集落形成、迁移和分化的特点Multipotential基质细胞(msc)从“临床访问”相比,人工骨膜Donor-Matched骨髓msc

文摘

骨膜对骨折愈合至关重要,作为一个高度血管和multipotential基质细胞——(MSC)丰富的组织。在外科骨重建、骨膜碎片可以“临床访问,”然而骨膜目前不是ultilised,与自体骨髓(BM)吸入。本研究旨在比较人类骨膜和donor-matched髂骨BM MSC描述内容和MSC集落形成、生长动力学、表型、细胞迁移模式和trilineage分化能力。“临床访问”骨膜完整的外层纤维层,包含CD271 + msc坐落perivasculary候选人;内形成层很少。酶释放细胞后,骨膜形成小得多的成纤维细胞的殖民地BM相比(6.1毫米²与15.5毫米², , )。骨膜殖民地更同质的大小(范围2 - 30毫米²与2-54毫米²)和更频繁的平均2500倍(2.0%比0.0008%, , )相对于总可行的细胞。当扩展在体外,类似的增长率通道0 (P0)被认为(1.8人口倍增(PDs)(骨膜),每天每天1.6 PDs (BM));然而,随后BM msc激增明显慢P4(每天4.3 PDs(骨膜)与9.3每天PDs (BM), , )。在早期的文化、骨膜细胞不如BM细胞迁移速度较慢。MSC类型表现出MSC表型和trilineage分化能力;然而,骨膜msc显示显著降低(2.7倍)脂肪形成的潜在的基于尼罗红:DAPI比率与adipogenesis-related成绩单的表达式PPAR-γ。,这些数据表明“临床访问”骨膜样品代表了不断丰富的高度增殖的msc相比donor-matched BM,重要的是显示类似骨软骨和低脂肪形成的潜在能力。活细胞跟踪允许测定骨膜msc的独特形态和迁移特征,可用于开发新型植骨替代品被这些细胞优先添满。

1。介绍

骨折不愈合是一个重要的临床挑战。据报道,骨折不愈合率是2至10%的骨折,依赖于骨折类型,位置,和病人的人口统计1,2]。其治疗不仅是昂贵的医疗服务提供者(3),但重要的是病人通过盈利和损失高抑郁,所有这些将对生活质量有不利影响4]。因此,改进标准治疗需要治疗的骨折和最近开发了基于钻石概念框架(5),把人的注意力吸引到了确保所有的存在的重要性:成骨细胞,综合分析支架,有成骨生长因子和稳定的力学环境现场的治疗(5]。最常见,成骨细胞的形式交付给骨折的部位骨髓抽出物(BMA), BMA集中(BMAC),或与嫁接结合BMAC材料来填补大缺陷与骨折修复[援助6- - - - - -10]。

骨膜的至关重要的作用在骨折愈合。骨折后骨膜反应增厚和进入增殖状态(11- - - - - -13]。Periosteal-derived祖细胞迁移到骨折血肿在早期,在那里他们分化成成骨细胞和软骨细胞,直接导致骨再生(12]。骨膜剥离在断裂或损坏导致降低愈伤组织形成或延迟愈合13- - - - - -16]。然而,尽管骨膜的已知的重要影响在骨折修复过程中,使用periosteal-derived细胞进行手术修复骨折,骨折不愈合或临界大小骨缺陷仍未开发的。

大多数骨头的骨膜行外方面,导致软骨发育在童年和青春期以及提供血管供应骨(14]。这组织,虽然薄,形成两种截然不同的层,骨衬里内形成层层高度细胞和含成骨的祖细胞,而外层纤维层,主要包括胶原蛋白、高度血管但不是特别细胞相比12,17]。形成层层紧密连接到底层骨Sharpey的纤维;因此,去除附着形成层的骨膜层是困难的18外科医生),而且被认为是不合适的,可能损害修复过程。然而,“临床访问“骨膜的样本,可能是纤维的性质,可以作为副产品获得骨折外科清创术的网站,但其成骨的祖细胞之前尚未探索的内容。

本研究的目的是调查“临床访问”样本人力骨膜成骨的祖multipotential基质细胞的存在(msc)和比较它们的功能能力和髂骨BMA样本相同的捐助者。

2。材料和方法

2.1。组织收集和处理

Donor-matched骨膜和BMA的样本来自12例治疗骨折不愈合(平均年龄49岁,范围17 - 80)在创伤骨科单位利兹总医院,英国利兹。骨膜(大约50毫米²,0.3 g)是从附近的骨折使用手术刀,BMA(体积范围益毫升)是前髂骨的吸气。髂嵴骨小梁(大约1厘米³)收集从三个病人,接受自体采购。伦理批准了由国家研究伦理Committee-Leeds东部,与伦理批准文号06 / Q1206/127和所有患者知情同意书。

提取的骨膜,BMA-resident有核细胞,BMA接受处理氯化铵(干细胞技术)红细胞溶解。短暂4毫升的氯化铵溶液添加每毫升BMA和孵化10分钟在冰上。细胞通过离心浓缩(650克,5分钟)。骨膜样本在胶原酶消化(600 U / mL,干细胞技术)在0.1 g的组织比0.5毫升的胶原酶,4 h,孵化在37°C, 5%的公司₂。消化后,细胞悬液是通过70年μm细胞过滤器去除大的碎片;通过离心细胞悬液集中(650克,5分钟)。细胞被直接使用在体外化验,在后续章节中描述。

2.2。组织学的骨膜

人类骨膜和髂嵴骨样本每周固定在3.75%的甲醛,和髂嵴骨下使用0.1 EDTA脱钙。随后,在石蜡样本嵌入,5μ米厚的幻灯片(SuperFrost加上幻灯片)生产。幻灯片是脱蜡和水化使用标准方法,其次是对苏木精和伊红染色和picro天狼星红。样品也染色CD271 (1: 20, NGFRS Abcam),人们标记bone-resident msc (19]。抗原检索进行了使用10毫米/ L柠檬酸缓冲,并使用Dako设想进行了免疫组织化学工具包(Dako),按照制造商的指导方针。染色,幻灯片是脱水和清除二甲苯和盖玻片覆盖,使用DPX(σ)。幻灯片使用光学显微镜成像(AxioCam MRc5,蔡司)和偏振光。

2.3。克隆形成纤维母细胞(CFU-F)测定

BMA CFU-F分析被用来量化克隆形成细胞和骨膜消化样品和表现如前所述20.,21]。14天后文化在StemMACS MSC扩张媒体(Miltenyi研究,补充了青霉素链霉素1%),重复的菜是固定的,染色(20.),扫描。菌落数和殖民地表面积是量化使用ImageJ [22]。殖民地的表面积的频率分布是绘制使用棱镜。殖民地的传播面积分布数据量化使用“半宽度”(应用值(23]。

2.4。MSC扩张和表面标记描述

初步处理后,有核细胞BMA和骨膜被镀的密度 每厘米²和 每厘米²分别和孵化37°C, 5%的公司₂在StemMACS媒体。48小时后,媒体所取代,细胞培养,直到60 - 80%融合两周一次的一半介质变化;烧瓶trypsinised和受移植者的细胞密度 为骨膜(24), BM [256),这是重复,直到通过。人口翻倍(PD)通道0 (< P0)和后段0 (> P0)计算如下: 和 按照牧师et al。26]。

确认的MSC性质扩大细胞,流式细胞仪的donor-matched BM和骨膜文化进行了使用抗体选择符合国际社会细胞疗法(ISCT)批准面板(补充表1)[27),正如前面所描述的28]。总之,trypsinised细胞resuspended阻碍缓冲区(10%的小鼠血清,1%的人类免疫球蛋白在流式细胞仪缓冲区(0.1% BSA,叠氮化钠0.01%,0.5米EDTA在PBS)) 15分钟在RT和沾抗体(补充表1)30分钟在冰上。在流式细胞仪缓冲一洗之后,500年resuspended细胞μL 4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)缓冲区可以分析一个LSRII流式细胞分析仪(BD Pharmingen)。数据分析使用流式细胞仪天后软件。

2.5。在体外Trilineage分化分析

培养细胞(通道1 - 3)donor-matched骨膜和BM接受trilineage分化的评估;OsteoDIFF、AdipoDIFF ChondroDIFF媒体(Miltenyi研究)被用来诱导分化。骨( 捐助者),2600个细胞/厘米²被镀到7复制平底井和孵化在37°C, 5%的公司₂OsteoDIFF 2或3周,每周两次的,一半介质的变化。在两周内,碱性磷酸酶(ALP)活性检测快速使用蓝色。在三个星期,钙沉积和茜素红染色(29日)和钙含量测定,如前所述[28]。三捐助者,成立了一个额外的测量DNA含量、细胞细胞溶解于200年μL Triton-X 100年的0.1%,和DNA内容使用PicoGreen量化分析(热科学)30.]。

脂肪生成化验被播种在4200个细胞/厘米²5复制平底盘子,孵化在37°C, 5%的股份有限公司₂,一半介质(AdipoDIFF)变化进行每周两次的为3周。3周后,板被固定用3.75%甲醛和沾油红色( 捐助者)或尼罗红和DAPI ( 捐助者)[31日),后者是量化使用贝特()和尼罗红荧光板读者吸光度水平正常化DAPI吸收水平建立尼罗红/ DAPI比率(31日]。

Chondrogenic化验( 捐助者)进行了5复制1.5毫升螺帽埃普多夫管; 细胞被添加到每个管和离心机(800克,5分钟)来创建一个小球和在ChondroDIFF resuspended媒体文化。管被放置在一个孵化器在37°C, 5%的公司₂3周,一半媒介改变了三次一个星期。3周后,2球被临时冻结在10月,减少使用低温恒温器(徕卡生物系统),组织学上和干幻灯片,用甲苯胺蓝染色笑料。剩下的三个球在木瓜蛋白酶消化消化缓冲一夜之间在65°C,和使用硫酸化插科打诨插科打诨内容量化分析工具(Blyscan),如前所述[28]。

额外的井或颗粒被设置为每个trilineage分化试验3捐助者允许变化的量化谱系标记后分化诱导表达的关键。细胞细胞溶解和RNA孤立使用单一细胞RNA净化设备(一起)和列DNase(应用生物系统公司)治疗。互补脱氧核糖核酸是使用高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)使用TaqMan化验:骨markers-runt-related转录因子2 (RUNX2)和骨gamma-carboxyglutamate (gla)蛋白质(BGLAP);2型,软骨形成markers-collagenα1 (COL2A1性别决定地区)和SRY (Y)盒9 (Sox9);和脂肪生成markers-fatty结合蛋白4 (FABP4)和过氧物酶体proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-γ)。真正的time-PCR反应(rt - PCR)运行使用QuantStudio™7 Flex实时PCR系统和SDS软件,实时记录荧光。使用2进行了分析^{- - - - - -Δ(Ct)}方法,计算正常基因表达(次黄嘌呤正常化phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)表达式)(32]。

2.6。实时全息成像

P0瓶donor-matched(男,17岁)BM和骨膜msc被播种一式两份(250细胞/)到Lumox®多井24-well细胞培养板(Sarstedt)。3天文化发展的37°C, 5%的公司₂在StemMACS媒体。3天半中改变后,板盖子换成了φHoloLids™成像封面(φ,相位全息成像)(EtOH消毒在70%,10分钟)。板被放置到xy HoloMonitor M4显微镜的机动阶段,设置在一个孵化器。使用Hstudio软件,手动三坐标在每一集中,设置为自动图像每小时2天。

收购后,Hstudio软件应用的“面具”图像,阈值是区分细胞从井底,允许细胞自动识别。自动细胞数量分配允许个人细胞跟踪随着时间的推移,这是手动检查。所有输出都导出为Excel文件并使用棱镜绘制。

2.7。统计分析

比较donor-matched骨膜和BM样本,统计分析进行了使用适当的配对测试(Wilcoxon符号秩检验或配对测试根据数据分布), 被认为是显著的。相位全息成像数据集比较使用一个未配对的学生的 - - - - - -测试。确切的测试图中指定的传说,和数据 。

3所示。结果

3.1。位置CD271 +候选人msc在人类骨膜和髂嵴骨

人类骨膜(样品的结构 ),取自股骨和肱骨( ),大约5厘米从骨折不愈合骨折网站(在开放手术)评估。捐赠者的平均年龄 年(范围、23 - 80年),和骨膜样本收获 周后初始损伤,每个病人都有经历了0 - 2以前的骨科手术(表1)。在所有的样品,除了一个(男,47)(数据1(一)- - - - - -1 (c)),没有形成层层可以看到,反映出的优惠收获骨膜纤维层,如预期。当一个完整的形成层层(数据1(一)和1 (b)所示),它是连接到底层的骨头。在这里,可以明显分为骨膜骨衬里形成层层和纤维层面临的肌肉。

调查候选人的位置msc在骨膜CD271染色。CD271积极性被发现在骨膜的两层,局部血管的外缘(图1 (c))。CD271积极性也出现在大英博物馆的蛀牙控制髂嵴骨(图1 (d))[33]。

3.2。集落形成和生长动力学Periosteum-Derived文化

CFU-F化验进行量化集落形成的MSC频率作为衡量donor-matched髂骨BM和骨膜样本( )(数据2(一个)和2 (b))。捐赠者的平均年龄 年(范围,17 - 74年),骨膜收获主要来自股骨( ),而且胫骨( )和肱骨( ),所有骨折不愈合的情况下, 周后初始损伤,患者经历了0 - 2以前的骨科手术。

在大英博物馆,CFU-F频率与平均总有核细胞 与先前的研究一致(21,34]。在donor-matched骨膜消化,CFU-F频率显著( ,Wilcoxon符号秩检验)高(2500倍)( )(图2 (b))。

为了评估群体形成的视觉差异(图2(一个)),殖民地表面积是量化,从包含20多个殖民地(donor-matched菜 )。骨膜殖民地更均匀,更小的粒度分布与BM殖民地(图2 (c)),这是更多的异构和大。骨膜殖民地小得多 (范围2.0 - -29.6毫米²)相比,BM殖民地 (范围2.1 - -54.3毫米²)(成对的学生的 - - - - - -测试中, )(图2 (d))。特别感兴趣的是BM更大的一个子集 ,占 BM的殖民地,在未见骨膜样本。

增长动力学donor-matched BM和骨膜文化下调查,和两个明确的增长模式是明显的(数字2 (e)和2 (f)),因此分裂之前P0 (< P0)和之后P0 (> P0)分析。增长率衡量PDs每天< P0 BM之间的文化是相似的( 天/ PD)和骨膜( 天/ PD),也显示通过类似的山坡坡度(0.50 (BM)和0.52 (P))线性回归分析(值,0.87 (BM)和0.91(骨膜))(图2 (e))。然而,可以看到差异量化后的PDs P0;BM文化开始较低数量的msc与骨膜(图2 (b)),因此经历明显高于PDs (BM: PDs P0,骨膜: PDs P0, Wilcoxon符号秩检验, )。

第一段后,PD速度显著放缓(P1-P4)两种文化类型(数据2 (e)和2 (f)),P4扩散率降低 天/ PD (BM)和 天/ PD(骨膜(图)2 (f))。ISCT MSC表型测试donor-matched文化(27在通道4],这两种文化类型> 91%为MSC标记阳性CD73 (ecto-5 - - - - - -NT), CD90 (Thy1)和CD105 (Endoglin)和< 3%阳性造血谱系标记:CD14(单核细胞分化抗原),CD19(淋巴球抗原),CD34造血祖细胞抗原,CD45(造血的细胞标记),和HLA-DR (MHC II类细胞表面受体)(图2 (g))。

总的来说,这些数据显示CFU-F含量高和更同质的克隆形成“临床访问”骨膜细胞样本,相比donor-matched BM样本。此外,在我们的实验条件选择,骨膜MSC文化累积PDs取得低于BM同行在同一通道。

3.3。活细胞跟踪骨膜、骨髓MSC的文化

探索如果观察到的差异在殖民地大小骨膜和BM msc之间可能是由于不同的细胞迁移模式、活细胞成像和跟踪的细胞运动是用全息成像。解冻P0细胞培养(以前在培养13天,6.6 PD(骨膜)和13 PD (BM))是追踪从一个捐赠(男,17)。解冻刚消化骨膜文化增长,证明是不重要P0同行(数据未显示);因此,P0文化作为代理代表MSC移植文化长达2周(CFU-F试验的结束时间点)。

个人阈值图像和识别的细胞后,细胞的形态在每个文化可以量化和比较。都有两个不同的细胞形态在MSC。第一个是“分裂”细胞(图3(一个)),平均细胞厚度高(> 2.5μ米),但一个小细胞表面面积(< 1100μ米²),反映出球形细胞分裂之前,由2.05%(骨膜)和2.12% (BM)的所有细胞(数字3 (b)和3 (c))。第二,形成多数(97.95%:骨膜,97.88%:BM),是“主轴——”形状的细胞(图3(一个)),代表古典MSC形态,平均细胞厚度0.6 - -2.5μm和细胞表面面积从79到2965μ米²(表2)。

对于“分裂”细胞,骨膜细胞的平均厚度( μ米)高(未配对的学生的 - - - - - -测试中, )比BM细胞( μ米);然而,细胞表面积相似(表2)。此外,骨膜“主轴——”形状的细胞有显著较高的细胞表面和细胞厚度(未配对的学生的 - - - - - -测试中, )而细胞群体。总的来说,这些数据表明,骨膜细胞msc似乎有更大的细胞体积比BM同行。

骨膜细胞迁移和运动模式和BM msc被现场跟踪评估单个细胞。细胞运动的地图(图4(一))显示视觉MSC单个细胞的迁移模式的差异,即一些细胞相对nonmigratory,剩下的在同一地区,和其他细胞迁移的视野。细胞迁移是指的位移跟踪细胞从第一测量坐标,相比“左旋肉碱”,指的是在每个时间点累积行驶距离。从三个字段/文化,整个细胞群是量化计算超过25小时,意味着细胞迁移以及分成迁徙(> 100μ细胞迁移)或nonmigratory (< 100μm细胞迁移(图)细胞4(一))。

跟踪迁移模式的变化随着时间的推移,意味着细胞迁移5到20小时后细胞跟踪比较。BM msc显示更高意味着细胞迁移(未配对的学生的 - - - - - -测试中, (5小时), 在5个小时(20小时))( μm (BM), μ米(骨膜))和20个小时( μm (BM)和 μm(骨膜))(图4 (b))。与细胞的能动性也出现了类似的趋势,BM msc是随着时间的推移更能动的(未配对的学生 - - - - - -测试中, )。在5个小时,复合左旋肉碱(路程) μ米(BM)相比 μm(骨膜),20个小时,这种差异增加了 μm (BM)和 μ米(骨膜(图)4 (c))。

的比例nonmigratory骨膜内迁徙msc和BM文化为42% ( )和63% ( ),分别,暗示有一个稍低的比例在骨膜细胞分为nonmigratory文化(表3)。当比较nonmigratory迁徙msc随着时间的推移,显著增加细胞迁移或位移的初始跟踪点之间被认为从5个小时起文化的迁徙和nonmigratory细胞类型(未配对的学生 - - - - - -测试中, )(图4 (b))。类似的趋势被认为,细胞迁移以线性方式稳步上升,然后开始高原;然而,尽管高原被约8小时(> 100μ(< 100 m)和5小时μ米)对BM文化,这是扩展到约15小时(< 100μ米)或不为> 100定义μ米内骨膜文化(图4 (b))。

基于这些数据,可以得出的结论是,细胞迁移不仅是“快”BM msc骨膜同行相比也“远”跟踪起始点(大约190年μ米(BM)和150μm(骨膜))(图4 (b)),表明细胞运动的速度是在BM文化。

显著增加细胞活性或距离(而不是位移)随时间迁移被迁徙的细胞(> 100μ米),而nonmigratory细胞(< 100μ米)从5个小时起(未配对的学生的 - - - - - -测试中, ),无论文化类型(图4 (c))。左旋肉碱是线性的,不管移民类,为两种文化类型的值> 0.994。因此,细胞的速度(μm / h)从细胞运动性的梯度计算图(图4 (c));正如所料,细胞迁移的速度高于nonmigratory细胞(表3)。此外,BM msc被证明在22.3迁移μm / h (< 100μ米)或32.0μm / h (> 100μ米),确认BM msc与移动速度大于骨膜msc (17.5μm / h (< 100μ20.4米),μm / h (> 100μ米))(表3)。

直接迁移是迁移(位移)的比率运动性(距离),1是指运动在一条直线和0细胞移动完全随机。这个参数可以用来计算细胞迁移是否随机或明显”的目的。“在前面的参数相比,MSC文化类型之间没有显著差异被认为随着时间的推移(图4 (d))。细胞迁移直接降低随着时间的推移,nonmigratory细胞表现出显著降低细胞直接在5和10个小时的MSC类型(未配对的学生 - - - - - -测试中, );然而,在这之后,并没有差异,暗示,随着时间的推移MSC类型迁移更随机。

总的来说,这些数据提供了新的见解BM和骨膜MSC行为文化。小卷的BM msc可以促进他们更快的迁移能力,进而形成更大的殖民地,在一定程度上解释他们的能力与骨膜msc相比,在标准CFU-F化验。

3.4。MSC分化能力

定量trilineage分化进行化验donor-matched文化除了qPCR lineage-specific标记比较0(分化之前)和天21(分化诱导后三周)。成骨的文化被染色高山两周后三周后钙沉积,在视觉上可以看到类似的染色两种文化类型,与倾向于视觉更高confluency骨膜文化(图5 (b))。钙含量是量化( )在三周内被发现略高(但不显著,Wilcoxon符号秩检验, )在骨膜BM文化。值得注意的是,有高捐赠变化没有显示与供体年龄(值,0.17 (BM), 0.22(骨膜))。qPCR显示减少早期成骨的标记,RUNX2表达,但后期增加成骨的标记BGLAP表达式在21天( )两种文化类型,如预期。

在chondrogenic条件下,三个星期后,类似大小的颗粒被认为形成骨膜和BM文化和染色呕吐(甲苯胺蓝)(图确认5 (b))。量化插科打诨的内容后,之间没有显著差异被认为骨膜和BM丸(Wilcoxon符号秩检验, , )(图5 (b))。与骨,有高捐赠的可变性;然而,供体年龄被认为影响GAG生产BM文化( ),但不是骨膜文化( )。Chondrogenic分化标记,COL2A1和SOX9,增加骨膜和BM丸白天21(图5 (b))。

明显,更多的脂肪沉积在BM文化与骨膜相比,后三周的脂肪形成的诱导和油红染色( )(图5 (b))。量化的脂肪沉积(尼罗红)和DNA (DAPI)透露,BM文化水平高脂肪细胞内容(Wilcoxon符号秩检验, )。FABP4被认为增加在两种文化类型脂肪形成的诱导后(图5 (b));然而,PPAR-γ增加了BM文化,但减少了骨膜文化中。

4所示。讨论

在这项研究中,利用的潜力periosteum-derived msc的msc在骨缺损手术修复了。目前,缺乏直接比较的msc源自人类的骨膜和BMA,特别是当供者匹配(24,35]。在这里,第一次donor-matched比较“临床访问”骨膜内(从外科开放骨折网站)比较髂嵴BMA, msc目前供应用于手术(36]。

两个MSC来源比较组织学定位CD271 +候选人MSC在每个组织(21,37- - - - - -39]。骨膜的形成层层历史上被描述为一个osteoprogenitors的丰富来源,而纤维层被认为是更少的细胞(16,17,40,41]。然而,这项研究表明CD271 +细胞的存在在人类样本遍布外层纤维层。这些细胞是周围局部的血管在纤维层;因此,尽管形成层层往往是没有收获,这些数据表明“临床访问”人类骨膜仍可能含有msc的供应。

CFU-F化验MSC的黄金标准量化在BM吸入或固体结缔组织具有处理释放的细胞(42]。尽管如此,迄今为止,很少有研究量化人类骨膜MSC频率(20.,42),没有人将它比作donor-matched BMA。我们的数据msc 2500倍高频率的出现在“临床访问”骨膜样本,这通常不包括形成层层,骨膜作为一个可行的替代BM吸入物高和一致的msc的供应。值得注意的是,在BM MSC计数样品(0.0008%)在这项研究中较低与文献相比,该公司估计MSC [0.001 - -0.01%43]。这可能是由于这样的事实:BMA在我们的研究大多是在大量收集(> 50毫升)浓度产生BMAC之前,它是已知的导致BM与周边血液稀释21,32,43]。然而,即使在最高MSC内容BMA(0.0027%)在这项研究中,donor-matched骨膜> 1500倍更MSC,从而确认的优越性骨膜样本对MSC的内容。

直到最近,CFU-F菌落大小测量没有经常在MSC组织进行比较研究;然而,这些数据可以提供有价值的信息在组织内MSC异质性的调查。当这是进行BM吸入物、MSC亚种群具有不同大小和密度表示发现了MSC异质性程度高,在一项研究中是与供体年龄(22),但可能也与不同的MSC地形(44,45]。这里,骨膜殖民地小得多(一半尺寸),和更多的同质比donor-matched * BM,艾滋病在骨膜MSC结果的可预测性BM MSC。

为了巩固之间的差异在集落形成骨膜和BM MSC文化,活细胞成像的早期在体外在文化(2周)msc。相位全息成像是利用非侵入性,无标号高通量方法量化细胞形态学和活细胞跟踪(46- - - - - -48]。MSC形态在MSC来源是变量随着时间的推移,改变以小时计,测量大约98%的细胞保留经典的“轴”形状,剩下的2%的测量细胞被收回到球体,接受部门。类似比例的细胞分裂中看到这些实验是一致的与我们类似的数据增长率之间的配对骨膜和BM文化之前通过零。基于这些和我们CFU-F数据,因此我们提出较小的骨膜菌落大小可能是因为他们减少了细胞面积和/或贫困移民的能力而不是他们减少扩散。

当单个细胞在24小时内进行分析,观察到,msc增殖并占领更多的表面,它们的迁移高原和细胞直接变得更加随机,对这两种细胞类型。的确,骨膜msc不如BM msc迁徙和移动速度较慢。这还真的当细胞被分为两个亚种群,nonmigratory迁徙,基于100选择任意的分界点μm。msc迁移的速度也是量化;第一次,骨膜msc被证明为17.5迁移μm / h (nonmigratory)和20.4μm / h(迁徙),低于22.3 BM MSC同行μm / h (nonmigratory)和30.0μm / h(迁徙)。BM MSC迁移速度在胶原蛋白I型凝胶已经量化之前在一项研究(15μm / h),这可能反映出迁移速度是影响msc的衬底接触(49]。这也显示了萨拉姆et al。50),纤维蛋白原浓度矩阵显示反向影响BM MSC迁移,通过减少孔隙大小和基质硬度的变化。这些特征可能有助于开发更合理的方法对骨骼支架由骨膜细胞的重新设计,例如,他们的最佳的孔隙度。与此相关,最近的一项研究利用全息成像评估生长和分化的BM msc在玻璃和氧化钛(TiO₂),显示出良好的细胞粘附和TiO蔓延₂涂料(51),强调了这一技术在组织工程领域的潜力。未来的工作将针对增加供体数量评估捐赠供者年龄的变化和影响,以及一个更精确的研究细胞融合如何影响单个细胞的行为。

对单元格大小分析,骨膜MSC细胞面积大20%相比donor-matched BM细胞。这证实,尽管高累积PDs应计的BM msc、他们没有接近衰老(衰老细胞更大)52),这与我们的观察是一致的相似比例的细胞分裂MSC类型。虽然这个调查仅限于单个一双donor-matched文化,可用的证据指向的能动性较慢,早期文化骨膜细胞的细胞相比,在我们的实验条件,而不是更低的扩散或更小的单元格区域。更大的骨膜细胞表面积msc可能影响所需的牵引力量克服部分和胶粘剂抗性细胞运动所需的(53]。融合是另一个因素,可以影响细胞的速度或迁移;然而,这似乎并没有影响到看到差异在这项研究中,因此其他因素必须在起作用。

我们已经表明,不同组织来源的msc、从同一供体和增长在体外同一时期,潜在的相互作用是相同的底物(在本例中组织培养塑料)以不同的方式,从而导致细胞表面积的变化,迁移距离和速度。众所周知,纺锤状细胞迁移,msc,依赖于形成焦粘连与肌动蛋白丝机械细胞外基质与细胞骨架和收缩应力纤维(53]。水平的整合蛋白和细胞骨架在MSC曾与影响MSC分化,即增加病灶粘连和僵硬的蔓延似乎影响成骨细胞骨架54]。葛斯乐等。55)表明,脂肪组织msc和BM msc在体外表达不同层次的各种整合蛋白,影响粘着斑的形成。然而,对整合素和粘着斑水平差异骨膜和BM msc;未来发展这项工作需要确定是否有固有细胞骨架和粘着斑形成的差异。

利用对骨膜的msc对骨折愈合,成骨和chondrogenic能力是特别重要的56,57]。而成骨和chondrogenic骨膜MSC文化的分化能力被证明是类似于donor-matched BM MSC、脂肪形成的差异化显示明显的差异,即骨膜脂肪形成的潜在明显低于donor-matched BM MSC。通过减少差异可以部分解释PPAR-γ分子水平,启动脂肪细胞分化的关键(58骨膜msc、21天),而在BM msc、调节,与先前的研究一致(24,31日]。乳突骨膜MSC克隆显示trilineage分化能力的变化,即几乎所有克隆显示骨软骨的能力,而只有53%被认为是脂肪形成的(59]。在此基础上,我们的数据,它可以建议骨膜msc有优惠承诺骨软骨分化、断裂所需的修复。

与收获的自体骨移植填充的临界骨缺损大小,关键要考虑与倡导骨膜的使用是创建一个最小施主能级发病率。目前,免费vascularised corticoperiosteal骨移植、骨膜和潜在的皮质骨骨可以4厘米²从股骨内侧髁,环绕一个缺陷的网站(60- - - - - -63年]。股骨髁后发现巩固好收获过程(60,61年]。此外,概念验证研究临界骨缺损大小羊模型显示最大缺陷的桥梁,在自体骨膜带被使用,收获与骨膜电梯,从而消除形成层层(64年,65年]。在一起,这表明,收获小贪污(s)的手术刀骨膜的纤维层,在这项研究中,离开形成层主要完整,不会创建一个施主能级发病率。这将允许为骨膜增生的“MSC-rich”源代码移植到或治疗缺陷区域周围复杂的骨折或临界骨缺损大小,与其他治疗结合的刺激因素和目前正在使用的细胞来源。

5。结论

“临床访问”的样本长骨骨膜,骨折修复的重要组成部分已被证明是一个丰富的高度增殖的msc、与当前的“金本位”BMA相比,较低的脂肪形成的但类似骨软骨的潜力。小说活细胞跟踪技术允许广泛的形态和迁移特征量化的骨膜msc可以用来通知小说骨移植替代物的发展由这些细胞重新填充。进一步调查“最低限度操纵”骨膜样本,例如,骨膜micrografts,未来临床需要翻译这个组织来源的单一手术期间使用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突的作者,本文的研究,和/或出版。

确认

作者感谢迈克郡组织学处理和训练,Liz Straszynski流式细胞术训练,Ala Altaie博士的帮助下(分化化验)和德拉戈Ilas系统(qPCR)以及理查德·卡斯伯特博士和托马斯Baboolal技术专长。感谢亚当·戴维森博士还去组织和建立HoloMonitor和卡特里娜Moisley帮助收集样本。我们也感谢工作人员和病人捐赠样本在创伤骨科工作部门,利兹总医院。希瑟Owston持有博士训练中心在组织工程和再生医学奖学金,由格兰特EP / L014823/1从工程和物理科学研究委员会。

补充材料

的细节抗体用于表型msc与流式细胞术可以在补充表1。(补充材料)

引用

1. l·a·米尔斯,s . a .艾特肯和a·h·r·w·辛普森“无工会/骨折的风险:目前的神话和修正后的数据从一个人口超过400万的成年人,“Acta Orthopaedica,卷88,不。4、434 - 439年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. c . Tzioupis和p v Giannoudis长骨不愈合率”,受伤,38卷,补充2,S3-S9, 2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. l·a·米尔斯和a·h·r·w·辛普森“骨折的相对发病率无工会在苏格兰人口(517万):5年的流行病学研究中,“BMJ开放卷,3条e002276, 2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. e . Antonova t·k·勒·r·伯格和j . Mershon“胫骨骨折轴:骨折不愈合的昂贵的负担”,BMC肌肉骨骼疾病,14卷,不。1,第四十二条,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. p . v . Giannoudis、t·a·艾因霍恩和d·马什”骨折愈合:钻石概念”,受伤,38卷,补充4,S3-S6, 2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. j . j . El-Jawhari c . Sanjurjo-Rodriguez e·琼斯和p . v . Giannoudis”Collagen-containing支架加强吸附和扩散non-cultured multipotential骨髓基质细胞,”骨科研究期刊》的研究,34卷,不。4、596 - 606年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. t . a . Elsattar人工智能Alseedy, a·a·e·哈利勒“骨髓注射治疗长骨骨折不愈合,”Menoufia医学杂志,27卷,不。4、632 - 635年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. j . a . m .吉马良斯·m·e·l·杜阿尔特·m·b·c·费尔南德斯et al .,“自体的影响集中在治疗股骨的骨髓移植不愈合后锁定髓内钉,”受伤,45卷,不。S5, S7-S13, 2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. d . Kouroupis t . g . Baboolal e·琼斯和p . v . Giannoudis“本地multipotential基质细胞殖民和贪污扩张器牛自然骨支架的潜力,”骨科研究期刊》的研究没有,卷。31日。12日,第1958 - 1950页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. r . l . Sahu“经皮自体骨髓注射延迟愈合或不属于工会的长骨骨折内固定后,“航空杂志上Brasileira de Ortopedia,53卷,不。6,668 - 673年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 公元墨丘里奥教练,t·莫塔,大肠绿色,g .高贵,r·t·哈特和m·j·艾伦,”广泛的圆周骨膜剥离对小鼠股骨皮质的微观结构和力学性能,”骨科研究期刊》的研究,30卷,不。4、561 - 568年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 张x t . Wang, d . d . Bikle“骨膜细胞的成骨分化在骨折愈合过程中,“细胞生理学杂志,卷232,不。5,913 - 921年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. x张c .谢林a s p . et al .,“骨膜祖细胞命运的节段皮质骨移植物移植:对功能性组织工程,“骨和矿物质研究杂志》上,20卷,不。12日,第2137 - 2124页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. d . Bisseret r . Kaci m . h . Lafage-Proust et al .,“骨膜:影像学表现特点,强调radiologic-pathologic比较,”骨骼放射学,44卷,不。3、321 - 338年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. c . Colnot x张,m·l·k·泰特”目前在骨膜再生潜力的见解:分子,细胞,和内生的工程方法,”骨科研究期刊》的研究,30卷,不。12日,第1878 - 1869页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. j . r . Dwek“骨膜:它是什么,它在哪里,模仿它的缺失什么?”骨骼放射学,39卷,不。4、319 - 323年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. c . Colnot“骨骼细胞命运决定在骨膜和骨再生过程中骨髓,“骨和矿物质研究杂志》上,24卷,不。2、274 - 282年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. h . c . Brownlow a Reed, c . Joyner和a·h·r·w·辛普森“解剖骨膜海拔的影响,”骨科研究期刊》的研究,18卷,不。3、500 - 502年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. e·琼斯,a .英语,s m .牧师et al .,“大规模的提取和描述CD271 + multipotential基质细胞在健康和骨小梁骨关节炎影响骨再生策略基于无教养的或最低限度培养multipotential基质细胞,”关节炎与风湿病,卷62,不。7,1944 - 1954年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. r·j·卡斯伯特,s m .牧师h . b . Tan, d . McGonagle e·琼斯和p . v . Giannoudis”诱导骨膜复杂的大型细胞支架治疗骨缺陷,”骨卷,57号2、484 - 492年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. r·卡斯伯特s . a . Boxall h . b . Tan p v . Giannoudis d . McGonagle和e·琼斯,“单一平台质量控制分析量化multipotential骨髓基质细胞在吸入前批量生产或直接治疗使用,“Cytotherapy,14卷,不。4、431 - 440年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. p . Ganguly j . j . El-Jawhari a . n . Burska f . Ponchel p v . Giannoudis和e·a·琼斯”的分析在活的有机体内人类骨髓间充质基质细胞老化使用克隆形成unit-fibroblast化验和CD45^低CD271⁺表现型。”干细胞国际ID 5197983条,卷。2019年,14页,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 美国帕特,Ş。Korkmaz, s·欧和诉Şenay严重碳掺杂砷化镓纳米晶体薄膜热阴极真空电弧沉积的方法,”杂志的合金和化合物,卷657,不。1,第716 - 711页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. j·艾克曼斯·g·l·林和c . s . Chen”胶粘剂和机械调节人类骨髓间充质干细胞分化和periosteum-derived祖细胞,”生物学开放,1卷,不。11日,第1068 - 1058页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. e·福塞特和w·s .汗”,优化人类间充质干细胞临床应用的数字:一个文献综述,”干细胞国际465259卷,2012篇文章ID, 5页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. s . m .牧师,s . a . Boxall d . McGonagle和e·a·琼斯,“预测剩余寿命和cultivation-related multipotential骨髓基质细胞的成骨的能力降低,适用广泛的供体年龄范围,“干细胞国际卷,2017篇文章ID 6129596, 10页,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. m . Dominici k·勒布朗,穆勒et al .,“最低限度标准定义多功能间充质基质细胞。被国际社会公认为细胞治疗位置声明。”Cytotherapy,8卷,不。4、315 - 317年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. e . m . Fragkakis j . j . El-Jawhari r . a . Dunsmuir et al .,“椎体与髂骨骨髓multipotential基质细胞的来源:处理技术比较,tri-lineage分化和应用在脊柱融合的脚手架,”《公共科学图书馆•综合》,13卷,不。5,页1 - 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. c·a·格雷戈里·w·格雷迪耿氏,a . Peister和d . j . Prockop”一个茜素red-based测定粘附细胞的矿化文化:与氯化十六烷吡啶萃取相比,“分析生物化学,卷329,不。1,第84 - 77页,2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. j . El-Jawhari k Moisley、e·琼斯和p . v . Giannoudis“非交联型双层胶原膜专用交联胶原膜和支持人类骨骼marrow-multipotent基质细胞成骨的作用,“欧洲细胞和材料,37卷,不。1,第309 - 292页,2019。视图:谷歌学术搜索
31. 奥尔德里奇,d . Kouroupis美国牧师,a .英语e .英和e·琼斯,“试验验证multipotential基质细胞的脂肪形成的评估——直接比较四种不同的方法,”Cytotherapy,15卷,不。1,第101 - 89页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. s m .牧师f . Ponchel s a Boxall et al .,“转录的原生CD271 + multipotential基质细胞:多个证据的命运,与著名的成骨的Wnt通路信号活动,“关节炎与风湿病,卷64,不。8,2632 - 2643年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. 系统d . c . s . m .牧师t Baboolal et al .,“间充质干细胞的同时分析和早期股骨头骨细胞积累在骨关节炎僵化的骨头,“风湿病学,卷。58岁的没有。10日,1777 - 1783年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. 美国牧师,d . Kouroupis s a Boxall et al .,“产量优化和分子描述无教养的CD271 +间充质干细胞的铰刀冲洗器抽吸器废物袋,“欧洲细胞和材料26卷,第262 - 252页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. d . Chen h .沈j .邵et al .,“优越的成矿和新血管形成能力的成年人metaphyseal periosteum-derived细胞骨架组织工程应用中,“国际分子医学杂志》上,27卷,不。14日,第713 - 707页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. r . Dimitriou e·琼斯,d . McGonagle, p . v . Giannoudis“骨再生:当前概念和未来的方向,”BMC医学,9卷,不。1,第66条,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. d·亚历山大·f·谢弗,a Munz et al .,“LNGFR感应人类下颌periosteum-derived细胞骨生成期间,“细胞生理学和生物化学,24卷,不。3 - 4、283 - 290年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. d·亚历山大·f·谢弗,m . Olbrich et al .,“MSCA-1 / TNAP人类下颌骨膜细胞的选择提高他们的矿化能力,”细胞生理学和生物化学,26卷,不。6,1073 - 1080年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. s . a . Boxall和e·琼斯”标记multipotential骨髓基质细胞的描述,“干细胞国际文章ID 975871卷,2012年,12页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. h . Chang和m·k·泰特,”简明回顾:骨膜:利用水库临床上有用的祖细胞,”干细胞:转化医学,1卷,不。6,480 - 491年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. s·f·埃文斯,j·b·父母,c, e . Lasko et al .,“骨膜、骨的“智能”边界膜,展品direction-dependent渗透。”骨和矿物质研究杂志》上,28卷,不。3、608 - 617年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. y坂口,漫画家关谷神奇,k . Yagishita, t . Muneta”比较人类干细胞来源于多种间充质组织:优越的滑膜细胞来源,”关节炎与风湿病,52卷,不。8,2521 - 2529年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. m·e·贝尔纳多f,右路放倒和w·e·Fibbe”间充质基质细胞。”纽约科学院上,卷1176,不。1,第117 - 101页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. d . Gothard j . i道森,r . o . c . Oreffo”评估潜在的菌落形态解剖CFU-F人口从人类骨髓基质细胞,”细胞和组织的研究,卷352,不。2、237 - 247年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. a . Tormin o . Li j·c·布伦et al .,“CD146表达以初级nonhematopoietic骨髓干细胞原位与定位,“血,卷117,不。19日,5067 - 5077年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. t·森k .奥田硕m .经营m . Tsuchimochi h . Yoshie k .醒来时,“非侵入式的、形态的定量评估γ辐照人类间充质干细胞和骨膜细胞利用数字全息显微术,”国际放射生物学杂志》上,卷92,不。12日,第805 - 796页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. 腐朽,m .有的m . Gustafsson l . Gisselson a·g·Wingren k Alm,“非侵入式的、label-free附着的细胞计数和定量分析细胞利用数字全息术,”杂志的显微镜,卷232,不。2、240 - 247年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. j·佩尔森,a腐朽,s·佩特森和k . Alm“细胞活性研究利用数字全息显微术,”显微镜:科学、技术、应用和教育a . Meńdez-Vilas和j·迪亚兹阿尔瓦雷斯,Eds。,pp. 1063–1072, Formatex Research Center, 2010.视图:谷歌学术搜索
49. g . Kallifatidis b . m . Beckermann a . et al。”改善慢病毒转导的人类间充质干细胞治疗在胰腺癌,”癌症基因治疗,15卷,不。4、231 - 240年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. n .萨拉姆s Toumpaniari p .异教徒,a . m .费雷拉,k . Dalgarno和美国鹧鸪”评估人类迁移msc通过纤维蛋白水凝胶作为配方优化工具,”材料,11卷,不。9日,第1781条,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. l . Petecchia c . Usai m . Vassalli, p . Gavazzo”纳米TiO的生物物理特性₂作为hBM-MSC好的基质粘附、生长和分化,“实验细胞研究,卷358,不。2、111 - 119年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. w .翟,d .勇,j。j El-Jawhari et al .,“识别衰老细胞的多能间充质基质细胞培养:目前的方法和未来的发展方向,”Cytotherapy,21卷,不。8,803 - 819年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. 瞿f, f . Guilak和r·l·莫克”细胞迁移:影响关节疾病的修复和再生,”自然评论风湿病学,15卷,不。3、167 - 179年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. p·s·马修和e . g . Loboa”细胞骨架和粘着斑对间充质干细胞形态,影响机械性能,和分化成骨的,脂肪形成的,和chondrogenic通路,”组织工程- B部分:评论,18卷,不。6,436 - 444年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
55. 美国r·葛斯乐p . Bugert k Bieback et al .,“整合素表达干细胞从骨髓和脂肪组织在chondrogenic分化,“国际分子医学杂志》上,21卷,不。3、271 - 279年,2008页。视图:谷歌学术搜索
56. r . Marsell和t . Einhorn骨折愈合的生物。”受伤,42卷,不。6,551 - 555年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
57. a .菲利普斯“骨折愈合级联的概述,受伤,36卷,不。3,S5-S7, 2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
58. c·j·罗森,c . Ackert-Bicknell j·p·罗德里格斯和a . m .皮诺,“骨髓脂肪和骨微环境:发展、功能、和病理意义,”真核基因表达的关键评论™,19卷,不。2、109 - 124年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
59. 一首诗,a .尼斯S.-J。公园,t . Haupl、j .吊环和m .坐”表征单个细胞衍生的文化骨膜细胞祖细胞,以确保质量的临床应用,”《公共科学图书馆•综合》,12卷,不。5篇文章e0178560 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
60. k . Bakri a Shin, s·莫兰,”包含很多内侧股corticoperiosteal皮瓣重建骨缺陷的上、下肢内”在整形外科研讨会,22卷,不。3、228 - 233年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
61. 美国h . Choudry k . Bakri s l·莫兰z Karacor,和a . y . Shin”包含很多股骨内侧髁骨膜骨瓣治疗顽固的骨不愈合,”年报的整形手术,60卷,不。2、174 - 180年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
62. b·福克斯、s p . Steinmann和a . t .主教“免费血管corticoperiosteal植骨治疗持续的锁骨骨折不愈合,”杂志的肩部和肘部手术,14卷,不。3、264 - 268年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
63. m . f .温顺和w·f·a .窝Dunnen“孔隙度的墙neurolac神经导管妨碍神经再生,”显微外科卷,29号6,473 - 478年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
64. m·l·泰特Knothe h . Chang s r·摩尔和美国r . Knothe”手术膜生成组织定向输送设备:测试在一个绵羊的关键尺寸的缺陷模型,”《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。12日,1 - 9,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
65. s·r·摩尔,c .高浓缩铀,n . y . c . Yu et al .,“翻译骨膜再生能力:洞察力从定量分析的组织起源与骨膜植入替代品,”干细胞转化医学,5卷,不。12日,第1749 - 1739页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2019希瑟·e·Owston等。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。