褪黑素逆转TNF-引起的干性损失α在人骨髓间充质干细胞中通过上调YAP表达

抽象

间充质干细胞（MSC）是有前途的用于组织再生和疾病治疗的候选者。然而，长期的在体外培养结果在MSC干性的损失。发生在干细胞移植部位（如从TNF-α导致的炎症α）是用于干细胞治疗失败的一个因素。目前，关于褪黑素的关于TNF-α的负面影响的保护作用，很少有证据α对MSCs的干性。在这项研究中，我们提出一个基于褪黑激素的方法来减少对骨髓的干性炎症效果间充质干细胞（BMMSCs中）。集落形成测定的结果，茜素红染色，蛋白质印迹，和反转录 - 聚合酶链式反应表明，褪黑激素可以逆转引起TNF-α的炎症损伤α第三代、第七代和第十代原发BMMSCs的治疗(对照和TNF-)α治疗组)。同时，详细的分子机制分析表明褪黑素受体和YAP信号通路与褪黑素对BMMSCs的负性炎症作用密切相关。此外,在活的有机体内实验表明，褪黑激素能逆转引起TNF-α的损害α骨髓间充质干细胞在裸鼠骨再生中的作用。总的来说，我们的结果表明褪黑素可以逆转炎症因子TNF-引起的干性丧失α在BMMSCs。我们的研究结果也为BMMSCs在组织工程和细胞治疗中的应用提供了实用的策略。

1.介绍

骨髓间充质干细胞(BMMSCs)是最初在骨髓培养中检测到的梭形贴壁细胞。后续研究表明，间充质干细胞主要存在于骨髓基质中[1]。Stemness是指干细胞维持增殖潜能和多种分化途径的能力[2]。在不同诱导条件下，间充质干细胞可分化为软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞等多种中胚层组织细胞。同时，间充质干细胞还可以分化为内胚层细胞和外胚层细胞，如肝细胞样细胞和神经元样细胞[3.]。此外，在临床应用中使用间充质干细胞的诸多优势已被报道，包括低免疫原性、多向分化潜能、诱导免疫耐受、免疫抑制以及缺乏相关伦理问题[4]。因此，间充质干细胞已成为细胞治疗和组织工程的主要候选细胞。但在临床实践中，MSCs仍需进一步拓展在体外获得足够量的，但是他们这个科目复制老化的有害影响。此外，间充质干这一经验氧化应激可经历过早老化，其可显著影响其分化成不同类型的细胞的能力[5,6]。这些因素限制了间充质干细胞的临床应用[7]。

肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)是巨噬细胞/单核细胞活化后产生的细胞因子。该因子在维持细胞stemness和脂肪分化中发挥重要作用[8]。例如,TNF -α可通过多种信号通路抑制干细胞向成骨细胞分化，包括无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt)、骨形态发生蛋白- (BMP-) Smads、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核转录因子kappa B (NF- ?κB)信号(9,10]。然而，尚不清楚TNF-需要哪些相关因素α维持干性和在的BMMSCs细胞分化的潜力[11]。

褪黑激素是主要分泌从已被证明具有广泛的影响[松果体激素12]。先前的研究已经表明，褪黑激素调节各种生理功能，如睡眠，昼夜节律，和神经内分泌活性[13]。褪黑激素具有公知的抗氧化性能，并且已显示，以消除过量的自由基和增加细胞内抗氧化酶的合成[14,15]。褪黑激素通过减少活性氧产生和增加超氧化物歧化酶的生产[保护从促炎细胞因子的细胞16]。1999年，茅盾等人。证实，高水平的褪黑激素存在于骨髓[17]。近年来，褪黑素被证明可以调节间充质干细胞的多能分化[18]。收音机等。发现在人MSC，褪黑激素增强碱性磷酸酶活性经由MAPK信号传导途径。此外，在活的有机体内研究已经证实，在褪黑激素浓度药理促进小鼠骨形成[19]。然而，关于褪黑素如何逆转TNF-对stemness的抑制，仍然没有证据α在间充质干。褪黑激素和TNF-α的因此，具体的角色α骨髓间充质干细胞的stemness值得进一步研究。

在本研究中，我们使用TNF-α模拟第三代、第七代、第十代骨髓基质细胞的炎症反应。用菌落形成、茜素红染色、western blotting和RT-PCR评估TNF-的分子效应α- 和/或褪黑激素处理的人的BMMSCs。此外，骨质疏松裸小鼠模型来研究用苏木精和曙红（H＆E）染色和微CT途径的病理变化。在这项研究中获得的结果提供了关于BMMSC干性，这将在未来的临床应用有用的详细信息。

2.材料和方法

2.1。分离与人类的BMMSCs文化

这些实验是由孙中山大学伦理委员会的批准。在MSCS是由三个健康的志愿者捐赠的。所有参与者都充分理解实验程序和签署知情同意书。人类的BMMSCs如先前所述分离[20- - - - - -23]。Briefly, human bone marrow (8–10 mL) was isolated and the cells were counted and plated in 75 cm²烧瓶中，密度 在DMEM（Invitrogen，美国），用20％的胎牛血清。Nonadherent cells were removed after 24 h. Subsequently, the media were changed every 3 days. When the cells reached 80%–90% confluence, the BMMSCs were expanded to passage 2 using human recombinant trypsin (Invitrogen, USA). Cells at passage 3 (P3), passage 7 (P7), and passage 10 (P10) were harvested for future analyses.

2.2。流式细胞术

流式细胞术(DxFLEX, Beckman Coulter, USA)分析BMMSCs。P3细胞被培养在PE anti-human CD73 (Ecto-5)中 -(BioLegend，美国)，PE抗人CD73 (Ecto-5) -(BioLegend，美国)，APC抗人CD90 (Thy1) (BioLegend，美国)，APC抗人CD34 (BioLegend，美国)，Alexa Fluor®488抗人CD45 (BioLegend，美国)，和Alexa Fluor®488抗人CD105 (Abcam，美国)的浓度由制造商指定。相应的同型抗体作为对照。

2.3。BMMSC治疗

P3、P7和P10位点的BMMSCs被诱导成骨分化和成脂分化。成骨诱导:骨髓间充质干细胞在DMEM中沉积，并辅以成骨分化试验(刘河生物，中国)。2周后，用茜素红S (ARS)染色(Sigma-Aldrich，美国)对分化后的BMMSCs进行染色。有关测试的详细实验程序已按先前所述进行[24]。对于脂肪诱导，在的BMMSCs间充质干细胞，脂肪细胞分化培养基（ScienCell，中国）接种。如由制造商提供的实验方案进行。The colony formation assays were conducted with untreated BMMSCs and BMMSCs treated with 20 ng/mL TNF-α肿瘤坏死因子-α+ 100μM褪黑素(Mel)， TNF-α+蜂蜜+ 10μ或TNF-α+梅尔+ 5 μM verteporfin (VP, Yes-associated protein, YAP)抑制剂)。每孔约500个细胞加入6孔培养板。孵育2周后，PBS洗涤2次，甲苯胺蓝染色(BestBio, China)。克隆形成效率计算为[菌落数]/[接种细胞数]。褪黑素、肿瘤坏死因子-α、Luz和VP均来自Sigma-Aldrich公司(美国)。

2.4。RT-PCR

使用RNAiso Plus试剂(瑞士罗氏公司)从BMMSCs中精确提取总RNA。20例进行了逆转录- pcr (RT-PCR)分析μL根据制造商说明使用TaKaRa PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(D6210A, TaKaRa, Japan)从400ng总RNA中提取最终体积。GAPDH,RUNX2,OPN,OCN,HTERT,SOX2,原癌基因,NANOG,PPARγ-2,LPL,脂联素和YAPmRNA水平通过RT-PCR测定，并如表中所描述的引物利用1。反应时间为20年μL包含2x SYBR®的体积预混料防爆的Taq™（TAKARA，日本），PCR正向引物（10 μM），PCR反向引物（10 μ， cDNA模板，ddH₂O. RT-PCR使用Bio-Rad公司CFX96实时PCR系统进行。Thermal cycling conditions were as follows: 10 min at 95°C, followed by 40 cycles of 95°C for 10 s, 60°C for 20 s, and 72°C for 30 s. Data were collected and calculated using the Bio-Rad CFX Manager Software1.6. RNA expression was calculated based on a relative standard curve with the 2^-ΔΔct方法。

2.5。Western印迹

加入1% PMSF和RIPA裂解液(50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、1% NP-40、0.1% SDS)，从不同处理后的BMMSCs中提取细胞总蛋白。样品在SDS-PAGE缓冲液中煮沸5 min后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore, USA)。室温封闭1小时后，将膜与下列抗体(Abs) 1:10 00稀释孵育过夜:抗HTERT、SOX2、C-MYC、NANOG、OPN、OCN、RUNX2、PPAR抗体γ-2，脂蛋白脂肪酶（LPL），脂联素和GAPDH。检测用ECL化学发光检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，中国）之前，将蛋白与辣根过氧化物酶温育（HRP-）缀合的山羊抗兔IgG（H＆L）和HRP缀合的山羊抗小鼠IgG（H＆L）二次antibodies (1 : 5000 dilution) for 1 h at room temperature (Thermo Scientific, USA). The bands were examined with ImageJ software (National Institutes of Health, USA).

2.6。动物诊疗

八周大BALB / C从查尔斯河（北京，中国）获得了裸鼠。六十裸鼠随机分为六组，包括控制（CON， ),骨质疏松症模拟组(OVX， ),OVX + P3 BMSC治疗（OVX + P3， ),OVX+P3 BMSCs+ 20ng /mL TNF-α治疗(OVX + P3 + TNF -α, ),OVX + P3 bmsc + TNF -α+ 100μ中号梅尔治疗（OVX + P3 + TNF-α+梅尔, ),和OVX + P3 +骨髓基质干细胞肿瘤坏死因子α+梅尔+ 5 μ中号维替泊芬（OVX + P3 + TNF-α+梅尔+ VP, )。骨质疏松症的模型成立（卵巢切除手术）后，用的BMMSCs梅尔，TNF-α处理的α，并在尾静脉注射VP。造模8周后，收集股骨组织作进一步实验。

2.7。他走时染色

既往报道进行H&E染色[25]。骨标本用10%缓冲福尔马林固定，石蜡包埋。3 - 5微米厚的切片用苏木精(Sigma H 3136)染色10分钟，用伊红(Sigma E 4382)染色1分钟以确定诊断区域。

2.8。骨显微结构观察

为观察骨微结构，牺牲前使用SCANCO Medical AG(瑞士)进行微ct检查，如前所述[26]。参数设置如下： kV; μ一个; μ米; ; 。随后，使用西门子临床前成像系统在标准分辨率模式下，在多层组织中自动测量骨体积/总体积(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离(Tb.Sp)和骨小梁模式因子等骨微结构参数[27,28]。

2.9。统计分析

在这项研究中的统计学差异采用SPSS 18.0软件进行评估。对所测量的数据的统计结果的平均值被表示为 。本研究的价值观是由学生的价值观进行分析 -测试。值< 0.05被认为是两个测量值之间的显著差异。

3.结果

3.1。BMMSC干性与细胞推移而减少

在本研究中，对P3期的BMMSCs进行了流式细胞术分析，以评估其表面标记物的存在(补充图)1)。大多数的BMMSCs（> 95％）为阳性CD73，CD90，和CD105，而<2％阳性CD45或CD34。的BMMSCs的干性和细胞继承之间的关系是由集落形成测定法，蛋白质印迹法，RT-PCR检测，和茜素红染色。集落形成分析，我们选择在P3，P7和P10的主要的BMMSCs。结果表明P7和P10的BMMSCs的该集落形成显著减少了与该P3和初级的BMMSCs（相比 )(图1(一))。对于蛋白质印迹分析中，我们评估BMMSC干性酶（hTERT，SOX2，c-myc，和NANOG），成骨分化（RUNX2，OPN和OCN），和脂肪分化的生物标志物（PPARγ-2，LPL，和脂联素）在P3，P7和P10的BMMSCs（图1 (b)- - - - - -1 (d))。结果显示，与P3细胞相比，P7和P10细胞中反映BMMSC stemness、成骨分化和脂肪分化的蛋白丰度显著下调。同时，RT-PCR分析与western blot分析结果相似。这些生物标志物在P7和P10细胞中的mRNA丰度均较P3细胞显著降低( )（数据1 (e)- - - - - -1 (g))。此外，我们采用茜素红染色研究P3、P7和P10骨髓间充质干细胞的成骨分化。定量分析显示，P7和P10细胞的染色光密度(OD)低于P3细胞(图)1 (h))。总之，干性密切观察用的BMMSCs的产生相关。

3.2。褪黑素可以逆转炎症环境导致的BMMSC Stemness的损失

在本研究中，我们使用了三种不同浓度的TNF-α(10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL)模拟炎症环境。RT-PCR分析骨髓间充质干细胞stemness的生物标志物(SOX2,原癌基因和NANOG）表明，这些生物标志物mRNA的丰度在三个处理组显著低于对照组（ )(图2(一个))。Based on the relative mRNA abundances of these biomarkers in the treatment groups, 20 ng/mL was selected for further analysis. We also evaluated the effects of melatonin on TNF-α对待BMMSCs。在菌落形成实验中，我们选择了BMMSCs的P3代。TNF-的菌落形成比率α-处理组明显低于对照组( )。然而，在TNF-上形成菌落α处理组可以与褪黑激素处理来部分恢复（ 与TNF-αα治疗组)(图2 (b))。丰度表达BMMSC干性的生物标志物（HTERT,SOX2,原癌基因和NANOG），成骨分化（RUNX2,OPN和OCN)，脂肪分化(PPARγ-2,LPL和脂联素用RT-PCR检测不同处理的P3、P7和P10细胞(图)2 (c)- - - - - -2 (e))。结果表明，表达水平HTERT,SOX2,原癌基因,NANOG,RUNX2,OPN,OCN,PPARγ-2,LPL和脂联素在TNF-中的作用α-处理后的P3、P7、P10细胞明显低于对照组( )。然而，这些基因的表达水平与回收额外治疗褪黑激素（ 与TNF-αα治疗组)。western blot检测也发现了类似的结果。TNF-中这些生物标志物的蛋白丰度α-处理后的P3、P7、P10细胞也明显低于对照组( )。同时，褪黑激素治疗可部分恢复这些基因的蛋白表达（ )（数据2 (f)- - - - - -2（H）)。采用茜素红染色观察P3细胞中骨髓间充质干细胞的成骨分化。定量显示OD在TNF-中α-处理组明显低于对照组( )。褪黑素治疗可增加TNF-中的矿物沉积α治疗组( 与TNF-αα治疗组)(图2（I）)。因此，褪黑激素是在逆转由炎症环境BMMSC干性的损失有效。

3.3。褪黑激素逆转通过其受体BMMSC干性炎症引起的损耗

在这项研究中，我们已经采用luzindole（褪黑激素受体抑制剂）来研究褪黑激素在BMMSC P3产生的分子机制。BMMSCs中被分成四组：对照组，TNF-α肿瘤坏死因子-α+梅尔,TNF -α+梅尔+鲁兹。对于群体形成分析，TNF-的群体形成比率α明显低于对照组( )。在TNF-α的集落形成比α+Mel组明显高于TNF-组α集团( )。但是，这个值在TNF-上α+Mel+Luz组明显低于TNF-组α+梅尔集团( )(图3(一个))。RT-PCR和western blot分析BMMSC stemness (HTERT、SOX2、C-MYC和NANOG水平)、成骨分化(RUNX2、OPN和OCN水平)和脂肪分化(PPAR)γ我们检测了P3细胞在不同处理下的-2、LPL和脂联素水平(见图)3 (b)- - - - - -图3（g）)。结果表明，在mRNA和蛋白表达水平在这些分子机制BMMSC P3细胞的TNF-αα+Mel+Luz组明显低于TNF-组α+梅尔集团( )。因此，我们推测褪黑激素可能通过其受体逆转BMMSC干性的抗炎作用。

3.4。褪黑激素逆转BMMSC干性的通过YAP基因表达的炎症引起的损耗

在这项研究中，我们采用5 μ研究褪黑素对骨髓间充质干细胞stemness的分子机制。BMMSCs中被分成四组：对照组，TNF-α肿瘤坏死因子-α+梅尔,TNF -α+梅尔+ VP。对YAP表达的RT-PCR和western blot分析显示TNF-的表达α处理可显著降低P3、P7、P10骨髓间充质干细胞YAP mRNA表达及蛋白丰度。而褪黑素治疗可以逆转TNF-中YAP mRNA和蛋白的表达α治疗过的BMMSCs（ )（数据4(一)和图4（b）)。此外,图图4（c）显示，在TNF-αYAP蛋白表达α+梅尔+ VP组显著比在TNF-α降低αP3、P7、P10细胞+Mel组( )(图图4（c）)。对于群体形成分析，TNF-的群体形成比率α+梅尔+ VP组显著比在TNF-α降低α+ Mel-treated集团( )(图图4（d）)。此外，在对BMMSC stemness (HTERT、SOX2、C-MYC和NANOG水平)、成骨分化(RUNX2、OPN和OCN水平)和脂肪分化(PPAR)的western blot和RT-PCR分析中也观察到类似的情况γ2、LPL和脂联素水平)在P3细胞中不同处理(图)图4（e）- - - - - -4 (j))。TNF-中这些基因的mRNA和蛋白表达水平α+Mel+VP组明显低于TNF-组α+梅尔集团( )。总之，YAP是褪黑素逆转炎症对BMMSC stemness影响的潜在靶点。

3.5。骨质疏松裸鼠模型的BMMSC治疗

在这项研究中，我们构建了骨质疏松症小鼠模型研究的影响，BMMSC治疗的潜在的分子机制。数字5(a)显示各组小梁骨二维、三维微ct图结果。结果表明，经OVX治疗的小鼠骨质疏松模型构建成功。骨髓间充质干细胞治疗可部分恢复骨质疏松症的损伤(OVX+P3骨髓间充质干细胞治疗)。肿瘤坏死因子-α治疗严重骨质疏松症。然而，褪黑素能够逆转骨质疏松症的损害。VP, YAP抑制剂之一，显示削弱褪黑素在骨质疏松症的治疗效果。H&E染色分析也有类似结果(图)5(b))。对骨质疏松相关指标进行定量分析，提示骨密度、BV/TV、Tb值。N,结核病。6个亚组间差异有统计学意义。例如，OVX组的上述指标明显低于对照组( )。同时，OVX+P3骨髓间充质干细胞+TNF-中上述指标α+梅尔组较在OVX + P3 + BMSC TNF-显著更高α集团( )。但VP可以逆转OVX+P3 BMSC+TNF-的表达α+蜂蜜+ VP组(数字5(c) -5(f))。此外,结核病。Sp和小梁模式因子分析表明，不同组的两项指标在六个亚组中也有显著性差异。例如，OVX组的两项指标都明显高于对照组( )。与此同时，OVX+P3骨髓间充质干细胞+TNF-的这两项指标均显著升高α+梅尔组比在OVX + P3 + BMSC TNF-被显著降低α集团( )。而在OVX+P3骨髓间充质干细胞+TNF-中表达上调α+Mel+VP组与OVX+P3 BMSC+TNF-组比较α+梅尔集团(数字5（g）和5(h))。

4.讨论

Stemness是指干细胞保持多能分化潜能且不发生定向分化的能力[29]。在…的早期在体外干细胞培养物，干细胞的干性可以被保持。然而，干细胞的干性随着培养时间的延长而减小[三十]。与此同时,当在体外-cultured干细胞被注射到体内时，MSC的干性也降低[31,32]。由于在干性的降低，降低的MSC主要通过抗炎作用，而不是通过分化成组织损伤的治疗特定组织类型心肌梗塞和脊髓损伤[组织损伤33,34]。MSC stemness的维持与多种因素有关，包括衰老、在体外生成和起源。老化，有与干性降低相关的各种特征，包括在骨髓脂肪组织积累和降低的成骨细胞分化的能力[35]。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)已被证明通过调节沉默信息调节器1 (sirtl)基因的活性，影响间充质干细胞脂肪形成和成骨之间的平衡。为在体外MSCs的发生和起源，MSCs的stemness可以维持在的早期和中期在体外增长。然而，一旦超过关键时间，stemness就会显著降低[36,37]。来自不同组织来源同时，干细胞对自己的能力过程中保持干性显著差异在体外文化。例如，的BMMSCs的干性可维持直到15^th一代在体外。然而，随着随后的培养，茎度随之下降。只有非常少的多能细胞可以维持到20岁^th一代在体外(38]。脐充质干细胞表现出文化的早期和中期的代稳定的干性;然而，相关的老化，如CD105和CD73标记，分别显著的21后增加^圣代[39]。在我们的研究中，随着BMMSCs传代的增加，其stemness和成骨、成脂分化能力逐渐下降。因此，对msc中维持stemness的机制进行详细的分子理解是非常重要的。

肿瘤坏死因子-α于1975年发现[40， TNF家族有两个主要成员，即TNF-α和肿瘤坏死因子-β。肿瘤坏死因子-α主要由单核活化巨噬细胞产生和密切相关的骨质疏松症，高TNF-α骨质疏松症患者可检测到表达[41,42]。这表明TNF-α是骨代谢疾病的重要因素。肿瘤坏死因子-α是一种结合跨膜受体的三聚体炎症因子。肿瘤坏死因子-α与各种细胞的协同作用以产生对炎性产物，细菌毒素，和其它侵蚀性刺激[协调一致响应43]。BMMSCs中发生凋亡炎性环境。肿瘤坏死因子-α可以促进细胞凋亡间接地通过调节NO [44]。与此同时,肿瘤坏死因子-α抑制HMSCs中两个转录因子Ostrix和Runx2的表达。因此,肿瘤坏死因子-α可以降低成骨细胞分化的特异性标记物的最终抑制末端成骨细胞的分化[表达式45]。此外，TNF-α可调控BMP-2和POEM的表达，从而抑制成骨细胞的分化[46]。此外,肿瘤坏死因子-α对破骨细胞骨的吸收有显著影响[47]。总体而言，TNF-α能抑制骨重塑和促进骨吸收，这导致减少的骨量。In this study, 20 ng/mL TNF-α可有效诱导骨髓间充质干细胞的炎症环境。

治疗与褪黑激素可提高显著MSC的生存力和刺激血管生成，肾细胞的增殖，和肾复苏[48]。在体外细胞试验已经表明，褪黑激素可诱导产生抗氧化酶，例如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的，这可以减少细胞凋亡由氧化应激引起的MSC [49]。褪黑激素也可以减少由白介素-1诱导的MSC的炎症。褪黑激素治疗可以增加的Cu / Zn超氧化物歧化酶（铜/ ZnSOD）和的MnSOD的表达和降低凋亡相关Bax基因表达的表达水平。褪黑激素受体抑制剂luzindole可以通过褪黑素抑制效果的原因[50]。在本研究中，我们的结果显示，褪黑素治疗BMMSCs可以有效恢复TNF-导致的细胞干性缺失α这与之前的研究一致。因此，褪黑素治疗是挽救BMMSC stemness的有效手段。

MSCs的干性的维护是由多种细胞信号，如BMP信号和Wnt信号，它可以促进MSC分化成成骨细胞的调节。然而，缺乏BMP信号或Wnt信号的会抑制MSC分化成成骨细胞和促进MSC分化成脂肪细胞[51- - - - - -53]。血小板来源生长因子BB (PDGF-BB)，肝细胞生长因子，转化生长因子(TGF-)β)，而碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)信号可促进间充质干细胞向肌肉分化[54- - - - - -56]。最近的研究发现，Hippo信号在MSC命运的决定中也起着关键作用。Hippo信号在动物体内高度保守，主要调节干细胞自我更新、组织再生和器官大小[57,58]。YAP是关键的转录因子，被Hippo途径负调控，Hippo途径是调节器官大小和肿瘤发生的保守途径[59,60]。最近的研究发现YAP可以调节对骨稳态至关重要的转录因子，如runt相关转录因子2 (RUNX2) [61]，信号转导和转录因子3（STAT3）的活化剂[62),而β连环蛋白(63]。RUNX2是刺激成骨的基本转录因子，YAP可作为RUNX2的辅激活因子[61]。Pan等报道YAP可以稳定β连环蛋白，从而增加核β-catenin-mediated骨(63]。在本研究中，YAP表达降低为TNF-α抑制BMMSC干性。然而，褪黑激素能够恢复YAP表达。我们的研究结果证实，褪黑激素治疗可以逆转引起的TNF-αBMMSC干性的损失α通过YAP信号。

5。结论

总之，我们证明了HMSC干性增加的几代下降在体外文化。肿瘤坏死因子-α会导致干性HMSC基于炎症减少。然而，褪黑激素能逆转经由褪黑素受体和YAP信令炎症减少HMSC干性的。在骨质疏松的裸鼠，褪黑激素改善HMSC治疗的效果。这项工作提供的褪黑激素治疗的hMSCs的影响有详细的了解。

缩略语

间充质干：	间充质干细胞
的BMMSCs：	骨髓间充质干细胞
HMSC的：	人骨髓间充质干细胞
BMP：	骨形成蛋白
HTERT:	人类端粒酶逆转录酶
OPN：	骨桥蛋白
OCN:	骨钙素
RUNX2:	重组侏儒相关转录因子2
PPARγ2:	过氧化物酶体增殖物激活受体γ
LPL：	脂蛋白脂酶
他：	苏木精和伊红染色。

数据可用性

在本研究中分析的数据集可从通讯作者在合理要求下获得。

伦理审批

在中山大学大学的研究伦理委员会批准的组织样本收集研究。

的利益冲突

所有作者声明无利益冲突。

作者的贡献

DSH和YP设计了实验。XDW，TZL，JCQ，XJQ，BG，WJG，CJL，TQC，YXZ，AJL，和PQS进行的实验。XDW，TZL，并JCQ采集的数据。XDW，TZL，JCQ，DSH和YP分析数据。XDW，DSH和YP写的稿子。所有作者阅读并认可的终稿。旭东王，通州亮和邱晋城贡献同样对这项工作。

致谢

这项工作由国家自然科学基金(No. 81572134)和广东省自然科学基金(No. 2017A030311008, 2016A030313284, 2018A030313096)资助。

补充材料

补充图1:分离的BMMSCs的鉴定。流式细胞术分析CD34 (a)、CD45 (b)、CD73 (c)、CD90 (d)和CD105 (e)。(补充材料)

参考

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