间充质干细胞来源的细胞外囊泡用于角膜伤口修复

抽象

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有免疫调节作用，可缓解损伤组织的炎症反应，用于组织再生。当这种修复过程被免疫紊乱或病理性血管生成干扰时，角膜上皮伤口愈合的延迟会导致持续的上皮缺损。干细胞衍生的细胞外囊泡(EVs)携带着大量来自干细胞的生物活性分子，为再生治疗提供了另一种选择。在本研究中，我们研究了人胎盘源性骨髓间充质干细胞(hP-MSCs) EVs是否能改善小鼠角膜碱损伤。33.33μ克/μL型电动汽车在10μ将L PBS应用于角膜。重复应用三次，100次μg级电动车(30年μ微升PBS）的总每天都给予了两个星期。我们的研究结果表明，从HP-的MSC电动汽车有优选功能，包括增强的增殖和抗炎症和抑制角膜上皮细胞的凋亡。此外，HP-MSC衍生的电动汽车，通过抑制血管生成和炎症改善小鼠角膜伤口愈合。总之，我们的当前数据表明，HP-MSC衍生电动车具有角膜伤口愈合的有益效果，从而提供了具有很大的实用价值替代无细胞疗法。

1.背景

伤口愈合是组织再生和功能恢复的复杂过程[1]。从其它组织和器官不同，角膜没有血管损伤后角膜透明的中断可能会导致重大的不可逆性失明从而降低生活质量[2,3.]。这些损伤，以及伤口修复的延迟，会破坏角膜血管生成特权，触发角膜新生血管形成，从而导致完全失明。受损组织的修复包括多个细胞过程，细胞频繁运动和增殖是主导过程[4]。局部滴眼液给药是最容易和无创的方法。然而，由于紧密的上皮连接，正常的眼层具有眼表的不透水性;持续的眨眼和流泪会在几分钟内迅速清除眼表上的眼液[5]。此外，结膜毛细血管可吸收所输送的药物，这进一步减少了用于有效眼吸收的药物的数量。因此，开发一种能够突破眼表屏障、延长药物释放时间、提高治疗效果、提高患者依从性的新型给药系统，对治疗眼外伤、恢复眼睛正常生理功能具有重要意义。

人胎盘源间充质干细胞(hP-MSCs)具有更强的增殖和分化能力。此外，这些细胞的来源一般作为医疗废物处理，不会产生伦理问题[6]。越来越多的结果已经表明MSCs具有治疗效果，从改善急性和慢性肝损伤和心脏衰竭到伤口愈合[7,8]。此外，近期研究表明，MSC治疗可减轻视神经损伤，增强视网膜神经节细胞[9]。然而，MSC移植不可避免地面临许多潜在的风险，如伦理问题和免疫反应。与间充质干细胞相比，msc衍生的ev触发免疫反应的倾向较低，异位移植的风险也较低[10,11]。近年来，除了直接细胞移植外，msc的旁分泌作用是在疾病治疗中发挥重要作用的机制之一。大量研究表明，MSC-derived EVs通过转运旁分泌因子促进了msc的治疗效力[12- - - - - -14]。因此，MSC衍生的电动车可提供平行于那些MSC移植的有益效果[10,15]。

2.材料和方法

2.1。细胞培养

人类胎盘源性骨髓间充质干细胞(hP-MSCs)已按先前报导收获[16] and cultured in complete Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12 (Gibco, Grand Island, NY) with 100 U/mL penicillin-streptomycin (P/S) (Gibco) and 10% fetal bovine serum (FBS; HyClone, Australia), bovine insulin (5 μ克/mL), and recombinant human epidermal growth factor (10 ng/mL) [3.]。Exosome-free FBS was obtained from FBS centrifuged at 100,000 g for 70 min [17]。被用于随后的实验通道7和10之间的HP-的MSC。的人角膜上皮细胞（HCES）从ATCC购入和作为指令描述培养。

2.2。HP-MSC的流式细胞仪鉴定

在HP-MSC的用0.25％胰蛋白酶-EDTA（GIBCO，Grand Island的，NY）解离，然后用含2个％FBS的PBS洗涤。Afterwards, the cell suspensions were incubated with fluorescence-conjugated antibodies including CD44, CD90 (Abcam, Cambridge, MA), or unstained control for 30 min at room temperature. Then, the cells were washed with PBS and resuspended in FACS buffer. The FACS analysis was performed using a FACSCalibur™ flow cytometer (BD Biosciences), and the data were analyzed using the Cell Quest Pro software (BD Biosciences).

2.3。EV分离，鉴定

EV分离和表征的方法如我们之前和其他小组的报告所述[11,18,19]。根据我们之前的报道，使用CM-DiI膜染料(Invitrogen, Carlsbad, CA)分析ev的内化情况[11]。

2.4。免疫印迹分析

HCEs在RIPA裂解缓冲液中收集，使用BCA蛋白检测试剂盒(Promega)进行定量，用10% SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, Darmstadt, Germany)。膜在5%脱脂牛奶中封闭2小时，在4℃条件下在一抗中孵育过夜，然后在室温条件下与辣根过氧化物酶(HRP-)结合的二抗孵育1小时。信号用Immobilon™Western化学发光辣根过氧化物酶(HRP)底物进行可视化。采用GAPDH作为内控。使用以下一抗:CD9(1:200，兔IgG)、CD63(1:200，兔IgG)和GAPDH(1:200，兔IgG)。

2.5。细胞增殖和细胞毒性检测

HCEs被播种于 在基底DMEM/F12中，细胞进入96孔板。细胞外囊泡(20μ克/毫升，40 μg / mL, 60μg / mL, 80μ克/毫升和100μ克/mL) were added for 24 and 48 h. MTT solution was dissolved in 100 μL二甲基亚砜(DMSO)。用多孔平板阅读器在490 nm处测量光密度。

2.6。Ki67疣状

在细胞增殖评估中，HCEs培养到100μg/mL细胞外囊泡12和24小时。4%多聚甲醛固定15min后，用Ki67抗体(BD Pharmingen, San Jose, CA)进行免疫染色。核染色采用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, BD Biosciences)反染色。

2.7。划痕愈合分析

HCEs被播种于 在6孔板中;当达到合流时，每口井都用无菌塑料造成划伤20μ大号微量移液器尖端。与在100的终浓度包含电动汽车PBS，DMEM / F12洗涤两次细胞后 μ微克/毫升加入到细胞中。迁移效果通过测量使用ImageJ软件的剩余分数伤口区域（NIH量化，https://imagej.nih.gov/ij/)。

2.8。实时聚合酶链反应

总RNA从细胞或组织中分离。总RNA也从角膜碱损伤组织中提取。实时PCR采用CFX96TM实时PCR系统(Bio-Rad, Hercules, CA)，采用SYBR格林实时检测方法(Roche, Mannheim, Germany)。感兴趣的mRNA相对表达水平为2^-ΔΔCT和归一化到GAPDH。本研究所用引物序列见表S1。

2.9。动物模型和EV治疗

按先前报道的方法建立小鼠角膜碱烧伤损伤模型[20.]。将FVB小鼠随机分为三组( 为每个组）伤后，并在第二天，33.33 μ克/μL型电动汽车在10μ将L PBS应用于角膜。只使用PBS作为对照。重复应用3次，100次μ每天给g电动车，持续2周。该方案经南开大学动物保护与使用委员会指南批准，符合《中华人民共和国动物保护与使用条例》实验室动物的护理和使用指南由美国国立卫生研究院出版(第8版，2011)。

2.10。角膜荧光素染色

第7天用角膜荧光素钠染色检测上皮修复过程。小鼠腹腔注射4%水合氯醛后，用无菌PBS浸湿荧光素钠滤纸，轻贴于小鼠角膜，用PBS冲洗去除过量荧光素。观察紫外线照射下角膜的损伤，用数码相机拍照。

2.11。角膜新生血管形成的评估

我们用立体显微镜观察了小鼠术后5天的眼部新生血管。在立体显微镜下对小鼠进行盲法的日常检查。考虑到新生血管的增长速度，每天都要进行这项评估。

2.12。组织学分析

给药后第7天或第14天，处死所有小鼠，切除角膜。部分角膜组织在4%的PFA下立即固定过夜。随后，石蜡包埋，5点切片μ然后施苏木精和伊红(H&E)三色染色。用光学显微镜(OLYMPUS BX51，日本)检测得到的切片。角膜新生血管分析，第14天对动物实施安乐死，角膜组织嵌入OCT化合物(Sakura Finetek，日本)。样本被切成5μm厚切片免疫荧光染色。用DAPI反染细胞核。切片与CD31一抗(rat anti-mouse, BD Biosciences)在4℃孵育过夜，然后与Alexa Fluor 594山羊抗大鼠IgG (Invitrogen, Grand Island, NY)孵育。用荧光显微镜(x 200)观察新生毛细血管。

2.13。统计分析

所有数据均表示为 。两组间差异有显著性 -测试或方差分析。采用费舍尔精确检验(弗里曼-霍尔顿)来评估治疗的结果。差异被认为在值< 0.05。

3.结果

3.1。ev的分离与表征

在从hP-MSCs培养的培养基中提取ev之前，我们通过流式细胞术检测了hP-MSCs的表型特性。如图所示S1， MSCs维持表面标记CD90和CD44的表达。如前所述，从hp - mc提取的ev被分离，并接受生化和生物物理分析。TEM分析表明，EVs呈杯状形态(图)1(一))。NTA revealed that the average diameter of EVs was approximately 130 nm (Figure1 (b))， 99.4%的ev位于132.1 nm处(图)S2A)。此外，也HCES释放与相似直径的电动汽车（图开通)。免疫印迹分析显示EV蛋白含量及EV蛋白CD9、CD63阳性表达(图)1 (c))。为确定ev是否被HCEs内化，用CM-DiI染料(红色)标记ev并与HCEs孵育在体外。After 24 h, the photomicrographs showed that the labeled EVs were taken up by HCEs (Figure1 (d))。结果表明，EVs已转化为HCEs在体外。

3.2。增强EVs的增殖效应在体外

为分析EVs的最佳工作浓度，将HCEs与EVs一起培养24、48小时。MTT实验显示，与PBS相比，EVs孵育24和48 h后HCEs的增殖能力增强(图)2(一个))。似乎有随着电动汽车的浓度的剂量依赖效应。它揭示了EV浓度在100 μg/mL与hP-MSCs一起培养48h对HCEs的存活率最有利。因此，ev通过促进细胞增殖在组织再生中发挥重要作用。Ki-67染色显示，EVs孵育后HCEs的增殖能力明显提高(图)2 (b)和2 (c))。

3.3。促进EVs角膜创面愈合

为了检测从hP-MSCs中释放的ev的活性和前迁移效应，我们进行了创面愈合试验。结果显示，hP-MSCs释放的ev在孵育12和24小时后显著促进了上皮细胞的迁移(图)3(一个)和3 (b))。接下来我们研究了EVs是否能促进角膜上皮创面愈合在活的有机体内。荧光素染色2mm损伤小鼠眼角膜的图像，在hp - mc来源的ev或vehicle控制治疗前和治疗后7天。如图所示3 (c)与对照组相比，ev治疗组愈合明显明显。

3.4。抑制炎症反应和细胞凋亡

接下来，我们研究了ev是否能够抑制组织炎症和细胞凋亡。采用qRT-PCR检测HCE细胞凋亡基因和炎症相关基因。结果显示IL-1的RNA水平β引发,TNF -α和NF-κ乙分别显著治疗后降低，既在活的有机体内和在体外，而抗炎因子IL-10的增加在体外。与此同时，凋亡相关基因caso -8表达降低，表明EVs在抑制细胞凋亡中发挥关键作用(图)4)。

3.5。EVs调节角膜血管生成

为了确定EVs的血管生成调节潜能，治疗组和对照组均在术后5天使用体视显微镜观察损伤眼新生血管的形成情况，并在术后第5天拍照。如图所示5(一个)，治疗组病理血管生成明显减少，且EV组的眼部透明度优于PBS组。此外，我们测定了促血管生成基因VEGF-a和血管生成相关基质金属蛋白酶2 (MMP2)和MMP9的表达，这些基因在处理后显著降低(图)5 (b))。第14天CD31的免疫染色也显示，应用从hP-MSCs释放的ev后微血管密度显著降低，这与H&E结果一致(图)S3)。所有这些数据表明，电动汽车调节角膜病理性血管生成。

3.6。ev增加了碱烧伤模型的组织修复

为了阐明hP-MSCs衍生ev对角膜碱损伤修复能力的机制，本研究采用角膜碱损伤小鼠模型。H&E染色显示正常角膜上皮由4-5层上皮细胞组成。与EV处理组相比，对照组固有胶原层的纤维排列松散无序，纤维间可见大量裂纹或空泡(图)6(一))。治疗7天后，对照组新生上皮细胞变薄，基质细胞减少。另一方面，ev处理组角膜上皮基本恢复4-5层细胞结构，治疗后角膜基质排列较为规则(图)6(一))。组织的RNA在EV组和对照组中提取。The qRT-PCR analysis of corneal tissues showed that in the treatment group, EVs can significantly reduce the expression of inflammation-related factor genes both in the early phase (24 h) (FigureS1)和在治疗阶段(图6 (b))。这说明治疗组角膜上皮细胞层恢复较快，与角膜基质形成了紧密的联系。

4。讨论

角膜化学损伤是一种常见的损伤类型，常引起广泛的损害甚至永久性的视力损害。在角膜修复过程中，改变局部环境，刺激损伤后局部细胞的反应是角膜组织修复的关键。在本研究中，我们的结果显示，来自于hl - mscs的ev通过抑制血管生成和炎症，促进了小鼠角膜创面愈合，这为转化应用提供了替代的细胞游离治疗。

在干细胞组织修复领域，MSCs已被证明在自体或异体移植中具有潜在的治疗价值[12,13]。在这些研究中，发现供体细胞迁移到损伤部位，抑制了免疫细胞的活性。这一过程由免疫调节因子的产生介导，从而促进组织修复以应对局部炎症环境[21]。在本实验中，我们没有使用广泛使用的骨髓间充质干细胞，而是使用胎盘间充质干细胞。胎盘作为胎儿的副产物之一，可提供相对丰富且无害的干细胞来源。这种细胞的应用增加了实验结果在临床实际应用的可能性[6]。

此外，许多研究表明，干细胞的旁分泌机制发挥对血管重塑具有重要的调节作用[22]和器官恢复的改善[23]。由于间充质干细胞旁分泌作用在其治疗能力中的重要作用在活的有机体内，我们想要了解损伤区间充质干细胞分泌ev的生理过程。Western blots证实了EV标记蛋白CD9和CD63的存在[24]，证明了超离心后hP-MSC培养液中存在EVs。这一内化过程进一步验证了ev作为间充质干细胞与宿主细胞之间的通讯信号的假设。此外，我们还在HCE培养基中发现了EVs的存在，证实了EVs在不同类型细胞间通讯中的存在和潜在功能。

在阐明了ev的存在及其在细胞间的通讯能力之后，我们想了解ev在组织损伤修复中的作用。既往研究表明，损伤部位快速重建完整的上皮对角膜创面愈合至关重要[25]。这是一个高度调控的过程，需要上皮细胞和基质细胞的增殖和迁移。在这里，我们表明，hP-MSC-derived EVs与HCEs共培养可以改善上皮细胞的增殖和迁移，这可以通过Ki-67的高表达和体外划痕试验得到证明。此外，角膜荧光素钠染色结果显示，hP-MSC-derived EVs改善an角膜上皮修复在活的有机体内角膜碱损伤模型;上皮层的整合明显增加。

除了HCE的增殖和迁移，血管生成和炎症调节也可以影响损伤后的修复进展[26]。角膜的血管生成过程通常与角膜损伤后的炎症和缺氧反应有关[27,28]。在此修复过程中，几种类型的细胞，基质成纤维细胞，和生长因子的参与它[29,30.]。因此，许多治疗这些并发症的选择是靶向修饰VEGF和眼表炎症细胞因子水平，以抑制异常血管生成。我们的研究证明ev参与限制促炎因子(TNF-)的产生α,il - 1βIL-8和NF-κB）和caspase-8。在此期间，电动汽车上调抗炎细胞因子IL-10。电动汽车部分改善由碱损伤诱发角膜组织病理学变化。角膜血管密度是治疗组中低得多。

虽然角膜损伤后VEGF的上调与视力丧失有关，但它在维持细胞稳态和组织修复中也发挥重要作用[31- - - - - -33]。抗vegf治疗的疗效因人而异，只导致部分血管退行[34]。长期全身使用抗血管生成药物并伴有多种并发症;这些副作用让人担心VEGF拮抗剂可能不是完全有效或安全的[35]。因此，EVs可能成为角膜创面愈合的一种潜在治疗策略。我们的研究提出了一种新的方法，治疗角膜碱烧伤的管理，hP-MSC-derived EVs。需要进一步的研究来阐明这种处理方法的确切机制以及hP-MSCs产生的EV组成的操纵。

5.结论

综上所述，从hP-MSCs中提取的ev是一种有趣的潜在的改善角膜创面愈合的治疗药物。它结合了多种作用机制，通过刺激HCE迁移和增殖，抑制病理性血管生成，并调节MMP活性。需要进一步研究MSC-derived EVs作为一种治疗剂在改善创面愈合和减少疤痕形成方面的临床效益。

数据可用性

在本研究过程中产生和/或分析的所有数据可在合理要求下从通信作者处获得。

利益冲突

作者宣称，有兴趣对此文件发表任何冲突。

作者的贡献

ZL和LW设计了实验。HT、XC和HC完成了大部分实验。LZ、QL、KZ、ZH、ZCH、ZG收集并分析数据。HT和ZL撰写了主要手稿和图表。ZL和LW提供了资金。所有作者阅读并批准了最终的手稿。陶红艳和陈小楠为这项工作做出了同样的贡献。

致谢

本研究部分得到国家重点研发计划(2017YFA0103200)、国家自然科学基金(81671734)和天津市科技支撑计划(18YFZCSY00010)的资助。

补充材料

表S1: RT-PCR引物序列(人)。表S2: RT-PCR引物序列(小鼠)。图S1:流式细胞术对hP-MSCs表型分析。(补充材料)

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