结构和功能特征的已故供者干细胞:一个可行的替代活体供者干细胞

文摘

干细胞可以隔绝各种人体组织包括骨髓(BM)和脂肪组织(在)。我们的研究概述了一个过程分离成人干细胞从已故捐赠人。我们已经表明,细胞计数从已故的活体供者BM在建立参数。评估人口统计信息表现出更高比例的造血干细胞(HSC)在雄性和雌性,以及一个更高比例的HSC在25年的年龄段。第一次,我们表明,死者供体股骨BM增长细胞殖民地。我们引进新技术在处理显著增加非酶的细胞复苏传统酶处理方法。从死者供体细胞计数超过活体供参数。此外,我们的数据表明从女性捐赠者获得更高的有核细胞数(TNC)比男性。在一起,我们的数据表明,我们的方法分离出干细胞从已故捐赠人可能是日常实践提供一个可行的替代活体供者干细胞。这将为等待干细胞疗法的患者提供可访问性增加。

1。介绍

干细胞再生医学应用(不可分割的一部分1]。为了成为一个可行的替代治疗,干细胞数量应该有丰富的收获,微创手术,很容易一个自体或同种异体移植主机,并沿着多个细胞谱系分化途径的调节和可再生的方式2]。

成体干细胞,发现在许多组织在整个身体,是一个可行的选择临床使用由于其灵活的区分能力。它们可以明确划分为造血干细胞(HSC),间充质干细胞(msc),组织干细胞。最常见的三个来源成体干细胞是骨髓、外周血、脂肪组织(3]。

有许多病人等待救命的干细胞移植没有一个合适的捐赠者。适用性的HSC捐助者是由基因遗传的组织类型的匹配。匹配往往最在捐助者和患者发生类似的种族/民族背景。这可以让找到一个合适的干细胞捐赠者困难,如果不是不可能的话)病人的种族/民族背景目前弱势国家捐助注册表(4]。

骨髓被认为是常见的成体干细胞来源采购从活体供体和主要用于后骨髓造血重建疗法治疗癌症、白血病、贫血,和一些遗传疾病(5,6]。HSC也可以动员骨髓和外周血中提取。在骨髓MSC的存在也被观察到一个非常低的比例(7]。

脂肪组织是一个丰富的MSC位于间质血管分数(SVF)在隔离过程中8- - - - - -10]。发病率低萃取过程通过抽脂和高收益的MSC使人类脂肪组织的现成的来源干细胞(11]。

干细胞临床使用目前只获得从活体供体,限制了可用产品的数量。干细胞的提取从活体供体受制于有限的卷,细胞计数,捐赠者和不适。造血干细胞移植,除了是兼容的,需要一个足够高的细胞产生为了移植被认为是足够的。这个产量是基于最小细胞剂量每个病人的体重。

住旁边的采购从其他来源的干细胞捐献者是一个真正的可能性,需要探索12]。获得从已故的捐赠者的器官和组织移植是一个被广泛接受的策略;然而,常规已故捐赠过程中,采购骨髓和脂肪组织不执行。死者捐献骨髓和脂肪组织可以采购,大幅增加供应和获取干细胞没有疼痛,发病率和死亡率与活体供者干细胞相关集合(13]。

新泽西共享网络是一个非营利,联邦政府指定机关采购组织负责器官和组织的恢复等待移植的患者和唯一能够获得从research-consented尸供体骨髓和脂肪组织。在这项研究中,我们描述的过程中获取和描述干细胞从已故捐赠人可以经常对再生医学过程中恢复过来。这些细胞可以低温贮藏和/或体外扩大对当前或未来的治疗应用(14- - - - - -17]。此外,我们已经开发出一种新技术对非酶的分解动作的MSC已故捐赠人脂肪组织,从而大大增加获得可行的细胞的数量。

2。材料和方法

2.1。病人的人口统计

我们确定了33 research-consented已故捐赠人从我们的本地服务区域(19男性;女性14日)之前,他们的器官检查。他们的年龄从13到69年种族广泛分布在当地居民(13个白种人,6黑色、13个拉美裔,和1南亚)。组织收集的确定是基于临床和/或技术原因在死者捐赠检查。死亡原因包括中风、药物中毒、机动车事故(MVA),自杀,头部创伤,心脏骤停,杀人,和其他自然原因(表1)。

2.2。骨髓

提取死者的髂骨骨髓捐赠者进行使用Fenwal™骨髓采集装备(美国Fenwal Inc .)、苏黎世湖,IL),一个愿望针,肝素化注射器。骨髓被驱逐到骨髓的收集袋部分收集装备。愿望针然后搬到一个不同的网站在髂嵴进一步收集。骨头碎片通过重力过滤系统过滤掉的骨髓收集箱。收集到的骨髓单位被运往实验室湿冰。

提取股骨骨髓从死者供体进行使用骨锯,一个Fenwal™骨髓收集装备,以及肝素化注射器。股骨摘除和轴两端被切断,揭示了骨髓。肝素冲进轴,骨髓被驱逐到骨髓的收集袋部分收集装备。骨头碎片通过重力过滤系统过滤掉的骨髓收集箱。收集到的骨髓单位被运往实验室湿冰。

在实验室里,集合分为整除和离心机800 x g在室温下10分钟。巴菲外套层,包含单核细胞包括HSC、小心地提取出来。部分混合淡黄色的外套细胞悬液用于免疫染色检测细胞表面标记物的表达CD34、CD45。

细胞表面标记物的检测在BD FACSCanto™II(美国BD生物科学,圣何塞,CA)使用BD™干细胞枚举工具包包含过程控制(BD™SCE工具包)。BD™SCE工具包提供了一个单管试验检测的可行的新鲜骨髓CD34 +细胞。简单,试剂结合测试样品(淡黄色的大衣)在个别BD Trucount™管获得绝对细胞计数。样本添加到试剂根据制造商的说明,从而使fluorochrome-labeled抗体的试剂结合具体HSC的表面。染料7-aminoactinomycin D (7-AAD)添加到评估细胞的可行性。红血球细胞溶解使用氯化铵流式细胞分析仪的样品了。可行的CD34 +细胞的浓度,可行的CD45 +细胞,和可行的CD34 +细胞的比例可行CD45 +细胞群在样品被确认18]。

2.3。克隆形成单位(CFU)测定

CFU化验从髂骨骨髓HSC和股骨是由首先确定卷板所需的骨髓巴菲外套细胞的密度 细胞每口井。污染最小化了红细胞沉降在HetaSep™(干细胞技术有限公司,公元前的温哥华,加拿大)。1毫升工作解决方案包含10 x细胞悬液制备使用Iscove修改杜尔贝科的媒体(IMDM)(干细胞技术有限公司,公元前的温哥华,加拿大)。设置CFU试验,400年μl细胞悬液加入工作的10 x 4毫升prealiquoted和解冻MethoCult™媒体(干细胞技术有限公司,公元前的温哥华,加拿大)。的MethoCult™/细胞混合物在1毫升整除分发到prelabeled SmartDish™(干细胞技术有限公司,公元前的温哥华,加拿大)一式三份。无菌水被添加到井之间的空间来帮助保持湿度在孵化。的SmartDish™包含MethoCult™/单元和水混合物中孵化有限公司₂孵化器37°C和5%股份有限公司₂14 - 16天。潜伏期后,每个不同的菌落数,被其特定的形态特征用倒置相差显微镜。

2.4。脂肪组织

腹部的脂肪组织切除了死者供体和放置在一个无菌容器运输。容器被送往实验室湿冰。

在实验室里,两个相同质量分数的脂肪组织收集,剁碎,和处理个人一次性使用,一次性交流:Px®系统(AuxoCell实验室,Inc .,剑桥,妈,美国)。切碎组织用0.9%氯化钠(美国b·布劳恩伯利恒,PA)盐水。剁碎组织产品从分数1用胶原酶治疗II型(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)酶浓度的150μg / ml和激动37°C孵化器1小时。剁碎组织分数2被以类似的方式处理分数1除了没有酶添加到分数2。1小时的潜伏期后,分数都是通过一系列的包过滤和处理交流:Px x®系统和离心机430 g 30分钟。每个部分的细胞颗粒在PBS resuspended(磷酸缓冲盐;热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)最后一卷20毫升和代表SVF分数1(酶治疗)和分数2 (nonenzyme治疗)。

最小标准MSC的表现型是细胞表面标记物的表达CD73, CD90、CD29、CD44、和CD105伴随着缺乏表达CD11b、CD34、CD45、CD79a, HLA-DR [19]。文献表明,在脂肪细胞CD34的表达MSC是有争议的,可能出现在不同程度(20.- - - - - -24]。的细胞计数SVF上执行一个番石榴easyCyte™高温超导流式细胞分析仪(美国Luminex、奥斯汀、TX)使用ViaCount™试验试剂按照制造商的指示。混合采集标本和整除单独管抗体染色。抗体用于我们研究APC-conjugated鼠标反CD73 PerCP-Cy™5.5共轭鼠标反CD105, PE-conjugated鼠标反CD44 (BD树干茎流™人类MSC分析工具;美国BD生物科学,圣何塞,CA), APC-conjugated鼠标反CD90、PE-conjugated鼠标反CD29, FITC-conjugated鼠标反CD45和FITC-conjugated鼠标反CD11b / MAC-1 (BD Pharmingen;美国BD生物科学,圣何塞,CA)。上面所有的抗体被添加到整除样品和孵化在黑暗中在室温下30分钟。这些细胞被洗两次洗缓冲区(含1%胎牛血清)PBS和resuspended洗缓冲区分析流式细胞分析仪。样品被封闭的细胞为阴性FITC (CD11b / MAC-1 CD45)和阳性APC (CD73 CD90) PerCP-Cy™5.5 (CD105),和体育(CD44、CD29)。

2.5。细胞生长和增殖

msc生长nonenzyme-treated分数2 SVF CELLstart™CTS™(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)涂布瓶如下。CELLstart™CTS™稀释1:100年10毫升PBS和添加到75厘米²组织培养瓶(美国纽约猎鹰®、康宁、康宁)轻轻飞舞,确保完整的表面覆盖率。瓶是在湿润孵化有限公司₂孵化器37°C和5%股份有限公司₂60分钟,然后放在地板层流罩,直到使用。添加细胞之前,CELLstart™CTS™解决方案是吸气,取而代之的是一个StemPro®MSC SFM CTS™完成生长培养基(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)含2%谷酰胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和1%的抗生素(Penicillin-Streptomycin;美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)。SVF包含的体积 细胞/毫升计算和添加到完整的生长介质。细胞被孵化有限公司₂孵化器总共14天或直到细胞confluency达到60 - 80%,与更换完整的生长介质瓶每2 - 3天。对接种细胞,媒介是吸气和细胞与prewarmed PBS洗一次。细胞被分离从瓶通过添加5毫升TrypLE™选择CTS™(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和孵化37°C 5分钟。超然,5毫升的PBS加入烧瓶和细胞悬液被转移到一个15毫升锥形管,其次是在200 x g离心5分钟。细胞颗粒是完整的最小体积resuspended生长培养基对细胞计数。总共 可行的细胞被添加到CELLstart™CTS™预镀75厘米²组织培养瓶含有StemPro®MSC SFM CTS™完成生长介质,2%的谷酰胺和1%的抗生素。湿润的细胞被孵化有限公司₂孵化器与介质替换上面进行每2 - 3天为最佳的细胞生长和增殖。

2.6。Multilineage细胞分化

MSC分化到脂肪形成的、chondrogenic和成骨的血统是一个代表性的案例研究。msc从通道2被收获使用TrypLE™选择CTS™和镀CELLstart™CTS™预镀板一式三份。细胞镀6-well文化板块 细胞/被用于lineage-specific基因表达研究。细胞镀12-well文化板块 细胞/用于染色细胞分化。细胞生长在一个StemPro®MSC SFM CTS™完成confluency生长介质,直到他们达到80%。

2.6.1。脂肪形成的分化

完整的生长介质是取代DMEM(高葡萄糖,GlutaMAX™补充;美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆),含10%胎牛血清,200μ吲哚美辛,1μ10 M地塞米松,μM胰岛素,0.5毫米isobutyl-methyl黄嘌呤(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。这种媒介是最佳分化每2 - 3天更换一次。板块在湿润孵化有限公司₂孵化器1周直到RNA提取(6-well板块)和2周,直到评估脂滴的形成(12-well板块)。可视化的脂滴的形成,细胞被固定在10%甲醛( )在室温下10分钟。固定细胞用60%异丙醇洗净之后,油红O染色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。染色细胞又60%异丙醇清洗和计数器与苏木精染色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)染色细胞核。染色细胞用蒸馏水洗净,光学显微镜下观察到。照片被捕获在40 x放大。控制细胞被维护在一个完整的生长介质和并行彩色分化细胞。

2.6.2。成骨分化

在80% confluency诱导msc分化为骨细胞代替完整的增长媒体DMEM(高葡萄糖,GlutaMAX™补充,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),含10%胎牛血清,50μ0.1 M L-ascorbic酸2-phosphate sesquimagnesium盐水合物μM地塞米松,10毫米β甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。板块在湿润孵化有限公司₂孵化器与介质替代每2 - 3天。RNA的提取6-well盘子后1周。2周后孵化,细胞12-well板固定在10%甲醛( )在室温下10分钟。这些细胞被洗两次与PBS和沾2%茜素红溶液在室温下15分钟。多余的染色与蒸馏水被洗细胞。光学显微镜下观察染色单层,并在10倍放大图像捕获。控制细胞被维护在一个完整的生长介质和并行彩色分化细胞。

2.6.3。Chondrogenic分化

MSC被诱导分化成软骨细胞取代StemPro®MSC SFM CTS™完成生长介质与完整StemPro®软骨形成分化培养基6-well和12-well文化板块。媒介是最佳分化每2 - 3天更换一次。细胞RNA提取后1周的收获6-well盘子。14天之后,细胞12-well板固定在10%甲醛( )在室温下10分钟。细胞被洗PBS和沾1%阿尔新蓝溶液在室温下30分钟。污渍洗掉用3%醋酸溶液冲洗水紧随其后。染色细胞在光学显微镜下,观察和图像捕获10倍放大。控制细胞被维护在一个完整的生长介质和并行彩色分化细胞。

2.7。基因表达:存在

细胞在试剂盒resuspended®试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和总RNA提取的相分离过程(25]。1μ克总RNA反向转录cDNA使用qScript™cDNA SuperMix第一链合成系统工具包(美国量子生物科学,马里兰州)。互补脱氧核糖核酸是添加到SsoAdvanced™普遍SYBR®绿色Supermix和叠加在定制96 - PCR板块(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。执行中存在使用CFX96™实时PCR检测系统(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。转录后基因定制的PCR 96孔板来确定lineage-specific基因表达谱:过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ),脂肪酸desaturase 2 (FADS2)和脂蛋白脂肪酶(LPL)脂肪形成的分化;integrin-binding唾液蛋白(IBSP) runt-related转录因子(RUNX2) osterix / Sp7转录因子(Sp7)和β连环蛋白1 (CTNNB1)成骨分化;和sterol-C4-methyl oxidase-like蛋白(SC4MOL)和软骨寡聚基质蛋白(COMP) chondrogenic分化。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)记录为每个样本作为内部控制。

2.8。克隆形成Unit-Fibroblast (CFU-F)测定

的MesenCult™扩散工具包(人类)(干细胞技术有限公司,温哥华BC,加拿大)是用于脂肪组织CFU-F测定MSC。SVF包含的体积 细胞/毫升计算和添加到15毫升的准备MesenCult™中含有1%的抗生素(Penicillin-Streptomycin;热费希尔科学、沃尔瑟姆,美国马)和0.1%血型“AB”人类血清(美国纽约康宁,康宁)75厘米²组织培养瓶(猎鹰®、康宁、康宁,纽约,美国)。细胞被孵化有限公司₂30天的孵化器在37°C,在潜伏期2媒体的变化,以及经济增长评估融合。

2.9。统计分析

分析数据对HSC和MSC变量都使用标准误差的方法和手段。已故捐赠人数据相比,建立活体供范围。学生的 - - - - - -测试(Microsoft Excel)被用来确定观察到的差异的统计的信心。被认为具有统计显著性差异 。

3所示。结果

3.1。从已故HSC捐赠骨髓的识别

髂骨骨髓从12 research-consented已故捐赠人是采购根据材料中所描述的过程和方法。的意思是收集69毫升液体骨髓。使用BD™SCE单管试验,我们能够确定可行的HSC的百分比(CD34 +细胞)在已故的髂骨骨髓捐赠者。

我们进一步研究HSC的分布从髂骨骨髓基于性别和年龄组群已故捐赠人。如图1我们观察到,全国过渡委员会/毫升略高于女性;然而,CD34 +细胞的比例低于男性。

死者的年龄供体似乎发挥重要作用的能力获得可行的HSC再生疗法。表2表明,捐助者25年和年轻有最多的过渡委员会/毫升(CD45 +)和CD34 +细胞的比例最高CD45 +细胞。

3.2。HSC的平均百分比

我们使用发布范围的骨骨髓来源肝星状细胞分离活体供体髂嵴的比较结果。表3展示了活体供体和既定的范围我们观察到已故捐赠人的意思。我们观察到的平均值HSC采购从死者供体髂嵴骨髓也相应的值的范围内生活。这表明HSC从死者供体髂嵴骨髓活体供HSC是一个可行的选项。

3.3。从已故捐赠骨髓造血干细胞集落形成

我们执行CFU化验使用淡黄色的外套从髂骨骨髓分离5 research-consented捐赠者和股骨骨髓的2 research-consented捐助者对HSC的克隆形成能力进行评估。我们观察到生长的细胞殖民地后14天的孵化(数字2)。这些殖民地增长模式特点是相同的菌落观察相似样品从生活获得捐助者。

殖民地的数量由已故的HSC供体髂嵴骨髓是建立HSC的值的范围内生活捐献骨髓。殖民地的数量由已故的HSC捐赠者股骨骨髓也观察到。如表所示4,我们发现菌落的数量由髂骨骨髓是相应的值的范围内生活。我们还观察到殖民地的数量由股骨骨髓是更高。此外,我们注意到,殖民地的平均数量是高于男性已故捐赠人和已故捐赠人小于45岁。此外,我们观察到殖民地从不同的造血血统的分布类似于从髂嵴和股骨骨髓分离。

3.4。时间从死者中提取骨髓捐赠者

在执行提取已故的髂骨骨髓捐赠者,我们观察到,虽然死者捐赠者器官采购肝素化,提取骨髓的时机是至关重要的。我们发现骨髓提取后2小时内死亡宣告自骨髓开始凝固,凝固在髂嵴骨。也许是这个原因,骨髓来自已故捐赠人的体积小于从生活获得捐助者。在活体供提取,连续血液循环通过骨髓和骨髓仍以液态形式。

骨髓位于股骨处于固体状态,可以舀出使用肝素或刷新。我们没有注意到任何时间限制为股骨骨髓采购。

3.5。从已故捐赠人脂肪Tissue-Derived MSC

我们从27 research-consented获得脂肪组织捐赠者获得45和876克的脂肪组织之间从每个捐赠者。这个体积可以显著提高基于捐献者的身体质量指数。27个捐助者、11捐赠样本处理使用酶消化(胶原酶),9捐赠样本处理使用AC: Px®系统(没有胶原酶治疗),6捐赠样本处理使用两种方法,1捐赠者示例并没有处理。图3显示了平均值的过渡委员会SVF / g脂肪组织的样本都有或没有酶消化处理。我们观察到,我们可以获得显著更多的过渡委员会SVF / g的脂肪组织从样品加工使用AC: Px®系统没有酶治疗相比,酶消化。

有趣的是,我们还观察到,女死者捐助国的脂肪组织产生了更大数量的过渡委员会SVF / g的脂肪组织相比男性,如图4。男性和女性群体都有类似的意思是身体质量指数(BMI)。女性的平均年龄队列的平均年龄高于男性群体在我们的研究中。

我们分析了存在SVF MSC的使用建立了MSC的细胞表面标记。细胞表现出的分数CD29、CD44 CD73, CD90、CD105表型伴随着缺乏表达CD45和CD11b评估使用流式细胞仪。我们观察到细胞表面标记CD105在本机最低限度表示,已故的捐赠者MSC的主要细胞悬液(20.,26]。MSC / TNC的比例是高脂肪组织,没有酶消化处理(图5);然而,它没有统计上的不同。

均值TNC SVF / g的脂肪组织从死者供体获得样品相比,成立值观察生活的捐助者。我们观察到,意味着过渡委员会SVF / g脂肪组织样品的处理,没有胶原酶高于活体供价值下降(表范围5)。% MSC / TNC的平均值下降在活体供值范围内。

我们执行中描述的CFU试验材料和方法。我们使用4样品SVF孤立从死者research-consented捐赠者脂肪组织,没有酶消化处理对MSC的克隆形成能力进行评估。我们从所有4样品观察增长。的形象代表死者供体脂肪的增长融合MSC图所示6。

3.6。MSC在体外分化从已故的捐助者

MSC的孤立的功能non-enzyme-treated SVF分数分析通过检查他们的multilineage分化潜力使用标准体外组织培养技术。msc诱导分化成脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞代替lineage-specific介质的生长介质。我们观察到,诱导脂肪细胞的分化导致了MSC形成脂滴的形态转换,一个成熟的白色脂肪细胞(图的特征7(a))。这是进一步证实了通过分析特定基因表达的增加与脂肪细胞的分化,如过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ),脂肪酸desaturase 2 (FADS2)和脂蛋白脂肪酶(LPL)(图7(b))。同样,诱导成骨的条件下导致成功的MSC分化为骨细胞(图7(c))。我们还观察到特定的成骨的血统基因的表达增加如integrin-binding唾液蛋白(IBSP) runt-related转录因子(RUNX2) osterix / Sp7转录因子(Sp7)和β连环蛋白1 (CTNNB1)(图7(d))。此外,MSC分化成软骨细胞暴露在一个特定的软骨细胞分化中(图7(e))。这是伴随着特定的基因表达的增加与软骨细胞分化,如sterol-C4-mehtyl oxidase-like蛋白质(SC4MOL)和软骨寡聚基质蛋白(COMP)(图7(f))。在所有情况下,未分化的细胞没有表现出任何改变在形态或基因表达水平。

4所示。讨论

活体供肝星状细胞是目前用于治疗患者的疾病遗传影响造血系统,获得,或者从骨髓治疗结果。根据美国司法研究所,在任何时间,大约7500美国人正在寻找一个不相关的HSC捐赠(27]。这是更具挑战性由于大种族/民族差异可用HSC捐赠者,使它困难的少数民族和混血等待HSC移植的患者找到一个合适的匹配。

此外,msc被评估在临床研究使用修理,更换,恢复或重新生成细胞在体内。HSC和MSC都是限制数量的活体组织的数量和采购。

接受死亡供者干细胞治疗应用作为公认的细胞来源将有利于病人等待干细胞疗法。常规的器官/组织采购过程从已故捐赠人可以扩大到包括HSC和MSC的集合。已故捐赠人通常人类白细胞抗原表型和评估任何潜在的传染性疾病的存在,从而使他们安全,访问,和一个在经济上可行的干细胞来源。这些干细胞可以扩大和/或低温贮藏和倾斜为未来的应用程序(28]。

我们最初的努力在采购和描述已故的HSC捐赠骨髓已经非常有前途。众所周知,CD34 +细胞的数量是一个重要的剂量指标HSC细胞疗法的临床成功(29日]。特别是,细胞计数参数如过渡委员会/毫升和%骨髓CD34 + / CD45 +细胞是可以接受的指标的适用性获得骨髓从活体供体造血干细胞疗法。在分析这些参数从research-consented尸供体骨髓采购,我们观察到这些参数的平均值都在活体供范围出版。我们的数据表明,HSC从已故的骨髓捐赠者可能适合活体供HSC相同的应用程序,因为它们有相同的细胞治疗临床可接受的数量。另外,我们观察到的克隆形成能力死者供体髂嵴骨髓HSC是类似于活体供体。有趣的是,死者捐献骨髓femur-derived HSC增长更多的殖民地于髂嵴骨髓。此外,我们的观察表明,年轻的死者捐献骨髓,骨髓从男性产生更多的殖民地比年长已故捐赠骨髓和骨髓的女性。我们的研究表明,死者供体HSC在功能上是可行的,适合再生疗法的应用。此外,femur-derived骨髓可以替代髂嵴骨髓。此外,研究评估椎骨尸体捐助者提出额外的来源获取骨髓(30.]。这些额外的固体骨髓来源干细胞可能的优势获得可行的后一段时间的存储。

有一个警告采购已故捐赠骨髓液。我们发现有一个限制的时间提取已故的髂骨骨髓捐赠者。由于没有血液循环通过已故捐赠者的骨髓,骨髓开始凝结在2小时内死亡。这使得只有很小机会获得大量的骨髓后宣告死亡。此外,髂骨骨髓的体积来自已故捐赠人也小于生活捐助者。

造血干细胞从骨髓的产量和比例也依赖于捐赠的特点(31日,32]。的影响变量,如性别和年龄对HSC的临床参数观察(33,34]。据报道,从骨髓CD34 +细胞的数量由椎体是较低的女性33]。此外,CD34 +细胞浓度中位数男性高于女性婴儿(婴儿35]。它也表明,性激素可能影响造血干细胞和造血作用35]。我们的观察,髂骨骨髓CD34 +细胞数量从已故捐赠人女性低于男性的同意发表的结果。较低的CD34 +造血干细胞在雌性可能是因为雌性激素的影响有明显影响骨髓造血的女性所显示射线等。36]。

我们已经评估了年龄对CD34 +造血干细胞的数量和活力在已故捐赠人。我们观察到捐助者25年,年轻的CD34 +细胞的比例较高,表明骨髓从年轻已故捐赠人将功能相关的HSC的首选源。此外,Stolzing等人表明,有一个显著的减少骨骨髓来源msc与年龄(37]。有矛盾的报告文学在年龄对CD34 +细胞计数的影响。一些报告显示,确实是有CD34 +细胞计数下降,随着年龄增长(38,39),而其他人则认为,虽然在HSC数量没有多大差异随着年龄的增加,减少的功能随着年龄的增加(40,41]。总的来说,我们的观察与年龄对肝星状细胞的数量和功能的影响从已故捐赠人采购是按照出版的文献。

脂肪组织提供了一个丰富的MSC可以很容易地从SVF孤立。这些msc是现成的来源用于组织工程和再生医学治疗。脂肪组织是大量存在,并获得从活体供体利用抽脂手术是(42]。除了活体供相关的疼痛和不适,抽脂过程可能损害SVF细胞,导致较低的频率的可行的细胞(43]。标准的处理从活体供体利用酶消化分离lipoaspirate SVF。发表的收益率的可行的有核细胞总数SVF范围从使用酶隔离技术 来 细胞/ cc lipoaspirate [44,45]。其中,只有5%的细胞被发现是MSC (46]。机械非酶的方法SVF隔绝活体供lipoaspirates显示显著的低收益率的过渡委员会,从 来 细胞/ cc lipoaspirate [47),5%的这些MSC (48]。机械的低收益率的细胞非酶的隔离技术已被归因于MSC的位置在脂肪组织的血管周的空间。脂肪组织的机械剪切不破坏细胞外基质酶方法相比,离开MSC被困在血管内皮层和结缔组织碎片lipoaspirate [49,50]。

最近发表的文献表明从abdomen-derived分离MSC,固体脂肪组织(51- - - - - -53]。研究也表明,尸体的脂肪组织可以用作MSC(来源54]。我们使用固体脂肪组织切除的腹部research-consented已故捐赠人。我们比较两种技术来隔离SVF从这个组织。第一种技术结合机械切碎(使用AC: Px®系统)和酶消化方法。第二个技术利用只有机械切碎的脂肪组织使用AC: Px®系统没有酶消化。我们观察到非酶的方法有更多的可行的有核细胞每克总固体脂肪组织( 细胞/ g)和更高的收益率的MSC(4.5%)相比,酶消化法( 这些细胞细胞/ g)只有3.3%的MSC。我们的观察表明,非酶的机械装腔作势的固体脂肪组织使用AC: Px®系统释放更多的过渡委员会和一个更高比例的MSC与先前的研究相比。此外,剁碎组织的酶治疗减少过渡委员会的数量和MSC。与其他固体组织观察到类似的结果,其中包括脐带组织。这一观点的一个可能的理由是:酶消化的脂肪组织可能诱发细胞死亡导致更少的细胞被孤立的(55]。许多调查人员发现SVF MSC的脂肪组织通过一系列抗体绑定到MSC表面抗原表位(7,23]。有相当大的异质性,不同的细胞表面标记报告MSC。一些这方面的异质性可能是由于存在混合的细胞或细胞表面蛋白质在细胞培养的调制。识别MSC后立即隔离SVF从脂肪组织将有助于区分标记表示在活的有机体内从那些表示只有在体外操作。我们使用最普遍表达了MSC抗原表位的抗体识别在SVF从脂肪组织后立即隔离。我们的观察表明,非酶的隔离SVF从脂肪组织是最有利的方法来获得最高产量的MSC。此外,我们还注意到,从已故的脂肪组织捐赠者雌性MSC是一个更好的来源,因为它导致了更高的收益率的过渡委员会SVF / g脂肪组织相比,已故男性捐赠者。

MSC的临床应用的一个重要方面在再生医学是多能干细胞分化能力56]。msc来源于脂肪组织有能力分化成脂肪细胞,软骨细胞(57),成骨细胞(58]。我们证实了已故的多功能trilineage分化潜力donor-derived MSC孤立于非酶的SVF分数微分媒体具体,从而使它们的每一个细胞类型。脂肪细胞的分化导致了丰富的脂质空泡的产生以及adipocyte-associated基因的高表达(LPL, PPARγ和FADS2)。与茜素红染色的细胞,早期阶段的标志矩阵石灰质的沉积矿化和指标,观察msc诱导分化为骨细胞时。成骨分化的基因代表早期阶段(IBSP, RUNX2、SP7 CTNNB1)显示表达的增加在未分化的细胞。同样,我们观察到chondrogenic MSC分化显示阿尔新蓝染色的软骨分化细胞的矩阵和相关SC4MOL和COMP基因的表达增加,软骨形成的指标。

5。结论

我们已经证实死亡供者干细胞相似活体供者干细胞数量和功能。我们的结果表明,死者供体干细胞具有相同的功能能力形成的殖民地和保持他们multilineage生活供者干细胞分化潜力。死者捐献干细胞可以经常采购和潜在补充当前可用的活体供者干细胞来源。

我们最近我们实验室装备和良好生产过程和生产细胞协议practice-compliant (GMP)标准,准备未来临床规模扩张和银行业。我们计划评估骨髓和脂肪组织采购从大量的尸供体的年龄,种族,和死亡原因。此外,我们计划为MSC检查其他已故捐赠人组织来源存在和分化潜能。评价更大池的已故捐赠人将帮助我们理解HSC的数量和功能变化和MSC。这些信息将帮助我们确定一个潜在的人口死亡捐赠者从我们可以获得可行的最大数量,功能HSC和MSC。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

没有利益冲突的以下作者:普拉卡什n . Rao Dayanand d·托雾a . Marchioni Sharyn Sawczak雅各Myrick。作者凯尔Cetrulo和Rouzbeh r . Taghizadeh是公司的创始人和军官Auxocell实验室,Inc .交流:Px®系统是Auxocell实验室的产品,公司和被用于这项研究。

确认

首先,我们要感谢所有的捐赠家庭给他们的同意的研究使得这一研究成为可能。我们希望比利Fyfe-Kirschner博士承认她对CFU的贡献分析。我们还要感谢兹比格涅夫•“罗杰”Mrowiec博士和e·安德斯·科尔布对他们有价值的建议关于骨髓隔离和处理。此外,我们将特别感谢鲁本兰伯特和乔尔·帕迪拉贝尼特斯组织恢复。本文的研究和出版物是由新泽西州共享网络。

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