的SC很难分析在活的有机体内由于其复杂性和在体外因为SC的雄蕊的字符丢失时从利基和不充分复制在现有的文化模式。为了克服这些困难,我们建立一个文化模式的肌原性的C2C12细胞悬浮。当C2C12细胞悬浮培养,他们进入静止状态,形成三维聚合(myospheres)产生细胞外基质和表达静SC的标志。在初始阶段的文化,部分细胞融合在myospheres合胞体和放弃。剩余的细胞是单核的简历和静止但增殖和分化时镀单层。notch通路控制细胞的静止状态如图所示,分化的抑制导致重启。在这种背景下,notch3似乎发挥核心作用的活动以来这个途径的表达notch1下降后不久聚合。总之,C2C12悬浮的文化模型可以用来研究肌肉干细胞的细胞间的相互作用和途径控制SC静止入口和维护。
1。介绍
卫星细胞(SC)基板之间的谎言和骨骼肌的肌纤维膜纤维。在成人肌肉,静到体育锻炼或肌肉损伤诱发他们的激活。SC增殖并产生成肌细胞融合在一起或与现有的肌纤维,从而使骨骼肌的生长和修复1]。在成人干细胞生物学方面的核心问题的说明分子机制,保持组织的再生潜力通过维持人口的可逆静止的干细胞。一些研究结果表明,可逆静止不是细胞不活跃的状态,而是特定的分子程序的结果(2,3]。
SC生物学的研究在活的有机体内是困难的,由于环境的复杂性,SC的密度相对较低,缺乏特定的标记来识别他们(4]。不可能保持SC的静止状态在体外因为任何隔离程序触发激活并将它们转换为循环成肌细胞进行分化。SC失去staminality因为他们回到静止杜绝在单层培养缺乏适当的利基。
选择的系统描述静止SC是通过流式细胞仪从胶原酶消化肌肉。这个过程提出了一些问题,因为SC异构和流式细胞仪的抗体选择隔离选择子集的细胞(5]。此外,隔离程序激活SC,激活继续在流式细胞仪净化,改变基因表达的模式(6,7];例如,仅仅脱离常规单层的亚文化迅速改变notch1的表达,它起着举足轻重的作用在决定SC行为(7]。
所有的这些原因,文化系统的开发,使不可逆静止细胞肌原性的研究是非常吸引人的4,5]。
三维(3 d)文化的肌原性的细胞已经被用来增加SC从主要的文化。孤立的细胞被播种在不依从菜肴时,自发地形成浮动myospheres。这种文化在增长factor-rich合成媒体诱导的扩张staminality卫星干细胞和保存。公布数据的比较表明,不同组合的细胞造成不同的隔离程序和不同培养基产生myospheres含有干细胞具有不同特点的增殖,标记表达式,和分化能力(8- - - - - -15]。
myospheres的一个重要的优势是,他们保留细胞相互作用,它允许notch通路参与卫星细胞生物学研究在体外。在骨骼肌,缺口是一个关键的监管机构从事胚胎肌发生在成肌细胞增殖16]。出生,它位于肌原性的祖细胞在基板下的SC室肌肉纤维(17),而在成人肌肉,它维护的可逆SC的静止状态18,19]。减少了notch通路的活动决定了古老的动物肌肉的再生能力降低(20.,21]。Notch信号细胞被激活时显示一个等级配体(jagged1-2 dll1-3-4)在其膜结合邻近细胞暴露一个等级受体(notch1-4)。
他的成员/嘿家族转录因子调节的大部分切口反应形成与MyoD形成灭活这个因素,从而阻断肌原性的分化(22,23]。在SC,不同等级的成员家庭似乎覆盖不同的角色,尽管目前还不清楚他们是如何引出不同的细胞反应同时共享同一通路。例如,notch1期间在更大程度上参与增殖再生(24]在自我更新的SC notch3表达最高19,25,26]。
调查3 d文化是否可用于SC保持静止状态,并最终在骨骼肌再生使用它们,我们采用小鼠C2C12成肌细胞细胞系。
我们发现在myospheres C2C12细胞自发表达下调notch1和维护notch3的表达。基因的表达他/嘿伴随这种模式激活低于单层C2C12细胞的增殖,但它是至关重要的细胞保持静止和未分化。实际上,当notch信号是化学抑制,myospheres退出静止的细胞和分化。这些数据上的他/嘿基因的激活水平myospheres不同于那些获得新鲜的孤立的SC,期间他/嘿表达更高的静止但当细胞增殖下降。隔离的卫星细胞改变的可能性等级活动突出了使用一种文化系统的优势与细胞现成的进行分析。
在一个更大的背景下,我们认为,延性C2C12模型中出现的利基可能阐明如何添加其他细胞,免疫细胞如成纤维细胞和循环,或外源可溶性因素和ECM组件影响干细胞行为的特定方面。
2。结果
2.1。生成和演化的C2C12 Myospheres
鼠标C2C12成肌细胞在nonadhesive播种条件下形成聚集,出现在3 - 4 h。最初,松散的网络细胞连接在一起,随后紧凑在球形myospheres(图1)。
(一)
(b)
在6 h,流仪分析表明,G细胞的百分比1,S, G2/ M的总量仍在单层(图一样2(一个))。在24小时,大约90%的细胞聚集在G0 / G1;超过48小时,比例就会上升到95 - 96%,剩下的稳定之后(数字2(一个)和2 (b))。评价Ki67扩散的表达式(图2 (c),日myospheres)证实缺乏增殖细胞myospheres 48 h后的文化。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
第三和第四天之间的文化,一些细胞开始融合合胞体。部分myospheres苏木精和伊红染色或通过与一个anti-sarcomeric肌凝蛋白免疫荧光抗体显示多核合胞体主要位于外围,通常部分分离(图2 (e)C)。在这个阶段,一个光环,保留分离合胞体和退化细胞出现在myospheres(图2 (e)D),光环可以很容易地移除移液或短DNase治疗,但形式再次在不到24小时,因为合胞体继续离开myospheres伴有单核细胞凋亡形式的身体和释放DNA一旦分离培养基(补充图。1)。
之间的光环自发消失18th和25th天的文化。myospheres的表面变得光滑,清洁虽然组织学部分偶尔会显示剩余的合胞体的存在,不分离(成熟myospheres,图1,22个d)。
成熟myospheres有一个直径为80 - 200μm和由静止细胞和细胞外基质,如图所示,层粘连蛋白的存在已经可以检测到免疫荧光72 - 96 h后播种和积累(图2 (f))。成熟myospheres保存在文化直到60天不显示任何进一步发展除了更高的抵抗蛋白酶的分离,这是明显的在到三十五天,使它更加难以分离的细胞。当终止分化,细胞的数量myospheres是封闭的 的最初播种,评估后25 - 33天myospheres胰蛋白酶化和细胞计数( )。除了驱逐合胞体,至少有两个其他原因占细胞(图的损失2 (e))。第一,在myospheres的起源,一小部分的细胞并不总在中由于细胞凋亡而死(女性)。第二是当合胞体离开myospheres,他们经常诱导单核细胞附近的拆卸,也退化(图2 (e)B和C;myospheres标记(iv))。myospheres中细胞免于凋亡死亡,TUNEL分析执行结果为代表的前4天文化(没有显示)。
这些数据表明,C2C12细胞聚集在不依从培养条件和其中一些分化,形成多核失去的多核体。
2.2。对C2C12 Myospheres
调查的分化率,我们评估肌凝蛋白的表达的免疫印迹在成熟阶段myospheres(图3(一个))。肌凝蛋白表达在3开始理查德·道金斯9天的山峰th-10年th天的文化。此后,它逐渐减少直至其探测不到18 - 20天与合胞体的损失。如果这些成熟myospheres分离和细胞单层镀,然后他们增殖并融合,但程度比原来的C2C12细胞(数字3 (b)和3 (c))。事实上,融合指数 在最初的C2C12细胞 在成肌细胞来源于成熟myospheres ( )。假设两个镀后细胞增殖以同样的速度,这表明C2C12细胞保存其分化能力的比值(干细胞)和那些不能区分范围从1:1的3 d文化1:在成熟myospheres 5 - 1: 9。
(一)
(b)
(c)
从成熟细胞分离myospheres小于增殖细胞培养在一个单层(图4(一)),这是符合证据表明,静SC体内几乎没有在细胞质和细胞器nucleus-cytoplasmic很大比例如果与活化和增殖细胞(27,28]。评估假设他们静止SC细胞可能代表一个模型,我们评估不同标记的SC的表达。特别是,我们估计Sca1,因为它表达的表达在增殖细胞肌原性的而不是静止的细胞(29日]。图4 (b)比较myospheres Sca1在C2C12细胞的表达与单层C2C12细胞的流式细胞术。与之前的结果相一致(29日),C2C12细胞myospheres Sca1 1.3%+而C2C12细胞增殖在单层Sca1 30%+积极的。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Pax7是一个关键的标志广泛用于识别SC在骨骼肌30.),尽管这一事实表达继续在成肌细胞开始扩散限制的价值评估静止的这个因素。图4 (c)表明Pax7表达在C2C12细胞单层和myospheres在两个不同的年龄段,从而表明细胞myosphere保留SC的特点。
CD34是各种祖细胞的表面标记。据报道,CD34表达的完整成绩单静止SC细胞和截形的形式表达在增殖SC (31日]。在myospheres,我们只找到CD34的长篇形式mRNA表达在静止SC在活的有机体内,而增殖C2C12细胞显示截断和CD34 mRNA(图的完整形式4 (c)),它会导致成熟的蛋白质形成(图4 (d))。
Caveolin-1卫星细胞中表达在活的有机体内并激活卫星细胞中表达下调(32]。世行在myospheres caveolin-1表达分析表明,它是调节在成熟myospheres包含静止细胞(图4 (e))。
图4 (f)显示的表达MyoD、myogenin和肌凝蛋白,揭示存在的激活细胞(MyoD),细胞致力于肌细胞生成(myogenin)和分化细胞(肌凝蛋白)。
总之,成熟的生成myospheres需要大约20天,届时三分之一的C2C12细胞最初镀保留其干细胞特性。这些细胞表达SC标记,是静止的,保留其分化能力。
2.3。缺氧是Myospheres没有参与细胞的静止
三维文化通常用作固体肿瘤微环境和血管生成的模型也由于缺氧的状态窝藏在他们内部层。低氧环境支持各种干细胞的静止和前驱细胞类型,如图所示在死后肌肉干细胞的可行性[33]。此外,它已被证明,hif-1α和切口胞内域研究所协调激活切口目标基因的表达,抑制肌原性的肌原性的因素的表达细胞和维持干细胞状态(34]。
根据这些数据和观察,在myospheres合胞体定位主要是在更多的外部层(含氧35),我们假设hif-1的角色α在维持细胞静止中心细胞的成熟的总量。hif-1α被发现在myospheres 8天的文化,当区分细胞存在但没有在后来的成熟的聚集(图4 (f))。
这个结果是符合报告小野et al .,谁发现肌原性的细胞表达hif-1α在分化在常氧条件下,低氧诱导因子1α中扮演着重要的角色,它的沉默抑制C2C12细胞的分化(36]。
这个结果表明hif-1的表达α在myospheres与肌原性的分化和缺氧和静止。
2.4。Notch信号是活跃在Myospheres,需要维持细胞的静止
切口活动中起着重要的作用控制的静止SC (18,19]。图5显示了一个rt - pcr myospheres相关因素的notch通路时可在不同的成熟阶段和增殖C2C12细胞。这表明细胞在myospheres显示所需的所有因素手术切口途径。事实上,在3 d文化环境适合推广和信息联系,切口的coexpression配体,dll1 jag1,受体,notch1和notch3,确保了notch通路可以被激活。常数的Rbpj中介担保胞内信号,开关的起诉他/嘿下游基因,进而抑制表达和分化的细胞肌原性的因素22,23]。
根据他们的表达水平,myospheres notch通路的因素可以分为两组。在第一个,其中包括notch3、hey1 hes1, hes6,和Rbpj以及活化剂dll1 jag1,转录水平仍然是大约在文化的时间常数。第二组,包括notch1、hey2 heyL, Nrarp,显示了一个表达下调表达分化终止时达到最小。
探讨细胞隔离是否会影响切口基因的表达在SC (6,7),我们检查他们的表达水平前后酶myospheres离解的成熟。
图6表明notch1离解和伴随notch3后表达的简历。
因为成熟myospheres只能表达notch3和显示低水平的激活,我们问自己是否这种级别的他/嘿基因表达控制细胞的静止状态。
为了这个目的,我们使用了γ分泌酶抑制剂榫眼,抑制了notch信号通过阻断生成镍镉切口假字。在初步实验,我们对待成熟myospheres 5天,5人μM榫眼和评估hes1和heyL rt - pcr的表达水平。与控制DMSO-treated总量相比,榫眼hes1和heyL的表达下降,分别为75%和79%(图7)。
(一)
(b)
成熟的细胞myospheres榫眼退出静止并区分对待。事实上,包埋免疫荧光与MF20 anti-myosin抗体榫眼和控制DMSO-treated成熟myospheres证明了新一代的合胞体恢复后抑制信号,(图7(一)),共焦显微镜也露出细长的肌管的存在。
3所示。讨论
我们的工作发表在其他的研究中,使用补充myosphere文化保持在一个化学定义媒体的生长因子。myospheres促进肌原性的干细胞的增殖,保护其分化潜力(8- - - - - -15]。
一起收集的数据在这些研究中,我们发现表明myospheres生长在一个中等10% FCS包含可逆静止状态中细胞的形态细胞的代谢活动降低,表明,干细胞可以指向扩散或可逆的静止,同时保留其staminality仅仅通过操纵的生长因子分量。此外,这凸显了延性的利基,出现在3 d的文化。这种观察可能进一步利用实验研究了添加不同的细胞类型,矩阵的组件,或可溶性因子的文化影响小以及SC的行为。另一个优势是,高细胞密度允许细胞进行分析,因为他们是完整的利基市场,不需要隔离或浓度过程需要在处理SC体内时,它们分散在肌肉纤维。静止的干细胞对任何附带的损失与利基的交互隔离程序通过改变它们的代谢和基因表达模式37]。静止的细胞内myospheres证明G0 / G1 DNA含量和Ki67的表情。分化细胞成熟过程中丢失myospheres剩下的细胞表达标记广泛用于识别SC体内。单独,这些标记表明静止或细胞的增殖状态,但结合时,他们的表情是平静的象征。
CD34是我们分析的因素在大多数的细节。虽然这个因素不是一个特殊的标记肌原性的细胞在活的有机体内的上下文中,它是有用的C2C12 myospheres因为它是表示仅在静止细胞,激活后迅速消失。特别是,静止和SC激活在活的有机体内产生不同的拼接CD34 mRNA的亚型,即。,全长(fl)和截断(tk) [31日,38,39),复制的模式表达式myospheres C2C12细胞的单层。CD34蛋白的检测,没有文化的开始在7日之前的一天,可能表明细胞达到完全静止的状态只有在这一点上。在这方面,科勒等人报道,成纤维细胞诱导的转录特征最初进入静止不同取决于这个国家是如何引起的,例如有丝分裂原撤军,失去附着力,或接触抑制。成纤维细胞聚集在一个更常见的静止基因表达模式仅仅几天之后(2]。CD34的表达可能标志着myospheres细胞类似的成就。这一事实myospheres C2C12细胞的大小是小于那些增殖的单层指向一种更深的静止状态,在协议规模较小和较低的线粒体和代谢活动中演示了深深地静骨骼肌卫星细胞(G0(细胞)28]。与环境的交流也可能发生影响领域的活动和影响分化。与环境交换物质比单层低效率在myospheres文化,尽管缺乏hif-1α积累至少在我们的细胞表明氧气扩散是正确的(图4)。马凯特等人培养时,在同一介质使用的我们,C2C12聚集在旋转细胞培养系统,这是引起更高的营养质量传递,他们报道更好的增殖分化率没有固定的控制文化相对应的那些我们使用35]。
此外,在与我们的结果一致,马奎特et al。35)发现C2C12成肌细胞在这种文化融合事先没有扩散,最近的行为甚至不显示异常在活的有机体内更频繁地,发现了SC保险丝比此前认为的纤维没有先前的扩散(40]。
Notch信号起着主要作用,指导SC对增殖,分化,或静止,其表达和活性显示高度的敏感操作的利基7]。当聚合完成后,notch1表达式表达下调和肌原性的细胞只表达notch3同种型。如果离解过程激活细胞的表达notch1 notch3很快恢复和伴随。他/嘿表达式在成熟的模式聚合发散的报道在SC,刚从肌肉排序,这似乎表达高水平的他/嘿基因在静止状态时增殖(18,19]。没有notch1 myospheres信号可能解释这种差异。的确,notch3仅被认为是弱他/嘿基因的激活(41),其表达在成熟myospheres因此低于增殖C2C12细胞。的模式表达notch3和notch1 myospheres也符合研究报告中一个角色notch3维持干细胞的体内平衡的保护细胞周期访问(42,43]。
总之,我们的数据表明,肌原性的细胞在三维自组装文化在10% FCS系统形式,保留了静止的staminality细胞。抓住机会来检查这些细胞没有任何以前的操作,我们表明,在此系统中,细胞表达notch3 mRNA表达notch1失败。因此,与以前的结果(18,19),我们表明,缺口下游的活动因素静止C2C12细胞在增殖细胞中低于。
我们相信C2C12 3 d球体文化可能有效地用作模型在干细胞生物学解决尚未解决的问题,比如细胞组成、矩阵组件,或可扩散的因素影响生物活性的利基。值得注意的是,3 d球体C2C12文化可能是一个很好的工具来促进骨骼肌修复等提供细胞受损的组织。
4所示。材料和方法
C2C12细胞之间的4th和20th通道被维护在一个单层的DMEM glutamax (EuroClone,佩罗(MI),意大利)补充10% FCS (EuroClone)和50μg / ml庆大霉素在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C和通道融合在70 - 80%。
生成聚集,细胞融合增长到80 - 85%,分离酶学和播种密度 在90毫米细菌菜肴在同一培养基,用于种植在一个单层的0.3%甲基纤维素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国猫。09967)。在这些条件下,细胞不遵守各种大小的塑料和加入聚合在一起(http://spherogenex.de)[44]。每2 - 3天中被改变。
4.1。细胞计数
3 d文化包含骨料大小不同的板不分散均匀。因此,抽样的整除时出现问题中收集。出于这个原因,为了评估细胞的数量剩余总量分化后,我们计算整个盘子的胰蛋白酶分解后获得的细胞。
4.2。Notch通路的抑制
的γ分泌酶抑制剂榫眼(西格玛奥德里奇)溶解在DMSO和使用浓度的5μm上的药物添加5天4th天的文化(区分骨料)或20th天(成熟的总量)。在后一种情况下,药物添加结束后分化的细胞死亡的光环消失的周围聚集,细胞分化。培养基与榫眼或DMSO每2天更换一次。
4.3。冷冻和石蜡切片制备
骨料与4%多聚甲醛固定为2 h (Sigma-Aldrich),在4°C,用PBS洗净,储存在4°C。冻结部分(7μ骨料的m)后被准备嵌入在10月(组织- - - - - -Tek,樱花Finetek美国)。部分是孵化主要抗体针对Ki67(圣克鲁斯生物技术有限公司、海德堡、德国,SC7846, 1: 100)、层粘连蛋白(σL939, 1: 100), CD34(圣克鲁斯的猫。SC9095, 1: 100)和MF20 anti-sarcomeric肌凝蛋白重链(1:5稀释杂种细胞中)。荧光图像获得使用数字化的蔡司Axioskop 2 +显微镜(卡尔蔡司、从、德国)或Leitz则徕卡显微镜DMRB装有DFC300FX相机(徕卡,位于德国)。苏木精和伊红染色()),固定总量脱水,嵌入在石蜡,切成5μ米的部分。图片是使用Adobe Illustrator或ImageJ组装。
4.4。包埋免疫荧光
总量是固定在寒冷(-20°C) methanol-acetone 1: 1 ( )20分钟,洗PBS。然后他们被孵化,通过摇动MF20 anti-myosin抗体,(从杂种细胞培养基、稀释1:5)在4°C 20 h。清洗骨料与fluorescein-labelled孵化二级抗体在室温下2小时。核沾染了TO-PRO-3(0.2毫克/毫升,分子探针分子探针欧洲,Rijnsburgerweg,荷兰)。样本共焦显微镜观察到与徕卡TCS SP2(徕卡,位于德国)。
4.5。融合指数量化
融合指数测定细胞生长在DM 72 h后达到融合和彩色MF20 anti-myosin抗体。这个指数计算中肌管的细胞核数量的比例使用3种或3种以上的原子核与原子核的总数。
详细,细胞之间的融合指数的比较成熟的总量和原始细胞进行如下:新鲜C2C12细胞增长到70 - 80%融合在6个不同的150毫米菜肴。细胞从这些菜被分离和转移到一个不同的90毫米盘在不依从的条件下生成myospheres,然后留给成熟。失踪三天后的光环,myospheres(不计算)从每个90毫米的菜肴被分离,部分细胞获得镀是在三个35毫米菜(30000个细胞/盘)和比较镀与新鲜控制细胞的分化能力在相同条件下平行五35毫米的菜肴。
4.6。细胞周期分析
细胞来源于胰蛋白酶分解总量的80%乙醇固定在冷,洗,和孵化37°C 3 h PBS中含1% Triton x - 100, 50μg / ml propidium碘和100μg / ml DNase-free核糖核酸酶(Sigma-Aldrich)。流仪结果进行一个史诗XL(美国贝克曼库尔特,富勒顿,CA)使用世博会32软件采集和FCS表达4进行分析。紧身衣是歧视的闸门。
4.7。BrdU标记
细胞通过成熟的骨料的胰蛋白酶化镀的密度 在35毫米菜肴。24小时后,细胞pulse-labelled 10μM BrdU (Sigma-Aldrich)在生长介质4 h。在90 - 100%融合,改变了生长介质 4 - 5天,每天的变化。固定后,细胞被沾anti-BrdU(σB2531)和MF20 anti-myosin抗体。
4.8。晕特征
描述细胞的命运在成熟过程中输了myospheres及其后来的命运,我们检查了材料释放myospheres白天9后2天的文化。Myospheres媒介被转移到管和解决由重力。乏中被移除和离心机在1000 rpm,和包含发布的颗粒细胞和细胞碎片在PBS resuspended没有固定染色后镜检与1μ米赫斯特33342年2.5μg / ml propidium碘和膜联蛋白V, Alexa萤石™488共轭(热费希尔科学A13201),从100 x的解决方案。样本染色冰5分钟和另外10分钟后丢弃,因为propidium碘后不再是具体的死细胞。
4.9。半定量rt - pcr
总RNA提取利用三试剂(σT9424)根据制造商的协议。一个1μg整除的总RNA治疗DNase-I(新英格兰生物学实验室,EuroClone,佩罗(MI),意大利)和反向转录成第一链cDNA使用M-MLV逆转录酶(m - 1705、Promega麦迪逊,WI,美国)和随机六聚物引物(表达载体,热费希尔科学公司,沃尔瑟姆,马美国)。循环参数94°C / 20年代,58 20°C / s, 72°C / 20年代31日周期。PCR产品运行在2%琼脂糖凝胶。使用以下引物PCR进行:caveolin-1 (5 - - - - - -GCACACCAAGGAGATTGACC-3 ;5 - - - - - -GAATGGCAAAGTAAATGCCC-3”), jag1 (5 - - - - - -CCCCCTGAGTCTTCTGCTC-3 ;5 - - - - - -GTGACGCGGGACTGATACTC-3 ,M-Cad (5 - - - - - -ATGATGGCTCTGTACCAGC-3 ;5 - - - - - -AAGACTACGACCCAGAAGAC-3 ),c-Met (5 - - - - - -TCCTGACATCCATCTCCACC-3 ;5 - - - - - -GCATGAAGCGACCTTCTGAC-3 ),Pax7 (5 - - - - - -CCGTGTTTCTCATGGTTGTG-3 ;5 - - - - - -GAGCACTCGGCTAATCGAAC-3 ),MyoD (5 - - - - - -AGCACTACAGTGGCG ACTCA-3 ;5 - - - - - -GCTCCACTATGCTGGACAGG-3 ),肌凝蛋白(5 - - - - - -ACAAGCTGCGGGTGAAGAGC-3 ;5 - - - - - -CAGGACAGTGACA AAGAACG-3 ),myogenin (5 - - - - - -CTACAGGCCTTGCTCAGCTC-3 ;5 - - - - - -AGATTGTGGGCGTCTGTAGG-3 ),原癌基因(5 - - - - - -CGGACACACAACGTCTTGGAA-3 ;5 - - - - - -AGGATGTAGGCGGTGGCTTTT-3 ),c-Jun (5 - - - - - -CTGCATGGACCTAACATTCG-3 ;5 - - - - - -GCTTTCACCCTAGTATATTGGG-3 ),c-Fos (5 - - - - - -TGTTGTTCCTAGTGACACC-3 ;5 - - - - - -ACATTCAGACCACCTCG-3 ),notch1 (5 - - - - - -TGCC TGTGCACACCATTCTGC-3 ;5 - - - - - -CAATCAGAGATGTTGGAATGC-3 ),notch3 (5 - - - - - -TGCCAGAGTTCAGTGGTGG-3 ;5 - - - - - -CACAGGCAAATCGGCCATC-3 ),dll1 (5 - - - - - -CCCTGGCAGACAGATTGG-3 ;5 - - - - - -ACAGAGGGGAGAAGATGTGC-3 ),hes1 (5 - - - - - -GCCAATTTGCCTTTCTCATC-3 ;5 - - - - - -GAGAGGTGGGCTAGGGACTT-3 ),hes6 (5 - - - - - -CCCTAGAGCTCTGGATGGTG-3 ;5 - - - - - -GCGCAACTGTGTTACAAACG-3 ),hey1 (5 - - - - - -柠檬酸GCGTGGGGAATCTTAAC-3 ;5 - - - - - -GATTCAGGGCACAGACACCT-3 ),hey2 (5 - - - - - -TGGAAAAGGAAACGCCAT a - 3 ;5 - - - - - -ATCTGCAGCCTGACACATTG-3 ),heyL (5 - - - - - -GCGATTGAAGTCCCCAG ATA-3 ;5 - - - - - -ACTGGGGTCACCAGACTG AG-3 ),Rbpj (5 - - - - - -GGTCCCAGACATTTCTGCAT-3 ;5 - - - - - -GGAGTTGGCTCTGAGAATCG-3 ),GAPDH (5 - - - - - -TCCTGACATCCATCTCCACC-3 ;5 - - - - - -GCATGAAGCGACCTTCTGAC-3 )。引物用来区分全身和截短形式的CD34成绩单是5 - - - - - -AGCACAGAACTTCCCAGCAA-3外显子5/6和5 - - - - - -CCTCCACCATTCTCCGTGTA-3外显子8(波et al ., 2000),放大,分别一个片段260和416个基点,为截短形式包括一个额外的外显子和一个终止密码子,逮捕翻译。
4.10。免疫印迹分析
细胞细胞溶解在冰冷的声波降解法里帕缓冲区(20毫米Tris-HCl包含150毫米氯化钠的pH值7.6,2毫米EDTA, NP40 1%, 0.5% Na-deoxycholate)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich P2714)。等量的蛋白质被解决在8 - 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶。后转移到PVDF膜(Amersham通用电气医疗,白金汉郡,英国),感兴趣的蛋白质被发现通过使用anti-CD34 (sc - 9095圣克鲁斯,1:500),anti-myosin (MF20 1: 50), anti-MyoD (sc - 377460圣克鲁斯,1:1000),anti-myogenin (sc - 12732圣克鲁斯,1:300),anti-hif-1α贝鲁斯科尼(nb100 - 105罗福斯生物制剂,意大利,1:1000),和anti-caveolin-1 (ab17052 Abcam,剑桥,英国1:1000)抗体和抗-α微管蛋白(T5168σ1:2000)或anti-GAPDH(圣克鲁斯,sc - 25778, 1: 1000)抗体作为标准化控制。
4.11。统计分析
提出了定量数据至少有三个独立的实验 。通过Graphpad棱镜执行统计分析软件(La Jolla、钙、美国)使用成对的学生的 - - - - - -测试来确定意义( ; ; ; )。
数据可用性
所有数据用于支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者声明没有竞争或经济利益。
作者的贡献
S.A.的研究计划,执行实验,分析数据,并写了手稿。C.P.和南达科他州。进行实验和分析数据。L.DA。,M.P., and F.N. critically revised the manuscript. All the authors read and approved the final manuscript.
确认
我们感谢a D 'Alessio和a . Filippini hif-1αcaveolin-1抗体和s . De Grossi f . Padula共焦显微镜和cytofluorometric分析。这项工作是由Sapienza大学通过授予FN“Ateneo 2016”。
补充材料
补充图1:《创世纪》的光环。细胞释放之间的myospheres第七和第九天的文化。一旦细胞是孤立的在中,它们进入细胞凋亡。图所示的示例包含细胞在凋亡的所有阶段由于新细胞是不断从myospheres释放。发布的新的细胞加入以前和他们的碎片,被困在了DNA也引发对微球。事实上,这些聚合物由DNase治疗迅速溶解。(一)相衬显微镜的图像;(b)赫斯特33342染色标记所有核;(c) propidium碘染色,标签死细胞核;(d)膜联蛋白V染色。 Annexin V binds to phosphatidylserine residues translocated to the external face of the plasma membrane. This is an early event in apoptosis. Bar = 50 μm。(补充材料)