战略工程骨结构的生成基于脐带间充质基质细胞扩大与人类血小板溶解产物

文摘

脐带间充质基质细胞(UC-MSC)是很有前途的候选人为细胞疗法由于其强大的multilineage分化,增强自我更新能力,为临床使用和即时可用性。临床经验表明满意的生物安全概要文件和UC-MSC应用同种异体设置的可行性。然而,使用UC-MSC骨再生尚未完全建立。代的一个重大挑战成功的治疗策略对骨骼工程位于高度的结合功能矩阵proosteogenic MSC种群和生物活性支架。地址,在这项研究中,我们提出了一种新的方法生成的骨突构造基于UC-MSC扩大人类血小板溶解产物(hPL)和评估其潜在诱导骨结构在活的有机体内。为了获得UC-MSC潜在的临床应用,我们首先评估参数,比如隔离方法,增长补充,微生物监测、低温贮藏和执行的完整描述产品包括表型细胞,生长性能、tree-lineage分化和基因表达。最后,我们评估骨突构造基于UC-MSC和胶原微磁刺激的结合在活的有机体内骨形成。UC-MSC是从100%的加州大学捐赠处理,成功地培养和有效的细胞来源是观察到的一天 外植体的方法。UC-MSC维护间充质细胞形态、表型、细胞生长性能高,对多功能分化能力。捐助者记录之间没有显著的变化。正如所料,UC-MSC显示tree-lineage分化和基因表达谱类似于骨髓和脂肪MSC。重要的是,在成骨和内皮感应,UC-MSC显示强劲proangiogenic和骨形成功能。hPL-expanded MSC和胶原蛋白的结合微导致骨/船形成后移植到免疫能力的小鼠模型。集体,我们开发了一种高性能UC-MSC-based细胞制造生物处理,满足人类的要求应用程序和触发器的效力和有效性cell-engineered为骨再生支架。

1。介绍

细胞疗法的策略基于使用间充质基质细胞(MSC)已成为再生医学的不断扩张的工具。增加临床证据积累在过去的几年中已经证明可行性MSC-based疗法的生物安全的应用程序和治疗潜在的与自身免疫相关疾病,慢性炎症,osteoarticular再生(1- - - - - -3]。随着增加的临床前和临床研究的数据,有一个关于建立共识的标准来确定MSC以及细胞制造的标准化程序,提高再现性的细胞产品和全球临床研究之间的可比性(4- - - - - -7]。的一个主要方面,不仅有影响治疗效果,而且在人类的生产过程MSC治疗细胞obtention替代资源的使用,提高产品的可用性和可行性等因素扩大供临床使用。MSC的一个有吸引力的来源是脐带(加州大学),一个副产品通常怀孕分娩后丢弃。基于临床前和临床证据,UC-derived MSC具有类似生物和治疗等属性相比,经典的细胞来源骨髓(BM)或脂肪组织(广告)8- - - - - -12]。UC-MSC显示改进的祖细胞能力和港口强烈分化潜力向间充质血统以类似的方式与其他细胞来源(13- - - - - -15]。尽管治疗潜力和生物机制UC-MSC组织再生和修复在活的有机体内仍不清楚,UC-MSC作为一种治疗工具的引入了新场馆的临床使用同种异体设置,考虑,使用MSC对临床应用主要局限于自体设置(4,16]。因此,建立clinical-grade UC-MSC银行已成为有前途的优势直接可用性MSC-based疗法的脐带组织生产,尤其是在已经建立了公共脐带血银行设施。只要同种异体使用MSC被证明是有效和安全的,clinical-grade UC-MSC银行提供无限制地细胞再生疗法治疗。

MSC显示巨大的潜力在骨修复和愈合实验和临床设置(16]。在合适的培养条件下,MSC可以分化成成骨的血统在单层培养或结合三维(3 d)支架。大量的证据表明,BM和AD-MSC是主要的细胞来源能够诱导骨形成和引发骨再生(17- - - - - -19]。尽管实验数据显示骨折愈合和功能恢复的几种损伤模型由自体成人BM或AD-MSC,使用MSC工程骨结构从这些来源仍然缺乏完整的骨再生,部分原因在于低数量的可行和功能性MSC用于组织工程植入物的生成,最终影响他们的再生潜力在活的有机体内(20.,21]。这可能也解释了,因为年龄和潜在的病理条件下细胞捐赠者有强烈影响干细胞产品源自成人组织。MSC操纵和扩张在现行良好生产规范(GMP)协议可能会导致对提交的骨祖细胞增殖和分化能力降低,(22]。出于这个原因,虽然骨再生的潜力尚未得到充分的证明,UC-MSC代表另一个源引发骨再生时显示骨分化特性在体外和在活的有机体内(10,13]。鉴于UC-MSC的优势改进的扩散和多功能血统能力而言,这是一个更好的在活的有机体内性能和增强骨分化。此外,UC-MSC显示强大的免疫调节和proangiogenic属性也让他们优秀的候选人在同种异体组织工程设置。重要的是,GMP生产UC-MSC尚未证明减少临床应用[多分化潜能和生物23,24]。重要的是,不同的材料也被用于开发应用于骨再生的支架等生物活性陶瓷,生物活性玻璃,和生物(胶原蛋白和透明质酸)或合成(聚乳酸、聚乙醇酸、聚已酸内酯)聚合物。这些材料的组合与UC-MSC旨在引发成骨分化之前报道了胶原蛋白I /胶原III (25),明胶/生物活性玻璃(26),nanohydroxyapatite /壳聚糖/明胶(27),和胶原蛋白/磷酸钙支架(28]。总的来说,这些研究表明显著proosteogenic UC-MSC活动时包含在这些结构,提出可行性的骨突组织建设与潜在应用骨再生。然而,全面理解化学,生物材料的大小和形状以及它们如何驱动UC-MSC分化过程仍然是一个挑战。

在这项研究中,我们开发了一个新方法简单,均匀,高度可再生的隔离和扩张UC-MSC细胞与细胞产量增加人口。治疗产品的开发项目为基于UC-MSC骨再生。有趣的是,我们评估的能力UC-MSC分化成骨头在体外和在活的有机体内通过使用3 d结构,指出组织工程支架作为细胞有效工具交付针对骨再生。

2。材料和方法

2.1。脐带MSC隔离和主要文化的建立

加州大学收集筛选后的孕妇在医院交付。知情同意是由伦理委员会审查和批准Secretaria Distrital de Salud de波哥大,这是由健康的捐赠者之前收集签名。排除标准为绳捐助者包括社会人口变量如年龄、怀孕、营养状态和药物依赖以及历史有先天性畸形,先天代谢或免疫缺陷,病毒(水痘,乳头状瘤病毒,艾滋病毒等),细菌,在怀孕期间或寄生虫感染,惊厥,多个怀孕。一旦脊髓组织来到中心,脐带血了艾滋病毒检测,丙肝病毒,HVB,恰加斯病、梅毒积极性。此外,脊髓组织受到检查,以验证胎粪,脐带直径小于1厘米,超过血脐静脉和动脉,或线15厘米以下。承认加州大学获得从阴道和剖腹产分娩的足月新生儿( )分段(10厘米长度)并立即转移到无菌容器含有磷酸盐处理设施(PBS) (Gibco,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)补充1%的青霉素和链霉素(P / S) 10000 U / 10000毫克/毫升(Gibco,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)。为了最小化造血细胞污染细胞来源,我们几个洗涤步骤执行无菌PBS直到流经洗后明显清晰。加州大学处理三种方法比较:外植体处理(外植体),加州大学酶消化(Col-tissue),和沃顿商学院的果冻(WJ)酶消化(Col-WJ)。对于外植体处理,沃顿商学院的果冻(WJ)与加州大学组织分离,转移到10厘米²文化板块在DMEM补充10%人类血小板溶解产物(hPL) + 1%抗生素和37°C和5%孵化有限公司₂。培养媒体每三天更换一次,直到confluency细胞达到70%到80%。加州大学酶消化,3厘米的部分被切成小块,加入到一个解决方案包含0.075%胶原酶(SigmaAldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和孵化60分钟37°C在不断地搅拌。细胞悬液是通过100年μm网格单元过滤器,resuspended hPL-supplemented DMEM,和播种6-well盘子。不依从细胞被移除后6小时的文化。Col-WJ,果冻被我从加州大学和在0.075%胶原酶消化(SigmaAldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)解决方案60分钟37°C在不断地搅拌。细胞受到100年分离μ米网和resuspended DMEM补充hPL 10%和1% P / S。细胞被播种在6-well直到confluency盘子和维护。

2.2。微生物分析

评估的存在微生物污染在加州大学的收集和处理阶段,微生物分析在PBS溶液进行片段被运到加工设施,清洗解决方案(PBS 1 x, 1% P / S),脐带碎片和培养基在通道0 (P0) 22捐助者。检查样品和液体存在的微生物进行了使用血培养瓶和thioglycolate肉汤。Thioglycolate肉汤孕育了一段72小时35°C和5%的公司₂;血培养瓶在标准大气孵化35°C七天对有氧和厌氧细菌使用微生物检测系统BACT /警报®3 d (bioMerieux)。积极的样品与革兰氏染色和亚文化在血琼脂和MacConkey孵化72小时在35/36°C和5%的公司₂;孤立的微生物被确定使用VITEK®2系统(bioMerieux)。

2.3。提取和功能特征的人类血小板溶解产物(hPL)

hPL得到机构血液银行从健康献血者血小板(B +, + O +和O -)。简而言之,整除45毫升(3捐助者)被冻结在−80°C和接受两个冻结和解冻周期诱导血小板裂解。血小板溶解产物然后在4000 g离心10分钟,0.2和上层清液过滤μ米,整除,储存在−80°C到使用。hPL从三个捐助者汇集并加入DMEM浓度的10%用于MSC文化。重组人肝素添加在最后16个国际单位/毫升的浓度。为了测试hPL批次UC-MSC支持经济增长的能力,细胞从六个捐助者保持文化7段落的DMEM补充hPL为10%。中补充与胎牛血清(的边后卫,10%)被用作控制。人口翻番水平(PDL)为每个通道使用公式计算 ,倪在哪里接种体数量和NH细胞收获的数量。人口翻倍增加也计算通过添加PDL水平每通道为了获得累积人口翻倍(CPD)。此外,人口倍增时间也计算每通道,并表示小时翻倍。细胞因子和生长因子的内容从不同hPL制剂是由细胞因子定量数组使用商业Luminex人类细胞因子30-plex化验(表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国),制造商的指示。

2.4。Postcryopreservation可行性评估、细胞复苏和长期的扩张

UC-MSC收获和resuspended最终的浓度 细胞/毫升。细胞转移到1000年μL预冷介质,包含DMEM和10%二甲亚砜(DMSO)补充与hPL的30% ( )或30%的边后卫( )。为每个组,细胞冻存通过使用CryoMed可控速度下冰箱冷冻的速度每分钟1°C或放置cryovials预冷异丙醇架(冷淡的先生,耐尔根®)并将它们传递给−80°C的冷藏24小时前最后的液态氮蒸汽存储。细胞样本存储一个月直到解冻。和恢复可行性评估,UC-MSC解冻,洗净。可行的和死细胞数与纽鲍尔室与锥虫蓝染色后(0.4%,生命技术)。细胞进一步播种在25厘米²组织培养瓶(美国康宁公司)的密度 细胞/厘米²播种,直到confluency为了获得自由人民党,CPD, PDT postthawing值。长期扩张,四个MSC捐助者被保存在文化长达23连续的段落和PDL、CPD,累积细胞人数确定。

2.5。Immunophenotyping UC-MSC的

MSC-related细胞表面抗原的表达被评估使用膜标记流式细胞术CD90 (APC), CD73 (PECy7)、CD105 (PE)、CD45 (APC / Cy7) CD34 (PerCP-Cy5.5) HLA-DR(太平洋蓝色),和HLA-ABC (FITC)。细胞培养30分钟在4°C,离心机在300 g 6分钟,resuspended在0.2毫升PBS。在接受了手术治疗FACSCanto II流式细胞分析仪(美国圣何塞Becton Dickinson)和数据分析与FlowJo vX.7.0数据分析软件包(美国Treestar)。

2.6。分化UC-MSC

UC-MSC multilineage潜在能力的检查使用成骨细胞分化,诱导chondrogenic,去媒体。人类脂肪细胞和骨骨髓来源MSC被何塞。博士请捐赠细胞疗法单位,研究所Venezolano de Investigaciones Cientificas,委内瑞拉,也包括作为脂肪形成的积极控制,成骨,chondrogenic分化。脂肪形成的差异化在24-well板块进行播种 细胞每confluency直到60%,进一步酝酿脂肪形成的诱导培养基(StemPro脂肪形成分化装备,生活技术)为21天。细胞被固定在4%多聚甲醛(SigmaAldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和沾油红O (SigmaAldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。成骨分化,细胞被播种如上所述,成骨分化培养基(StemPro成骨分化工具包,生活技术)。钙沉积被茜素红s证明(SigmaAldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)染色。根据颗粒形成Chondrogenic分化进行评估; 在500 g细胞离心5分钟在10°C和resuspended chondrogenic分化培养基(StemPro软骨形成分化装备,生活技术)。球团矿在37°C和5%孵化有限公司₂21天。21天之后,颗粒与PBS洗3次,在4%多聚甲醛溶液固定24小时,嵌在石蜡中。Four-micron部分(4μ米)准备和沾马森三色的评价胶原蛋白的存在(蓝色)和软骨样细胞。

2.7。定量rt - pcr

总分化和未分化的加州大学、BM和AD-MSC RNA被PureLink孤立RNA迷你包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)根据制造商的协议。RNA浓度和质量评估在NanoDrop - 1000仪器(热科学NanoDrop™2000/2000c)。互补DNA是由反转录的总RNA上标™IV第一链cDNA合成反应(表达载体、圣地亚哥、钙、美国),其次是存在在7500年快速实时PCR系统(美国加州应用生物系统公司)使用TaqMan基因表达分析(应用生物系统公司,加州,美国)。分析基因包括特异性标记基因,SPP1(磷蛋白质分泌Hs00959010_m1)和BGLAP(骨钙素,Hs01587814-g1) adipose-specific FABP4基因(Hs01086177_m1)和PPARG (Hs01115513_m1) cartilage-specific基因,COMP(软骨寡聚基质蛋白,Hs00164359_m1)和作用(fibromodulin Hs00157619_m1),和管家基因产生HPRT (Hs02800695_m1)和β肌动蛋白(Hs01060665_g1)。每个基因PCR效率是决定基于使用公式的校准曲线 。使用2 -随后相对表达式计算^ΔΔCT方法。

2.8。代的骨支架

UC-MSC被播种和条件分化成骨的或内皮细胞系T25培养瓶。UC-MSC与成骨的孵化(StemPro成骨分化工具包,生活技术)或内皮感应媒体(生活中200,技术)为72小时。成骨的然后endothelial-induced细胞收获,结合在一个3:1比例(75000成骨和25000年内皮),和resuspended包含100年1毫升的培养基μL (atelocollagen微(Koken有限公司),从而生成结构。Cell-collagen构造在37°C和5%孵化有限公司₂为24小时。接下来,培养基被和构造和50μL人富含血小板血浆(PRP)和10μL 25%的CaCl₂与凝血酶(比1:1)直到观察血栓形成。构造与DMEM培养补充10% hPL也准备控制。结构是直接植入进行测试在活的有机体内骨形成或随后培养评估骨分化在体外通过刺激成骨的额外的14天。构造终于在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入,通过常规组织学和免疫组织化学分析。

2.9。骨形成在活的有机体内

Cell-collagen构造是女性C57BL / 6小鼠皮下植入6周。简单地说,老鼠( )腹腔内注射麻醉的0.1毫升/公斤甲苯噻嗪和0.12毫升/公斤克他命,和细胞结构被放置在背侧皮下无菌区。老鼠用标准食物饮食和水保持随意。12周后植入,老鼠牺牲颈椎脱位紧随其后的是提取的细胞结构。结构进一步固定在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡组织学分析。

2.10。组织学分析

石蜡块从在活的有机体内和在体外构造分段(4μ米)和苏木精和伊红染色())和马森三色的胶原蛋白(蓝色)。骨生成评估了茜素红s (SigmaAldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)染色。免疫组织化学分析,部分被封锁在室温下1小时(RT)与5% BSA和5%的边后卫在PBS 1 x然后孵化主要抗体坳(SC25974圣28克鲁兹),一夜之间在4°C。第二天,洗了三次样品与PBS和孵化与二次抗体结合合(研发系统、MN、加拿大)在RT为1小时,最后用PBS和安装显微镜评估。

2.11。统计分析

为了确定统计意义,我们使用的学生 - - - - - -测试和参数数据的方差分析和非参数的克鲁斯卡尔-沃利斯检验数据。被认为是在水平的意义值低于0.05。统计分析进行了使用GraphPad Prism 6.0版本的软件(La Jolla、钙、美国)。

3所示。结果

3.1。隔离、文化和Immunophenotype脐Cord-Derived MSC

几种方法描述了MSC的隔离。这里,我们比较三种方法:collagenase-based酶消化整个脐带组织(Col-tissue),沃顿商学院的果冻矩阵隔离和胶原酶消化(Col-WJ)和WJ矩阵外植体(外植体)共有35绳捐助者。我们评估效率、纯洁和细胞生长性能。评估三种隔离方法的效率时,我们发现高细胞来源的MSC外植体( )和Col-WJ ( ),相比Col-tissue特级(83.3%, )(图1(一))。我们观察到细胞早期萌芽和粘附塑料在Col-tissue-isolated MSC ,相比之下,推导时间外植体和Col-WJ ( )(图1 (b))。然而,文化通过Col-tissue方法显示异质细胞群,一个人口和其它小圆人口呈形态。相比之下,文化从Col-WJ和外植体分离显示特征呈MSC表型和缺乏其他细胞类型的文化启蒙(数据没有显示)。细胞主要来源于文化(0)通过进一步扩大,和人口翻番水平(PDL)计算所有细胞培养通道6。我们观察到3和4之间一致的PDL值在所有文化中,无论最初使用的隔离协议(图1 (c))。值得注意的是,MSC孤立的外植体显示一致,均匀PDL水平相比其他方法细胞隔离。为了描述MSC,我们评估MSC的表达身份标记流式细胞术在通道1。CD105的表达百分比,CD90 CD73, MHC类我达到99%(图1 (d));细胞也显示消极的表达(少于5%)CD34造血谱系标记,HLA-DR和CD45。接下来,我们相比平均荧光强度(MFI)为每一个标记细胞由Col-tissue孤立,Col-WJ,外植体协议。外植体MSC显示更高CD73和CD105的表达而Col-WJ和Col-tissue(图1 (d))表明一个更强的保护MSC外植体隔离后表型。重要的是,外植体方法显示显著增强CD73的表达,表明更高浓缩的祖细胞内孤立的MSC的人群。在一起,这些结果对外植体方法丰富种群窝藏增强MSC表型在早期孤立的MSC。

3.2。微生物监测脊髓组织和UC-MSC派生而来

由于微生物污染是一个关键因素质量合规和批处理细胞医药产品的发布,我们想屏幕微生物污染通过监测组织收集和细胞的早期阶段处理。UCs收集的样本中我们首先测试污染剖腹产和阴道分娩在不同时间点在整个处理链包括运输从医院到细胞处理设施。为此,我们监控的组织样本,清洗解决方案,并在P0培养基。样品被播种到有氧和厌氧血培养瓶和thioglycolate肉汤进一步微生物评估。

阴道、粪便和皮肤微生物群微生物中发现100%的阴道分娩的样品运输解决方案( ,图2(一个))。相比之下,只有30%的样本来自剖腹产( )发现积极的。正如所料,几个抗生素溶液洗涤步骤,微生物污染的总体水平,特别是清洗解决方案和组织从阴道分娩和剖腹产可大大降低样本。考虑前面的结果,我们从积极的样本和特征微生物孤立的存在大肠杆菌和葡萄球菌sp.菌株在大多数的筛选(图绳索2 (b))。几乎所有的细菌隔离造成微生物评价敏感了宽光谱抗生素如头孢菌素、庆大霉素、万古霉素(表1)。因此,加州大学获得较高的微生物污染的阴道分娩的风险大大增加进一步被污染的细胞培养。然而,适当的操作和最终使用预防性抗生素鸡尾酒,如第一代和第二代头孢菌素(先锋霉素、头孢西丁)、庆大霉素、妥布霉素、万古霉素或传输媒体将防止污染,尤其是在那些绳索从阴道分娩。

3.3。扩大UC-MSC Xeno-Free增长媒体支持

在生产过程中需要解决的一个基本方面的细胞产品是使用生长因子补充满足人类使用的标准。我们标准化生产人类血小板溶解产物(hPL)源自血小板细胞培养的袋子。为了评估批hPL之间的可比性,我们汇集了三个血小板包/血型(A + B +, O - O +)并对其进行了冻融循环、过滤和存储为进一步在MSC文化中作为补充。评价供者变化对细胞生长的影响,MSC ( 捐助者)被播种在文化媒体通道3包含不同的hPL池的10%。我们使用10%的边后卫的控制。人群中没有发现显著差异水平翻倍(PDL),人口倍增时间(PDT),人口翻倍(CPD)值和累积培养的MSC hPL从A +, B +, O -和O +组(图3(一个))。此外,我们发现在评估通道稳定细胞生长动力学,3.2的平均自由人民党。相反,细胞培养FBS-supplemented媒体表现出显著降低PDL的价值观。最后,更高和更稳定的细胞增殖率的MSC暴露hPL-supplemented培养基导致更高的CPD值相比,MSC在媒体的边后卫培养( )。为了评估hPL中包含的一些生长因子的存在,我们生长因子相比,炎性细胞因子,趋化因子,Th1 / Th2 Th17细胞因子浓度在不同的批次和血型。我们观察到类似的浓度在大多数细胞因子,趋化因子和生长因子评估hPL批次来自A +, O -和O +捐助者。只有IL-15 IL-7,咆哮显示显著的变化在血型和hPL池( ,图3 (b))。总的来说,hPL池准备从不同血型显示均匀生长因子和细胞因子的含量,并演示了MSC的可行性支持扩张。

3.4。MSC低温贮藏效果的可行性、复苏和增长的性能

鉴于脊髓组织的轻松访问和可用性在我们的公共脐带血库和可能性立即提供细胞疗法的产品从第三方临床应用同种异体的捐助者,我们试图坚固孤立UC-MSC的同种异体主细胞库。我们第一次评估低温贮藏过程是否MSC生存和生长性能的影响。这里,我们测试了不同的低温贮藏策略在MSC ( )在通道1:制冷剂含有10%的边后卫或10% hPL以及使用细胞冷冻保存的两种方法:预冷异丙醇容器(耐尔根®的先生)- 80°C 48 h后转移到液态氮或CryoMed可控速度冰柜直接转移到一个液氮罐紧随其后。两周后低温贮藏,细胞解冻和细胞恢复和生存能力被台盼蓝排斥试验。MSC在CryoMed冻存设备,我们观察到细胞回收率从81%到67媒体的边后卫和hPL补充时,分别为( )(图4(一))。同样的,当异丙醇容器被使用,我们观察到细胞回收率从60.5% hPL-supplemented冻结媒体。因此,解冻后生存能力 所有条件除了这些细胞冻存FBS-supplemented制冷剂冻结在异丙醇容器,我们发现减少可行性水平(图4 (b))。为了确定低温贮藏协议的直接影响细胞生长,解冻细胞培养,直到融合(第四天)和自由人民党和PDT值测定。我们没有发现任何显著差异在PDL值比较hPL-freezing媒体和媒体补充的边后卫冻结方法( )(图4 (c))。正如所料,PDT水平平均为30到33小时( ,图4 (d))。在一起,我们发现低温贮藏在CryoMed设备优越的细胞恢复和生存能力。此外,hPL作为冷冻补充媒体的使用是对维持细胞生存能力和增长能力的MSC xeno-free条件下低温贮藏。

最后,我们评估的长期影响低温贮藏和细胞操纵MSC健身。我们培养的MSC ( )长达120天(约20)通过和评价细胞生长的动力学。在所有四个捐助者,我们观察到的PDL 3和4之间的值到40天(12)通过(图5(一个))。有趣的是,从63天(15)通过,我们观察到PDL的持续减少,达到水平低于110年1天(19)通过。连同这个观察,我们发现戏剧性的变化在MSC形态,显示一个大的细胞质大小在段落与后期强烈的细胞密度减少。因此,MSC培养超出65天CPD值显著降低(图显示5 (b))。因此,自由人民党和CPD值在某种程度上可以预测MSC增长的长期性能。有趣的是,通过使用MSC文化达到CPD值低于40,我们可能会获得一个细胞产量10不等¹⁰轮流将允许使用和multipatient准备MSC-based细胞疗法(图5 (c))。

3.5。MSC分化评估来自加州大学

我们下一个测试是否有相关性UC-MSC对骨的基因表达和分化,adipo和chondrogenic血统(图6(一))。我们评估的信使核糖核酸(mRNA)表达成骨的(SPP1 BGLAP),脂肪形成的(FABP4, PPARγ),chondrogenic (COMP和FMOD)通过定量rt - pcr基因。关于proosteogenic基因,我们检测到的表达SPP1 UC-MSC受到成骨分化,在第14天峰。控制相比,BM-MSC表示SPP1的最高水平,在AD-MSC相比,我们没有发现SPP1表达式(图6 (b))。同样,观察BGLAP表达式已经14天,并保持了在治疗UC-MSC(图21天6 (c))。然而,BGLAP表达BM-MSC似乎比UC-MSC优越,AD-MSC。对于adipogenic-related脂肪细胞诱导基因表达后,我们发现高表达FABP4 UC-MSC 14天,21天显著增加(图6 (d))。类似的表达还发现BM-MSC AD-MSC后21天的区别待遇。表达的脂肪形成的PPARγ信使rna也发现在UC-MSC分化(图后14天、21天6 (e)),尽管更高水平的基因表达被发现在BM-MSC和AD-MSC在21天。最后,我们评估chondrogenic-related基因的表达作用和COMP MSC丸后chondrogenic感应协议。我们发现和COMP表达你在14天、21天从UC-MSC分化丸(数字6 (f)和6 (g))还发现BM-MSC AD-MSC。综上所述,这些研究结果证实,在特定的刺激,UC-MSC可以分化成成骨、脂肪形成的,chondrogenic血统和显示一个类似的基因表达模式作为AD-MSC和BM-MSC观察。因此,UC-MSC港multilineage潜力,因此可能会用于再生组织工程。

3.6。UC-MSC支持骨突的形成结构三维支架在活的有机体内

考虑潜在的UC-MSC分化成骨的血统,我们终于设法测试是否UC-MSC培养3 d-collagen支架形成骨突的结构可以提高他们的能力。我们第一次评估是否能够诱导骨突MSC结构在先前建立模型基于胶原蛋白支架的微(29日]。为此,我们事先已经两组UC-MSC(5)通过3天的proosteogenic介质(UC-MSC / OM)或proendothelial分化培养基(UC-MSC / EM)。调节治疗后,UC-MSC / OM和UC-MSC / EM是培养的细胞在胶原微比3:1 (UC-MSC / OM: UC-MSC / EM)和进一步嵌在人血浆凝块。我们第一次评估内皮的影响或成骨的治疗与OM MSC预处理和新兴媒体。内皮细胞进行了分析(CD31和VEGFR)和MSC细胞标记流式细胞术。UC-MSC暴露于EM CD31表达的变化不显著;然而,他们显示一个增强Flk1标记(VEGF受体的表达 ,图7(一))。此外,UC-MSC / EM显示MSC的表达水平明显降低身份标记CD90、CD73和CD105 ( ,图7(一))比UC-MSC孤单。另一方面,细胞暴露于OM治疗保持高水平的MSC标记没有表达VEGFR的变化和CD31(数据没有显示)。我们也评估proangiogenic细胞因子和生长因子的释放UC-MSC暴露于电磁或OM。我们观察到显著增加上层清液的VEGF和基本FGF UC-MSC诱导与他们相比基底或OM(图7 (b), )。检验1版本也在刺激诱导成骨的媒体( 与基底和EM)。有趣的是,我们没有观察到释放PDGF在中浮在表面的电磁或OM-treated细胞。因此,调节UC-MSC proangiogenic或诱导成骨的信号的表达VEGF等关键因素,FGF,检验可能提高支架的可行性在活的有机体内。接下来,我们植入UC-MSC-collagen微OM / EM预处理后立即到C57BL6小鼠,后来他们在第12周。收获的时候,植入物(图7 (c)PFA)提取和固定在4%,嵌入在石蜡,和茜素红染色,苏木精和伊红,马森三色的。有趣的是,我们观察到血vessel-like结构和发展为结构(图蒙上一层阴影7 (d)),这表明3 d-culture配置促进一个更强烈的钙沉积在预先处理这些UC-MSC细胞外基质。组织学分析证实存在的类骨质细胞植入组织(图中未成熟的外表7 (e))。当部分在活的有机体内派生的骨支架被放置在文化,我们可以观察结果与间质细胞的表型,说明维护UC-MSC细胞生长在活的有机体内(图7 (f))。我们也在骨结构维护监测骨形成在体外。后14天的文化中,我们评估了Ca沉积(茜素红)和胶原蛋白基质的形成(马森三色的染色和苏木精和伊红,数字7(我)- - - - - -7 (k)),表明未成熟骨组织的形成,数组的和粗糙的胶原纤维,附近不成熟的骨细胞胶原基质形成。控制结构对茜素红染色阴性,马森的三色的(数据7 (g)和7 (h))。我们通过免疫组织化学方法进一步证实了胶原纤维的存在(图7(左))。综上所述,UC-MSC装载在胶原蛋白微能够诱导骨突结构和保持活力在体外和在活的有机体内。基于这些数据,调节UC-MSC诱导功能proangiogenic和成骨表型导致血管化和骨形成在活的有机体内。

4所示。讨论

在这个报告中,我们开发了一个策略来生成一个基于UC-MSC细胞疗法产品与潜在使用骨临床应用工程。我们旨在介绍MSC隔离的可再生的协议,扩张,和银行按照关键细胞按照良好生产规范生产标准,其中包括建立质量控制的关键参数和使用xeno-free试剂对细胞扩张。重要的是,我们建设的骨突的可行性评估基于胶原蛋白支架微结合UC-MSC骨形成和测试它的潜力在体外和在活的有机体内。

再生骨损伤的干细胞疗法的目标在过去的十年里,特别是在这些条件与主要骨缺陷,丧失骨物质,或延迟断裂。尽管MSC的应用程序显示相对改善骨坏死的临床成功(30.- - - - - -32),下颌和骨缺陷(33- - - - - -37]或骨折重建,骨结构和功能的全面复苏仍然是一个挑战对于组织工程骨方法。这些先前的临床经验大多是基于使用成人骨髓,脂肪组织,或牙科pulp-MSC,单独或结合多种化学或生物支架,并显示广泛的临床结果从症状减轻到完整的骨矿化。然而,临床数据仍然缺乏足够的力量来得出结论对骨再生,MSC的功效主要是由于小和异构组,细胞运送路线,多样性和变化在细胞的来源和特点的产品38,39]。在这个场景中,使用代clinical-grade UC-MSC变得有吸引力的骨骼结构。我们的战略利用脐带组织收集的可用性在公共脐带血银行设施,为了生成标准电池银行进行进一步的临床使用。重要的是,先前的报道有解决的机会发展这样的MSC银行对于“off-the-shell”应用程序,基于相关临床数据证明强大的安全性尤其在同种异体临床24]。在这里,我们获得了沃顿的可再生的数量的MSC果冻组织当技术细胞推导基于组织外植体的应用。重要的是,细胞纯度,immunophenotype、形态学和细胞生长动力学证明高度同质产品和可再生的细胞。这些观察同意MSC从加州大学的巨大潜力为大规模生成细胞疗法以及个性化的医学应用。

我们展示的能力UC-MSC分化成骨的血统在体外当培养单层或3日播种d-culture结构,以及在活的有机体内。尽管BM和AD-derived MSC被广泛用作骨组织工程细胞来源(17- - - - - -19),UC-MSC也展示了潜在的骨(40]。考虑到BM或AD-MSC可能包含相对较少的间叶细胞祖细胞(20.,21),这些细胞逐渐失去增殖能力和分化成成骨细胞在细胞培养操作和扩张(22],UC-MSC成为理想的细胞来源文化和clinical-scaling可能提供大幅增加成骨前体细胞数在最初的收获。我们可以证实成骨分化的UC-MSC 21天以类似的方式作为BM-MSC观察,发现了一个类似的基因表达谱与骨相关的关键因素在体外。有趣的是,我们还观察到增强的软骨细胞形成UC-MSC BM或AD-derived细胞相比,显示非凡的位于分化,增加蛋白多糖和胶原蛋白的生产。这些观察结果支持了这样的观点,即UC-MSC可能富含更多的成骨和chondrogenic祖细胞的数量,因此可能构成的一个非常有效的来源bone-inducer细胞再生能力。此外,我们还可以一起显示proangiogenic活动构造的改进没有从宿主炎性反应。血管化骨支架是至关重要的一代的可行性和功能结构(41- - - - - -43]。这里,不仅植入细胞的分化特性也是重要的血管生成和生长因子的释放相关保护骨诱导的最小条件的工程结构在活的有机体内(44- - - - - -46]。本报告中使用的策略显示UC-MSC不仅获得骨突显性,而且,当诱导血管表型,变得敏感,因此VEGF信号触发释放增长和proangiogenic有利影响因素构建血管化。在足够的刺激,因此,UC-MSC-containing支架显示骨诱导和proangiogenic属性导致一个高度可行的,生物活性同种异体的构造,可以确保其生存能力植入,减少组织坏死和充分诱导骨修复。

为了产生有效的骨结构组织工程学治疗,MSC-derived产品必须满足几个关键细胞生产标准包括强劲扩张的能力在体外、再现性细胞产量和证明效力的细胞产品在这里显示为分化能力之前,政府(6,24]。在发展的过程中以细胞为基础的医药产品,高监管和质量标准涉及良好生产规范进入问题进一步转移到临床。细胞制造的MSC、协议从体外细胞推导到大规模的扩张证明是可行的和具有成本效益的使用基本的细胞培养策略在适当的单元操作设备。本研究中描述的过程是获得一个快速且一致的方法,为后一代的骨突构造均匀的细胞群。符合之前的报道(9,40),我们观察到MSC可以很容易地隔绝WJ受控条件下允许高效细胞隔离使用外植体或组织与胶原酶消化从整线组织或只有WJ。然而,使用胶原酶作为细胞隔离显示上一步减少再现性和效率,特别是,当扩大GMP生产(47]。另一方面,组织外植体被广泛称为适合细胞临床使用[推导和制造业48- - - - - -50]。在我们的研究中,推导乘以(P0 P1)外植体后平均为13.5天,允许细胞高收益率大约10¹⁰细胞30到40细胞复制。因此,细胞扩张协议基于WJ外植体之后,支持快速扩张的生成可靠的细胞产品足够的细胞健康。重要的是,之前的数据来源于MSC的成人脂肪和骨头显示culture-induced衰老的早期迹象30人口倍增后早期(51]。此外,累积的增加人口倍增BM或AD-derived MSC与高风险相关联的细胞转换(52]。我们的数据支持的可能性产生大量的细胞可接受细胞倍范围内;然而,只有经过长时间的使( )我们开始观察复制衰老。这些数据表明,新生儿MSC能够维持更长的扩散能力,文化,因此延长其治疗窗口同时显示的安全性在活的有机体内应用程序。有趣的是,UC-MSC尚未报道诱导畸胎瘤在活的有机体内(15,24),但显示类似于观察到的基因表达谱在胚胎干细胞(ESC),建议改善细胞具备干细胞。UC-MSC是除了来自丢弃出生交付材料,有无限的可用性,和他们的收集、处理、保存、和临床使用不意味着任何伦理问题(53]。因此,相比BM或广告来源,UC-MSC显示细胞疗法有效使用的重要优势。其他重要因素需要解决细胞生产与使用生长因子来源补充培养基,以确保高电池性能,同时保证足够的生物安全概要文件对于人类应用程序。我们建立了一个可再生的协议生成人类use-compliant文化媒体基于人类血小板溶解产物。hPL作为媒介的使用补充MSC生产日益得到普及的可行性和再现性生产和强有力的证据支持一致的细胞扩张在GMP (54]。在这里,我们能够确认添加hPL细胞培养基支持MSC的稳定增长和维护成骨和proangiogenic特性。重要的是,这种效果明显优于标准的细胞培养补充的边后卫。此外,我们甚至探测的可行性的使用MSC的hPL作为低温贮藏的补充。符合这些观察,我们确认没有差异的有益作用hPL MSC性能不同的血型捐助者用于介质时补充准备。这是支持的事实,hPL池来自四个不同血型的浓度差异不显著细胞因子,趋化因子,生长因子含量hPL批次。

总之,在这里,我们有解决关键因素根据UC-MSC发展高性能电池制造生物过程,最终不仅确保人类生物安全要求的应用程序也提高效力和有效性的骨突结构组织工程学疗法。在临床情况下,cell-engineered构建生成的骨再生的生物感应器可以作为患者亚急性分割骨缺陷与创伤或慢性缺陷与萎缩性或先天性故。在这种情况下,细胞构造能提供额外的bone-differentiated细胞组件和三维支持改善骨愈伤组织的形成。此外,由于分泌增长和proangiogenic因素所观察到的,我们可以期待在活的有机体内诱导neoangiogenesis和增加血液供应,从而减少组织坏死和触发细胞迁移,生存和骨整合。最终,这种cell-engineered骨突的应用程序构造可能支持一个完整的骨再生,避免截肢和其他严重的续集在那些复杂的骨缺损。使用UC-MSC为再生医学临床应用继续扩张的目的。然而,尽管越来越多的临床前和临床数据支持使用MSC治疗骨损伤或缺陷的修正,仍有几个问题需要解决,以克服对广泛的临床使用这些方法的局限性。人们普遍接受的安全性UC-MSC药用制剂在临床设置,但治疗效果仍然是讨论。在这方面,深入了解特定的祖细胞数量容易识别的骨分化的分子信号驱动骨间充质阶段还是应该集中在UC-MSC进行准备。在此基础上,使用新型生物相容性材料模仿骨子结构和允许细胞化合物的3 d公司引发的完整集成人工骨受损宿主组织内构造是十分必要的。的整合策略的选择和扩展特定的成骨细胞群,有信号的感应和维护,结合适当的3 d-scaffolds制造管道内将改善这种新颖的疗法对骨再生的适用性。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果可按照客户要求定制。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

英格丽Silva-Cote和莫妮卡Cruz-Barrera贡献同样这项工作。

确认

我们想表达我们的特别感谢博士何塞。从细胞疗法单位研究院Venezolano de Investigaciones Cientificas (IVIC)与动物实验的帮助和重要的修订手稿。我们也想感谢戴安娜马约加优秀的技术援助。这项工作由洋底de Ciencia y Tecnologia Sistema一般de徽章de哥伦比亚项目下BPIN2012000100186数量,从卫生部长和研究基金,波哥大。

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版权

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