脂肪干细胞是一种有效的治疗Fistula-in-ano日本兔

文摘

肛瘘Fistula-in-ano (FIA)的治疗仍然是一个外科coloproctologists面临的挑战。脂肪干细胞tissue-derived (ADSCs)治疗FIA的新边疆。在这项研究中,我们建立了一个国际汽联日本兔模型和评估四个治疗瘘愈合的影响:ADSC移植、非细胞小肠黏膜下层(网络),noncutting斯通和PBS -控制。RNA高通量测序也进行探讨肛门组织(正常和ADSC治疗组)mRNA的表达谱。我们的数据表明,ADSC治疗最短的时间促进瘘管愈合与其他治疗方法相比,和瘘充满新的脂肪组织和肌肉细胞没有疤痕。基因本体论(去)RNA-seq数据的分析表明,差异基因在系统开发和动物器官发展丰富。综上所述,我们的研究结果表明,ADSCs迅速通过分化促进瘘管愈合,FIA的有前途的干细胞疗法。兔子是一种有效的动物模型评价FIA的治疗选择。

1。介绍

FIA是最常见的肛肠疾病之一,在具有挑战性的临床状况的诊断和治疗(1),其发病率在欧盟每年是9104 - 16645例(2),在美国每年2000 - 25000例(3]。男性的影响通常是女性的两倍(4]。几个手术治疗国际汽联已经发展在最近几十年,但是病人抱怨不适和延长治疗期5]。切割斯通是一个关键的方法治疗复杂肛瘘,可保护括约肌功能在某种程度上;然而,肛门失禁率仍高达34% -63%,术后疼痛是严重的(6]。肛瘘塞(法新社),sphincter-preserving技术,简单、微创、短停留时间(7),但法新社的作用在治疗复杂cryptoglandular肛瘘仍然是不完善的8,9]。

间充质干细胞(MSC)疗法在FIA可能代表一个新的替代解决方案,它能够抑制炎症和促进再生过程在同一时间(10]。msc代表一个异质群体的多功能、呈plastic-adherent细胞具有自我更新能力和潜在的分化成多种上皮和间充质细胞类型内层、破骨细胞、脂肪细胞(10]。人类msc没有主要组织相容性复合体(MHC)二类或costimulatory分子表达式(CD40、CD80和CD86),和HLA抗原类我水平还低(11,12]。这不仅使自体治疗但也使同种异体MSC治疗安全、简单的执行(10]。年轻的克罗恩病(CD)复发的病人与自体ASC移植治疗,复发并没有检测到接下来的三个月的随访(13]。在一期和二期临床试验使用的脂肪间充质干细胞移植治疗(ADSC),完成的速度关闭瘘第八周结束时(75%14)和70.8% (15]。III期临床试验是由ADSC移植对于复杂的肛周瘘管患者CD,和结果表明,ADSC移植是一种有效和安全的治疗方法,结合缓解并没有改变在为期一年的随访(58/103 (56.3%))16]。尽管越来越多的报道已报告ADSC治疗复杂肛瘘,很少有报道发表在国际汽联,和动物模型是一种有效的疗效评价方法。

在这项研究中,我们建立了一个国际汽联日本兔模型和评估四个治疗瘘愈合的影响:ADSC移植、非细胞小肠黏膜下层(网络),斯通和PBS -控制。RNA高通量测序也进行探讨肛门组织(正常和ADSC治疗组)mRNA的表达谱。

2。材料和方法

2.1。细胞系和文化

兔子ADMSCs Procell买来生命科技有限公司(武汉,中国)。在DMEM-F12培养基培养细胞成功地补充10%胎牛血清的边后卫和青霉素和链霉素(美国纽约Gibco)在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂和95%的空气。

2.2。建立兔FIA模型

动物使用协议已经审查和批准的机构济宁医科大学动物保健和使用委员会(济宁医科大学附属医院的动物伦理委员会(批准号:2019 - 012财政年度))。兔子FIA模型是在全身麻醉下所建立的。温控电刀(150 - 450°C)被用于制造一个肛瘘0.5至1厘米的肛周的兔子和渗透的边缘0.5至0.7厘米从兔肛门边缘的指导下肛门内窥镜检查。橡皮筋( )悬浮在瘘,破碎的橡皮筋用丝线结扎,以确保浮动橡皮筋瘘是可移动的。所有的兔子都有antibite设备防止咬橡皮筋和舔瘘的内部和外部。和26天后,中央瘘和周围肉芽组织类似于肛瘘的临床特征。最后,20模型成功建立了;没有观察到的60天内肛瘘愈合。

2.3。设计和治疗

五个未经处理的兔子作为正常对照组没有任何治疗。20 FIA兔子被随机分为cell-treated组(FIA-ADMSCs) seton-treated集团(FIA-seton) ASIS-treated集团(FIA-ASIS)和对照组(FIA-PBS),每组5只兔子。

FIA-ADMSCs FIA-PBS:兔子有注射 ADMSCs或等于磷酸盐(PBS)瘘,分别。FIA-seton:橡皮筋是插入到肛瘘探针和穿孔的兔子从外到内瘘。两端收紧的橡皮筋,用丝线结扎地下室。两周后,橡皮筋脱落和瘘愈合。FIA-ASIS:填补瘘和ASIS(陕西晟生物科技有限公司,中国)相同的适当的大小。瘘管都经历了刮除术和缝合的内部开放之前注射:我们使用了一个白手起家的特殊肛门瘘刨床消除扩散组织瘘墙和内部开放,然后用3 - 0可吸收缝线缝合内部开放的指导下鼻镜。没有排水瘘治疗后。肛瘘的治疗标准的兔子模型外部伤口自然愈合,没有分泌物在肛门周围。

兔子牺牲ADMSC移植后70天。在实验结束时,肛门组织(正常、FIA-PBS FIA-seton、FIA-ASIS FIA-ADMSCs) saline-buffered福尔马林固定在4%。

2.4。RNA-seq

总RNA是由RNA浓缩处理。聚(与OligodT尾巴被磁珠富集。获得的RNA被打断的缓冲和retranscribed随机分散N6引物。然后,两股DNA合成形成双链DNA。合成双链DNA被夷为平地,磷酸化在5结束。3最终形成了一个粘性末端突出一个“a”,然后连接到一个泡沫结具有突出的“T”3结束。与特定的引物PCR的轭合物被放大。PCR的产品被热变性成单链DNA,然后循环DNA单链图书馆通过环合的单链DNA与底漆的桥梁。然后,在线进行测序。源和参考基因组测序是GCF_000003625.3_OryCun2.0_ncbi_20190314 oryctolagus_cuniculus的版本。

2.5。统计分析

学生 - - - - - -测试是用于分析提到组之间的差异在定量变量通过使用SPSS 16.0软件(美国SPSS, IL)。在此, 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。ADSC移植瘘愈合时间是最短的

所有的兔子都同时治疗(第0天);每天观察瘘的愈合。ADSC移植组瘘管愈合3至6天,网络多媒体组7至10天,斯通集团10至13天,没有观察到70天的PBS瘘愈合治疗(图1(a))。统计差异分析了不同群体之间的愈合时间。ADSC治疗最短的时间治愈了瘘管相比ASIS集团( )和斯通集团( ),和ASIS比斯通集团(短 )(图1(b))。

3.2。肛门治疗评估治疗后

兔子FIA模型成功地构造(图2(一个)),和四个治疗性刮宫后实施,缝合的内部。作为对照组,没有观察到瘘愈合实验的最后,PBS治疗,和流体不断流出瘘(图2 (c))。斯通是一个众所周知的传统手术治疗国际汽联。最终在这项研究中,瘘管愈合,但肛门的形状变形,严重的缺陷是斯通切割部位形成和美学明显减少(图2 (d))。ASIS治疗痊愈的瘘管没有明显疤痕,没有肛门的形状(图的变化2 (e))。ADSC移植治疗效果优于ASIS和肛门正常兔子(图的相似2 (e))。

3.3。组织病理学评价治疗后

正常肛门组织是富含纤维复层鳞状上皮下结缔组织(图3(一个))。PBS注射后,瘘管没有愈合,浓缩在炎症细胞(图3 (b))。在斯通切割治疗,瘘管愈合,但伤疤是显而易见的,肛门组织在肉芽组织(图丰富3 (c))。在网络多媒体处理、肛门组织在新生组织丰富,肉芽组织减少,脂肪组织增加,新的毛囊腺出现了。在ADSC移植,肛门组织富含脂肪组织和新毛囊腺,没有造粒和炎症细胞。

3.4。RNA-seq分析

四个ADSC-treated治疗兔肛门组织和两个正常肛门组织用于RNA-seq检测相应的位置。1361年在1747个差异表达基因,调节和386个表达下调(褶皱变化 , )(图3(一个))。然而,聚类结果表明,ADSC治疗组和正常对照组明显不能分离(图3 (b))。建议由ADSC瘘治疗移植后的组织类型关闭正常肛门组织。分析表明,差异表达的基因主要参与系统开发和多细胞生物(图发展3 (d))。KEGG富集分析显示差异基因主要富集在信号转导、免疫系统,信号分子和互动,等等(图4 (e))。KEGG路径分析结果表明微分基因显著富集的外源性物质的代谢通路细胞色素P450,药物metabolism-other酶,cytokine-cytokine受体相互作用,蛋白质的消化和吸收,PI3K-Akt信号通路,等等(图4 (f))。图5演示了一些不同的重要的分子(85 9)可能发挥重要作用的干细胞治疗瘘愈合。

4所示。讨论

在这项研究中,我们的数据表明,ADSC移植是一种有效的治疗瘘愈合,恢复时间最短和瘘充满脂肪细胞没有疤痕和炎症。大鼠(17,狗18),甚至猪模型还建立了复杂的国际汽联(19),但没有建立小鼠模型。兔子是一种很好的瘘动物模型研究,已用于建立一个模型transsphincteric瘘(20.],aortocavitary瘘[21),食管吻合口瘘22),尿瘘(23),和肛周瘘24]。兔子有合适的身体大小,很容易获得,并且可以建立大量的FIA模型一次;使用此模型可以提高治疗计划。

长时间放置noncutting串线仍然是一个“黄金标准”的姑息治疗瘘管(25]。Sphincter-saving操作之前应该长期排水与noncutting串线直到瘘管的轨道内炎症消退(26]。切割串线不推荐由于括约肌损伤的风险或变形的肛门25]。在我们的研究中,兔子瘘管在最后一次治疗后noncutting串线,但肛门变形严重,瘘与疤痕愈合时间长和炎症。这类似于人类的影响病人治疗noncutting串线,这给患者带来了巨大的痛苦。

肛瘘塞,来自猪小肠粘膜下层(SIS),是一个强大的柔软组织裸细胞为宿主提供了一个支架的成纤维细胞,促进组织愈合和修复受损组织(27]。SIS安全但适度有效的长期随访,成功率从24%到88%不等;失败率可能由于其挤压从瘘道28]。在我们的研究中,网络多媒体治疗痊愈兔子瘘管没有明显疤痕,没有改变形状的肛门。病理结果表明治疗瘘是丰富新生组织和肉芽组织的减少,脂肪组织增加,新的毛囊腺出现了。尽管网络良好的治疗效果,治疗时间仍低于ADSC移植组。此外,不是所有的病人会选择这种治疗,因为成本太高。

干细胞治疗是最有前途的治疗;目前,一些干细胞治疗已显示出良好的效果,这可能是一个治疗的前景。人类msc没有MHCII或costimulatory分子表达,HLA抗原类我水平也低(11,12]。没有发现明显的免疫排斥反应在我们的国际汽联模型兔ADMSC移植。虽然没有争议FIA患者移植自己的目前ADMSCs [5),同种异体扩大脂肪干细胞(Cx601)已经使用即使在三期临床试验(16,29日]。结果表明,人类ADMSCs可以批量生产的基于其免疫豁免。

最近,ADMSC治疗肛瘘的研究主要侧重于治疗评价动物和人类的实验,但几乎没有任何研究分子机制。在这项研究中,我们进行了RNA-seq分析和获得许多差异表达基因。分析表明,差异表达的基因主要参与系统开发和多细胞生物的发展,和我们的病理结果也证实这一结果。KEGG富集分析显示差异基因主要富集在免疫系统,如热像GREM1地图所示,TGFB3, CXCL10, IL1A CCL21, C4A。此外,胶原蛋白表达水平都增加,像COL1A1 COL1A2, COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL14A1,扮演着重要的角色在瘘愈合。我们将揭示这些分子在瘘愈合的作用在未来的工作。

尽管ADMSC治疗肛瘘的临床阶段,显示了良好的治疗效果,仍有许多问题需要解决:(1)如何提高总缓解率?。(2)干细胞产品?如何准备标准;(3)如何规范治疗方案?需要更多的后续研究来回答这些问题,但并不是所有的研究机构可以进行临床试验。大量的兔子FIA完成这些实验模型是必要的。未来的研究将逐步解决问题,和干细胞治疗肛瘘在临床治疗可能成为第一个成熟产品。

5。结论

我们的研究结果表明,ADSCs迅速通过分化促进瘘管愈合,FIA的有前途的干细胞疗法。兔子是一种有效的动物模型评价FIA的治疗选择。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

小秦和彭王co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

分钟曹国伟和魏王设计的研究。小秦,彭王、黄永明和李Yansen执行大部分的实验。魏王写的手稿。分钟曹国伟辅助数据分析,讨论,并解释结果。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81802945)和山东医疗卫生科技发展计划项目(2016 ws0166)。

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