激活蛋白1转录活动驱动器可溶性Micrograft-Mediated细胞迁移和促进矩阵重构机制

文摘

伤口愈合和组织再生受损严重影响病人的生活质量。Micrograft治疗正在成为有前途的和负担得起的替代改善皮肤再生,增强内生伤口修复过程。然而,支撑的有利影响的分子机制micrograft治疗在很大程度上仍未知。在这项研究中,我们确定了活性蛋白1 (AP-1)成员Fos-related antigen-1 (Fra-1)发挥核心作用在细胞外signal-regulated激酶(ERK)介导的细胞迁移能力增强,可溶性micrograft-treated鼠标成人成纤维细胞和人类角化细胞细胞模型。因此,我们表明,micrograft-dependent增加在体外细胞迁移和矩阵对抑制AP-1 metalloprotease活动取消。此外,可溶性micrograft治疗导致增加表达式和转译后的磷酸化Fra-1 c-Jun,导致伤口的upregulation healing-associated基因主要参与细胞迁移的规定。总的来说,我们的工作背后的分子机制提供了洞察micrograft游离治疗,这可能有助于未来的伤口修复治疗的进步。

1。介绍

皮肤是人体最大的器官提供保护、免疫防御和感觉。创伤性损伤和受损的伤口愈合极大地影响患者的生活质量,最终导致死亡。因此,最佳的组织再生和适当的伤口管理需要保持皮肤的完整性。

伤口愈合的过程中出现的一个复杂的转录因子之间的相互作用,调节转录网络至关重要。信号级联激活是严格监管,是内因与外因的输入转换成转录细胞反应等细胞的变化。在伤口愈合过程中,连续的细胞过程正在积极协调下一波又一波的生长因子和细胞因子(1- - - - - -3]。受伤后,一些转录因子引发的受损组织。其中,TGF -β信号和经典的转录因子NF -κB有被描述为监管机构,引起免疫反应的初始步骤伤口愈合过程。这导致的免疫细胞和血小板源生产大量的生长因子包括转化生长因子(TGF -β)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和结缔组织生长因子(CTGF)在受伤的网站(4- - - - - -6]。这些反过来建立血管生成等关键修复过程,矩阵沉积,迁移,增殖,成纤维细胞分化转移通过关键信号级联4]。虽然TGF -β伤口收缩的信号是一个重要的监管机构和矩阵由myofibroblasts沉积,MEK / ERK级联已报道促进角质细胞和纤维母细胞的增殖和迁移,伤口愈合的主要细胞类型包括(7- - - - - -9]。有趣的是,激活蛋白1 (AP-1)家庭被报道为下游转录因子的ERK级联10,11]。受伤后,AP-1活动已被证明是诱导MAPK-dependent地在老鼠胎儿皮肤(12]。这种蛋白质家族包括人类,形成蛋白质之间形成的主要的安全系数和小君的家人13]。磷酸化,AP-1是调节基因在伤口愈合,如生长因子和矩阵metalloproteases(基质金属蛋白酶)14]。总的来说,成功的伤口修复强烈依赖于时空活动的几个细胞信号通路。

黄金标准治疗促进伤口修复仍植皮方法已广泛用于涉及皮肤移植和广泛的治疗伤口,如烧伤,皮肤创伤,和癌症。随着这些缺乏血管,额外的血液支持下面的伤口床需要植皮手术成功的保证。此外,这种技术是伴随着痛苦,痛苦,和肥厚性疤痕形成15]。在过去的几年中,取得了很大的进步在micrograft (MG)治疗,其中许多在临床取得了可喜的成果(16]。传统植皮方法相比,micrograft技术包括可行microtissue片段直接应用于受伤的网站。这种自体治疗报道允许100倍扩张micrograft移植和提供了一个快速和可靠的最小的患者手术过程风险(17]。最近,一种新型MG技术已成为一个创新的和负担得起的治疗伤口,皮肤组织磨成80年的最终解决方案μm microtissue片段包含tissue-residing祖细胞和基质成分(18]。此外,最近的一项研究表明,皮肤损伤的治疗与可溶性MG分数剥夺tissue-residing细胞和高纯度在生长因子(igf - 1和bFGF等)能充分促进内源性皮肤再生能力,加速伤口闭合,显示reepithelialization增加,并增加肉芽形成和CD31增加⁺船的形成(19]。

最近,细胞外signal-regulated激酶(ERK)信号通路已被确认为一个主要的司机这一技术背后的分子机制(19]。MG治疗后,成纤维细胞和角质细胞显示高水平的磷酸化ERK (p-ERK)和基质金属蛋白酶的调节转录的展出。按照这个,MG引发的有利影响是恢复ERK抑制。然而,转录网络连接的详细分子路线图ERK活化和下游目标表达式和迁移能力的提高,在可溶性MG治疗仍然在很大程度上仍是个未知数。

在这项工作中,我们仔细分析背后的分子调控网络加速MG治疗获得的细胞迁移。推出关键转录监管机构参与改善的效果由这种疗法,我们综合差异表达基因(度)获得在5 h治疗无细胞的micrograft方案转化为基因调控网络分析(GSE123829) [19]。有趣的是,MG-dependent度似乎可能受AP-1转录因子的重要成员,如Fra-1。因此,MG-induced纤维母细胞和角化细胞迁移以及基质金属蛋白酶的酶活性明显受损AP-1抑制。最后,我们的研究结果提供的证据表明,AP-1连接ERK活性高和MMP的活动增加,进而调节细胞迁移在成纤维细胞和角质细胞。总的来说,我们的研究提供了一个更深层次的视图到MG治疗背后的分子机制,揭示AP-1的意义及其在当前和未来的发展至关重要的作用在伤口愈合的治疗方法。

2。方法

2.1。细胞培养

尾巴尖(0.5厘米)的C57BL / 6小鼠模型在适当的麻醉(异氟烷)被用来提取主要的成纤维细胞。组织与胶原酶消化IV 40分钟37°C。细胞被培养在DMEM GlutaMax(猫没有。61965 - 026年Gibco生命科学,大岛屿)补充10%的胎牛血清,penicillin-streptomycin 1%, 1%谷酰胺、丙酮酸钠1%,1%非必需的氨基酸。无限增殖角化细胞(HaCaT)细胞系被用作人类细胞角化细胞模型和生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充同样之前的媒体。细胞培养在37°C湿润孵化器5%的股份有限公司₂。

2.2。制备Micrografts

从小鼠皮肤活检Micrografts生成(1厘米²)采用Rigenera®技术。组织使用Rigeneracons被剁碎®组织粉碎机(20.]。结果micrografts随后被过滤到70年μm过滤膜获得5的蛋白质浓度μ克/μL,紧随其后的是一个离心步骤(10分钟在3000 rpm)耗尽的解决居住细胞和细胞碎片。提取的可溶性micrograft然后储存在−80°C,供以后使用。随后,可溶性MGs被稀释1:10日在媒体和应用于纤维母细胞和角化细胞细胞增长。信号通路、转录因子AP-1被抑制MEK抑制剂等药物改变PD0325901 (1μM;猫没有。PZ016σ)和c-fos / AP-1抑制剂t - 5224 (60μM;猫没有。530141-72-1,MedChemExpress (MCE)),分别。

2.3。细胞划痕实验

镀成纤维细胞和角质细胞的密度3500细胞/厘米²和10000细胞/厘米²,分别。划痕试验在细胞单层膜上进行使用吸管,像一个人工在体外伤口(21]。随后,死细胞被使用无菌磷酸盐(PBS)和图像接管时间进程,直到完全关闭在体外划痕。对比图像允许量化细胞的迁移率。出来被添加到细胞对不同治疗时间(1 h, 5 h、12 h)。

2.4。细胞周期分析和细胞生存能力

细胞周期的变化使用5-ethynyl-2进行评估 - - - - - -脱氧尿苷(EdU)分析(热费希尔科学)22]。MG-treated细胞孵化2小时37°C和10μEdU (ethynyl-2 - - - - - -脱氧尿苷)根据制造商的指示(猫。没有900584 - 50毫克,Sigma-Aldrich)。样本然后检查通过流式细胞术(BD生物科学)和分析FlowJo软件。MG-treated细胞的生存能力评估了流式细胞术(BD生物科学)使用可以解决的可行性染色660 (564405;BD生物科学)。统计分析了使用双尾未配对 - - - - - -测试和双向方差分析(方差分析)。没有发现显著差异( 生物复制)。

2.5。免疫组织化学、免疫荧光染色和蛋白质分析

挠细胞和60 - 70%汇合的条件用于免疫组织化学和免疫荧光分析。细胞被固定为4%在RT PFA 20分钟,permeabilized 1% BSA, 0.2% Triton-X在RT PBS 30分钟,反复洗,和阻塞驴血清1:10在PBS(屏蔽解决方案)40分钟RT,一夜之间细胞培养在4°C以下主要抗体:兔子马伯Phospho-Fra-1 (Ser265) (D22B1;CST5841T Bioke-Cell信号)和鼠标马伯Fra-1 (D3;sc - 376148,圣克鲁斯生物技术)使用1:200稀释。随后,细胞被洗PBS和孵化与二级Alexa萤石抗体1 h rt,最后,细胞在赫斯特33342年孵化1:10000稀释核复染色。最后,细胞被安装使用DAKO™安装介质。图片是使用蔡司AxioImager Z1显微镜和AxioVision SE64软件。使用ImageJ图像分析软件(NIH)。

免疫印迹分析被用来公布AP-1复杂的重要蛋白质的作用在调节MG治疗诱导的影响。MG-treated细胞细胞溶解在里帕缓冲区包含1:100蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(猫。没有P8340-1毫升,P5726-1毫升,分别为P0044-1毫升)。样品(30μg蛋白质)在装样heat-denatured缓冲区(Tris-HCl 50 mM, pH值6.8,100毫米德勤,2% SDS, 0.1%溴酚蓝、10%甘油),通过SDS - page和转移到PVDF膜(猫。没有1620177,Bio-Rad)。膜被沾染了朱红色年代染料(Sigma-Aldrich)和屏蔽5% BSA(牛血清白蛋白)TBS (Tris-buffered盐水)补充渐变为0.05% 1小时在一夜之间,沿膜被培养在4°C以下主要抗体:鼠标p-ERK (sc - 7383 1: 1000年,Santa Cruz),兔子ERK (sc - 94 1: 1000年,Santa Cruz), pFra-1 (Phospho-Fra-1 (Ser265) (D22B1)兔马伯;1:1000年,猫。没有CST5841T Bioke-Cell信号),Fra-1 (Fra-1 (d 3)小鼠单克隆抗体1:1000年,猫。没有sc - 376148,圣克鲁斯生物技术)、pJun (Phospho-c-Jun (Ser73) (D47G9) XP®兔子马伯;1:1000年,猫。没有3270 T, Bioke-Cell信号),小君(c-Jun (60 a8)兔马伯;1:1000年,猫。没有9165 t, Bioke-Cell信号),和鼠标Tubulin-alpha(1: 1000年,T5168 Sigma-Aldrich)。 The following day, membranes were incubated with secondary horseradish peroxidase HRP-conjugated antibodies (1 : 5000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), in TBS 0.05% Tween and 2.5% nonfat dry milk. Membranes were stripped and reblotted for the total forms of Erk, Fra-1, and c-Jun. Analyses were performed using the Clarity Western ECL Substrate (Cat. No 1705060, Bio-Rad).

2.6。基质金属蛋白酶(MMP)的酶活性

MMP活性检测使用MMP活性测定工具包(猫没有。ab112146 Abcam),根据制造商的指示。数据表示为RFU(相对荧光单位)。MG治疗后,条件培养基收集后24小时。信号进行酶反应开始后的30分钟使用一个微型板块读者与滤波器组 和规范化的衬底控制。

2.7。Transwell迁移分析

使用0.25% trypsin-EDTA细胞分离,用PBS (1 x)和颗粒状。多个孔板渗透聚碳酸酯膜transwell插入(猫3422号,热费希尔科学)被用于实验。成纤维细胞或角化细胞(10⁵细胞)镀上室的transwell总量为100μL增长的媒体。600年μL(1: 10毫克稀释应用于下议院。100000个细胞(成纤维细胞或角化细胞)在600年被淹没μL完成GlutaMax介质的控制。孵化后,transwell插入被清理的固定细胞,并与70%乙醇固定。之后,膜被沾染了结晶紫的0.1%。最后,膜脱离插入,沉积在幻灯片,并使用DPX安装。图片是使用AxioVision SE64软件在蔡司AxioImager Z1显微镜。使用ImageJ图像分析软件(NIH)。

2.8。RNA提取和信使RNA基因的表达

总RNA纯化使用PureLink®RNA迷你包(猫没有。12183018,生活技术™)根据制造商的指示。从0.5生成的互补μ使用上标3 g的RNA和逆转录酶合成第一链SuperMix(表达载体)。实时定量PCR(存在)进行使用铂®SYBR®绿色存在SuperMix-UDG(猫没有。11733038,热费希尔科学)在ViiA™7实时PCR系统与384孔板(猫没有。4453536,应用生物系统公司)。基因表达值被规范化GAPDH,Rpl13a,β肌动蛋白为主要成纤维细胞和老鼠GAPDH,RPL13A,β肌动蛋白管家基因对人类角质细胞。使用的所有引物是从踊跃购买技术,鲁汶,比利时,报告在表S1。

2.9。核糖核酸测序和生物信息学分析

本文中给出的数据被存入地理数据集下加入。GSE134113。RNA的完整性评估使用生物分析仪(安捷伦2100)RNA结合安捷伦6000纳米装备5067号(Ca - 1511)。样本处理的基因组学核心鲁汶(比利时鲁汶KU Leuven-UZ)。图书馆准备进行使用Illumina公司TruSeq滞留信使rna样品制备设备,根据制造商的协议(猫没有。20020594)。核糖核酸变性进行在65°C,紧随其后的是冷却在4°C。随后,样本索引的多路复用。测序图书馆量化使用量子位荧光计(美国马萨诸塞州热费希尔科学)。库质量和尺寸范围是评估使用生物分析仪(安捷伦科技)与DNA 1000工具包(美国加州安捷伦科技)。图书馆使用Illumina公司HiSeq4000测序平台。 50 bp single-end reads and average of 20 million reads were obtained. Quality control of raw reads was performed with the FastQC v0.11.5. Filtering of adapters was performed using ea-utils v1.2.2.18. The splice-aware alignment was performed with TopHat v2.0.13 against the mouse genome mm10. The number of allowed mismatches was set to two and only unique mapping reads with alignment score of 10 or more were included. Resulting SAM and BAM alignment files were handled with Samtools v0.1.19.24. Quantification of reads per gene was performed with HT-Seq count v0.5.3p3. Count-based differential expression analysis was done using the R-based (The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) Bioconductor package DESeq. Reported值调整为多个Benjamini-Hochberg的测试过程,控制错误发现率(罗斯福)。

2.10。芯片测序分析

公开ChIP-seq Fra-1数据绑定的小鼠胚胎成纤维细胞处理使用的管道Kundaje实验室(0.3.3版)(23]。读取被对齐参考基因组(mm10)使用Bowtie2 (v2.2.6)使用”——本地”参数。单头读取对齐的基因组与映射质量≥30都可用读(读对齐到线粒体基因组被移除)使用SAMtools (v1.2)。PCR重复被使用皮卡德的MarkDuplicates(皮卡v1.126)。报道使用bamCoverage函数计算 并使用RPKM规范化。

2.11。统计分析

统计分析的RNA序列数据统计分析是由bioconductor包DESeq (R-based)。报道值调整为多个Benjamini-Hochberg的测试过程,控制错误发现率(罗斯福)。在所有的实验中,显著差异是由单向方差分析(方差分析),双向方差分析、多重比较,调整和双尾未配对 - - - - - -测试。给出的数据 (SEM)或褶皱(FC)的变化。数据可视化使用GraphPad棱镜6软件(美国圣地亚哥,CA)。

3所示。结果

3.1。AP-1伤口Healing-Associated预计监管机构的成纤维细胞的基因表达

加上免疫细胞,成纤维细胞生长因子释放,立即回应组织损伤,导致周围成纤维细胞和角质细胞迁移对受伤的网站。重建皮肤内稳态,这些细胞恢复受伤的区域配合新组织的形成。这是通过细胞增殖和迁移以及他们的能力通过连续改变细胞外基质合成和分解胶原蛋白(3,6]。

最近的一项研究表明,增加自体micrograft——(AMG)介导的成纤维细胞迁移需要激活ERK信号通路已被证明是由生长因子诱导的可溶性部分出现在micrograft [19]。识别转录监管机构调解这种行为,我们利用度受伤的成年小鼠成纤维细胞治疗的无细胞的分数micrograft治疗(19]。这些基因随后被集成在一个基因调控网络分析使用iRegulon分析软件(24)(图1(一))。最初的转录组分析显示123调节度( ,调整值< 0.05),包括基因参与细胞迁移(即,Cxcl2,Ccl20,Mmp3),血管生成(例如,Ets1,Vegfa,Flt1),细胞周期(例如,Nos2,Ptgs2,生活)和上皮形成(即,Dusp10,Ptgs2,Hmox1)(数据1 (b)和1 (c)、表S2)。

iRegulon分析AMG-dependent度确定Bcl3,Foxc2,Cebpg,Mms19,Foxo6,Crx,Fosl1,Otud4,Plag1作为预测转录因子调节度表达式(图S1A)。有趣的是,在这其中,我们确定了AP-1家庭成员Fosl1、编码Fra-1蛋白质。已报告AP-1转录因子调节基因编码生长因子和基质金属蛋白酶的表达(14]。此外,它已被证明,AP-1活动是由ERK通路(10,25]。由于这些证据,我们决定我们的注意力集中在转录因子的作用AP-1调节MG-mediated伤口愈合。明确,我们发现从转录组分析和基因调控网络分析表明AP-1家人Fra-1可能保留潜在作用的规定背后的分子机制的有益影响可溶性MG治疗(图1 (d))。

来验证预测绑定AP-1的伤口healing-associated基因的启动子转录监管机构,我们用公开ChIP-seq数据调查的能力Fra-1蛋白质绑定几个调节度(图的启动子区域印地)[23]。相应地,我们确认绑定Fra-1多个基因的启动子,等Cxcl2,Ets1,Mmp13,Fosl1本身在小鼠成纤维细胞。总的来说,这些发现提供了强有力的证据,诱导再生AMG-treated成纤维细胞的转录资料很可能受AP-1家族成员。

3.2。通过增加Micrograft治疗诱发AP-1活动Fosl1表达和Fra-1磷酸化

研究报道,缺乏AP-1函数在成纤维细胞和角质细胞导致受损的细胞迁移,细胞增殖,和,反过来,导致延迟伤口关闭(14]。因此,我们的目的是确定无细胞的MG治疗诱发转录活性AP-1通过改变转录水平或转译后的修改在两种细胞类型。

确定AP-1活动的监管在可溶性MG治疗,我们评估了转录水平的家庭成员5和12小时后MG治疗。在成年小鼠成纤维细胞以及上皮/角化细胞(HaCaT)细胞模型,Fosl1和FOSL1分别是唯一AP-1因素明显调节治疗在转录水平(图2(一个))。尽管增加安全系数的表达水平和小君AP-1基因导致更高的激活,转译后的监管AP-1家庭成员也大大有助于其活动。AP-1成员蛋白质的dna结合特性和他们的转录活动强烈依赖于转译后的磷酸化,我们评估的水平磷酸化Fra-1 (pFra-1)在小鼠成纤维细胞和Fra-1 (pFra-1)在人类角质细胞MG治疗[1和5 h后11,26]。免疫染色和免疫印迹分析显示增加总Fra-1和磷酸化Fra-1 265年丝氨酸残基,这可能表明,新成立的立即Fra-1蛋白质转译后的修改在MG治疗(数字2 (b),2 (c),2 (d))。

最优Fra-1是高度依赖的转录活动绑定到6月家族的成员。作为这个家庭的最有效的转录监管机构,c-JunmRNA水平出现显著增加5 h后MG治疗受伤的小鼠成纤维细胞(图2(一个))。随后,我们调查是否c-Jun AP-1复杂的一部分,也是转译后的监管在治疗micrograft解决方案。角化细胞和成纤维细胞,增加磷酸化水平的c-Jun / c-Jun 1 h和5 h后观察治疗(数字2 (c)和2 (d))。

综上所述,我们证明转译后的活动Fra-1和c-Jun成纤维细胞和角质细胞增加可溶性MG治疗。这表明这些AP-1成员参与MG治疗的分子机制和在前面显示AMG-dependent加速伤口愈合19]。

3.3。Micrograft-Induced AP-1抑制细胞迁移是恢复

最近,它已经表明,自体的可溶性分数micrograft (AMG)治疗受伤的小鼠成人成纤维细胞导致增加在体外细胞迁移和MMP的活动,导致一种改进在体外闭包容量和一种改进的在活的有机体内伤口愈合(19]。随着预测转录因子AP-1调节细胞迁移,我们评估其参与加速MG-mediated划痕关闭通过评估MG-treated小鼠初级成人成纤维细胞的迁移能力和人类HaCaT细胞使用在体外细胞划痕实验存在与否的具体c-Fos / AP-1抑制剂t - 5224(数据3(一个)- - - - - -3 (e))[27]。AP-1抑制明显推迟了在体外闭包在MG-treated成纤维细胞(数据3(一个)和3 (b))。同样,MG-treated角质细胞表现出显著的延迟在scratch中关闭5 h和12 h(治疗后AP-1抑制剂的存在,表明AP-1的至关重要的作用在调节细胞类型(数据的迁移能力3 (c)- - - - - -3 (e))。

有趣的是,transwell MG-treated成纤维细胞和角质细胞的迁移试验显示显著降低在AP-1抑制细胞迁移(数据3 (f)和3 (g)分别)。这可能表明AP-1抑制的基本差别导致对这些趋化因子受体,导致受损的细胞迁移。集体,我们表明,抑制AP-1直接导致受损的细胞迁移,完全恢复MG治疗的影响成纤维细胞和角质细胞的迁移能力。

3.4。Micrograft-Accelerated划痕关闭通过AP-1活动并不取决于纤维母细胞细胞增殖

随着AP-1家庭被描述规范迁移和扩散(14),我们评估可能的变化在细胞周期调控细胞增殖的研究贡献在体外闭包。

确定的角色在细胞增殖AP-1 MG-treated游离条件,我们进行了细胞周期评估使用5-ethynyl-2可溶性MG-treated增殖成纤维细胞和角质细胞 - - - - - -脱氧尿苷(EdU)测定AP-1抑制剂的存在t - 5224。有趣的是,没有在MG-treated观察成纤维细胞细胞周期的变化阶段和整体增殖率保持不变(图4(一))。相比之下,MG-treated角质细胞显示s阶段的细胞数量减少,表明减少细胞增殖的角化细胞MG治疗(图4 (b))。此外,我们表明,MG治疗AP-1抑制不改变细胞生存能力在两个细胞类型(数据4 (c)和4 (d))。因此,我们排除的参与AP-1可溶性MG治疗在促进细胞增殖在体外。

3.5。Micrograft治疗调节矩阵改造机械AP-1-Dependent地

在治疗过程中,细胞迁移和活跃的细胞外基质(ECM)重塑代表关键事件成功的伤口愈合。因此,我们的目的是评估AP-1活动对基质金属蛋白酶的酶功能的影响。最近,它已被证明,基本伤口healing-associated基因,如细胞因子、基质金属蛋白酶,强烈调节AMG治疗(19]。在转录分析的数据集,这些反过来似乎目标AP-1(数字1 (b)和1 (d)和图印地)。另外,以往的经验显示,AMG治疗,MMP的表达水平及其酶活性显著增加(19]。有报道称AP-1为调节多个基因的表达水平,包括编码基质金属蛋白酶(14),我们决定基质金属蛋白酶的可溶性MG-induced活动是否AP-1依赖。MG-treated成纤维细胞和角质细胞游离cocultured AP-1抑制剂的存在t - 5224。有趣的是,我们观察到在MG-treated AP-1抑制成纤维细胞和角质细胞表达显著降低转录水平的几个MMP成员5 h和12 h(治疗后(数字5(一个)和5 (c))。随后,我们暴露了成纤维细胞和角质细胞在体外划痕试验没有AP-1 MG方案治疗和抑制。收集到的条件培养基从这些条件被用来执行一个荧光技术分析来确定基质金属蛋白酶的酶活性。值得注意的是,酶活性是在很大程度上阻碍了在AP-1抑制成纤维细胞和角质细胞(数字5 (b)和5 (d))。这些发现表明,AP-1 MG-induced细胞迁移可能发挥核心作用,更重要的是,这种联系可能解释改善伤口愈合在MG治疗游离。

3.6。AP-1转录活动负责ERK-Mediated Micrograft治疗伤口愈合

伤口愈合过程增强了可溶性MG已经证明是诱导ERK-dependent地(19]。进一步解开下游机制在转录水平的治疗,我们显示转录因子的重要性AP-1在调节细胞迁移和MMP在MG治疗活动。有报道称它为AP-1受兵,我们评估本条例是否发生在MG-treated成纤维细胞和角质细胞(11,12]。因此,我们决定转译后的修改重要AP-1家庭成员,包括老鼠和人类的磷酸化同系物Fra-1和c-Jun PD0325901 MEK抑制剂的存在。

有趣的是,在抑制ERK MG-treated细胞,减少水平的观察pFra-1 / pFra-1 pJun / pJun不减少(图6(一))。这可能表明,形成涉及Fra-1调节ERK-dependent MG治疗的影响。要验证这一点,我们对MG-treated受伤的成纤维细胞进行RNA序列的存在与否MEK抑制剂PD0325901(图6 (b))。使用DEG-derived条款,表达式的值基因参与细胞迁移、血管生成、细胞周期和上皮形成转录变化对MEK抑制(图显示清楚6 (c))。当这些基因是已知差异表达在micrograft治疗(19),我们评估这些基因是否受到MEK抑制的影响。尽管一些至关重要的血管生成的基因(例如,Vegfa和Flt1)被抑制,改变多种基因参与细胞迁移有显著影响PD0325901治疗后,确认可溶性MG治疗主要是增加了细胞迁移。此外,高水平的Fosl1和Junb后被下调MEK抑制,可能减少与细胞迁移的变化。

4所示。讨论

皮肤损伤和受损组织再生激烈的金融和医疗后果的病人,micrografts (MG)提供一个负担得起的治疗援助内生伤口愈合。尽管多个MG系统已经被证明是成功的在临床试验中,这些技巧背后的分子机制仍不清楚(16]。之前,它已经表明,自体游离毫克(AMG)治疗改善ERK-dependent细胞迁移和矩阵重构,导致加速伤口关闭在体外和在活的有机体内(19]。然而,下游可溶性MG-induced背后的转录调控机制尚未探索细胞变化。

在目前的工作,我们确定了AP-1其他转录因子负责建立再生转录成纤维细胞(图概要文件1)和角化细胞。尽管抑制AP-1活动导致大幅减少细胞迁移和损失的转录程序支持矩阵重构,我们不排除间接影响引发了AP-1和其他重要的转录因子的贡献提高可溶性MG-induced伤口愈合。作为另一个预计监管机构的识别度,B细胞淋巴瘤3 (Bcl3)已被证明能够促进伤口愈合的降价导致显著降低人类骨肉瘤U2OS细胞增殖和迁移线(28]。此外,角化细胞迁移已经证明是大大受损CAAT enhancer-binding蛋白γ(C / EBPγ)沉默29日]。除了细胞迁移,特异表达基因参与其他伤口愈合过程可能受其他预测TFs。例如,Forkhead盒蛋白质C2(Foxc2)是一个已知的调节器的血管生成在伤口愈合和口腔鳞状细胞癌(30.,31日]。然而,作为AP-1调节MMP活性和细胞迁移,另外受ERK信号,我们我们的注意力瞄准AP-1复杂的成员Fosl1。

在MG治疗,游离Fosl1/FOSL1转录水平和磷酸化Fra-1和Fra-1导致高架AP-1活动在成纤维细胞和角质细胞(数字2(一个),2 (c),2 (d))。激活蛋白1 (AP-1)是由复杂的homo和亮氨酸拉链蛋白质形成一个安全系数小君家族的家庭成员结合蛋白(32]。而小君家庭能够为形式,Fos蛋白限制提交与小君成员(二聚33]。二聚,AP-1结合12-O-tetradecanoate-13-acetate (TPA)响应元素(混乱关系)在基因组内,尽管其转录行为强烈依赖于二聚体成分及其磷酸化(13]。Fra-1可能形成AP-1复杂通过与最有效的Jun蛋白c-Jun二聚,c-Jun磷酸化(pJun)发现增加可溶性MG治疗。而据报道,c-Jun表达后的影响最小在体外受伤,”丛书基因的mRNA水平升高后不久发现损伤(34]。在这些安全系数,c-Fos和Fosl1已报告是简要表述为立即响应细胞外刺激,有利于伤口的恢复启动healing-associated基因的表达,如生长因子、基质金属蛋白酶、整合蛋白(14]。因此,在特定的AP-1抑制,可溶性MG-induced划痕关闭完全恢复,和细胞迁移能力显示高度受损(图3)。值得注意的是,一个轻微的MG-dependent减少扩散是显示在治疗角化细胞。然而,随着MG治疗以及AP-1感应没有增加细胞增殖,我们肯定,细胞周期的变化并没有导致加速在体外伤口关闭AP-1-dependent(图的一种方式4)。此外,矩阵重构酶的酶活性(基质金属蛋白酶)是严重危害AP-1抑制剂存在的t - 5224(图5)。有趣的是,减少Fra-1表达报道导致降低MMP的表达和细胞迁移35,36]。此外,过度Fra-1显著提高细胞活性和侵袭性癌症(37,38]。综上所述,这些研究结果支持Fra-1 / AP-1的作用在调节细胞迁移在伤口愈合的背景下为矩阵重构和整合素表达促进细胞运动通过矩阵。

转录调节Fos蛋白发生主要通过MAPK提交活动作为响应促有丝分裂的线索。作为响应细胞外信号,三元复杂因素(TCF)磷酸化ERK使其绑定一起SRE-binding因素(SRF)血清反应元素(行为)的启动子区域”丛书基因。此外,据报道,AP-1能够autoregulate本身通过绑定的启动子区域”丛书基因和c-Jun(39- - - - - -41]。除了转录调控,AP-1成员是转录后的磷酸化通过MAPK组件,从而减少了泛素化和转录活动增加42,43]。研究表明,JNK-mediated磷酸化丝氨酸的63年和73年的残渣c-Jun增加稳定性和活动(42,44]。同样,Fra-1稳定性取决于磷酸化丝氨酸ERK1/2信号(252年和265年的45]。此外,由ERK1/2导致更高的安全系数活动蛋白质磷酸化(46,47]。在这项工作中,我们确认MG-induced磷酸化Fra-1强烈依赖ERK1/2活动的成纤维细胞和角质细胞(图6(一))。此外,我们报告磷酸化和总Fra-1水平下降ERK抑制剂的存在,确认ERK-dependent转录后的调控Fosl1 -编码的蛋白质。值得注意,MG-induced磷酸化水平的游离c-Jun似乎独立的ERK,暗示其监管通过其他机制。如前所述,MAPK级联的物分支可以负责这个增加,作为物有助于AP-1表达式在接触机械应力,在这种情况下在体外伤害(48]。最后,RNA-seq数据显示ERK抑制大大削弱MG-treated成人成纤维细胞的迁移转录概况。因为大多数这些度预测受AP-1(图1),这可能表明,可溶性MG-enhanced细胞迁移出现AP-1的转录活动的结果。

背后的集体,我们提出一个模式的行动加速伤口愈合颗粒MG治疗(图的使用7)。我们的研究结果表明,可溶性MG-induced ERK信号有一个双重机制来调节矩阵重构和细胞迁移AP-1通过转录活动。ERK信号被激活在毫克解决方案治疗,这种级联导致基因表达的增加Fosl1,导致更高的转录因子Fra-1 / AP-1。这反过来成为由活跃转录后的磷酸化ERK信号。磷酸化AP-1随后触发迁移表型在角质细胞和纤维母细胞通过MMP活性和转录的激活程序支持趋化性和细胞的能动性。虽然其他信号通路和转录因子可能会造成这一表型,我们表明,抑制ERK和AP-1足以完全恢复在体外由可溶性MG治疗伤口关闭。总之,我们的研究结果强调AP-1 ERK-dependent转录活动的至关重要的作用在协调MG治疗的有利影响,为未来的伤口愈合的研究开启了新的机会。

数据可用性

本文中给出的数据被存入地理数据集下加入。GSE134113。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

M.B.设计执行的实验和分析,免疫荧光、酶活性测定transwell迁移试验,。J.S.H.C. RNA序列和芯片测序和分析执行和分析qPCR数据并准备手稿。公共广播进行免疫印迹分析。W.A.A.d.O. EdU和分析进行分析和可行性评估。Y.E.L.和量化transwell试验执行的。F.L.L.,硕士,J.S.H.C., and M.B. designed the experiments and edited and revised the manuscript. All authors provided input in the design of the experiments and cowriting of the manuscript and have edited it. Martina Balli and Jonathan Sai-Hong Chui are co-first authors. Frederic LLuis and Maurilio Sampaolesi are co-last authors.

确认

我们感谢支持KU鲁汶格兰特(STG)开始,KU鲁汶C1基金(C14/16/078)和FWO (G097618N)基金F.L.L.;J.S.H.C. FWO-SB奖学金(1 s65319n);和W.A.A.d.O FWO奖学金(1155619 n)。硕士支持北约的贡献授予“RAWINTS”项目# G984961, FWO (G088715N #, G060612N #和# G0A8813N), CARIPLO基金会# 2015,C1基金(C14/17/111)。

补充材料

补充1。表S1:引物序列用于确定mRNA水平在小鼠成纤维细胞和角质细胞。5序列表示 - - - - - -3方向。

补充2。表S2:差异表达基因的列表(不受监管,表达下调,nondifferentially表示)在5 h micrograft治疗(如在图表示1)。

补充3。图S1: (A)预测转录因子被iRegulon尽可能监管者MG-treated度发现的条件。转录因子预测是网络浓缩得分(NES)。(B) ChIP-seq显示绑定Fra-1 / AP-1的启动子区域里几个调节度参与伤口愈合过程,预测受AP-1 iRegulon分析。

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版权

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