体内魔角磁共振成像单元跟踪在马低场MRI

摘要

魔角效应提高健康腱组织的MRI信号，并可以用于肌腱结构的更详细的评价。此外，它可以支持由造影剂引起的低信号伪像的判别如用于细胞跟踪超顺磁性氧化铁。然而，马数字浅屈肌腱的魔角MRI尚未在体内站在低场MRI迄今完成的。该体内研究的目的是评估本魔角技术的实用性和其用于跟踪超顺磁性氧化铁标记的多能间充质基质细胞的益处。六匹马在其前肢浅数字屈肌腱腱病诱导与超顺磁性氧化铁标记的多能间充质基质细胞或血清注射局部要么。MRI包括在T1和T2标准和魔角图像系列 -加权序列定期执行。图像分析包括盲法评价和信噪比定量评价。magic angle技术提高了肌腱信噪比( )。低信号假象是在细胞注射的浅数字屈肌腱观察到超过24周，伪影信噪比从腱信噪比在魔角图像显著差异（ )。马指浅屈肌腱的Magic angle成像在站立低场MRI中是可行的。目前的数据表明，该技术改进了从周围肌腱组织辨别超顺磁性氧化铁诱导的人工制品。

1.介绍

在马的实践中，肌腱病变最常影响指浅屈肌腱(SDFT) [1,2而且治疗是具有挑战性的。因此，SDFT是研究活动的焦点，旨在了解肌腱愈合和再生治疗的选择。

站立低场磁共振成像(MRI)为密切监测肌腱愈合提供了良好的机会，特别是使用T2和STIR序列。它还允许在注入超顺磁性氧化铁(SPIO-)标记细胞后，通过根据T1和T2内局部磁场的不均匀性诱导低密度人工产物对细胞进行纵向跟踪 -加权序列。肌腱信号依赖于特定角度腱纤维和主磁场之间[3.]。角 在标准的MRI图像导致MR信号的快速退相，导致健康肌腱组织的低信号。所谓的魔法角效应与一个近似的角度 可能有助于提高诊断程序的价值。T2松弛时间延长，肌腱信号强度(SI)增加[3.,4]。魔术角效应是一种人工产物，在MRI中可以自然发生在肌腱和韧带中，可能导致误诊。但考虑到特殊的临床和科学问题，它可提供更多有关肌腱结构的资料[5,6，有利于鉴别由造影剂(如SPIO)诱导的人工制品与周围组织的区别[7,8]。多能间充质基质细胞的局部注射（MSC）已经建立了与有希望的结果[9- - - - - -11]。然而，我们对注射后细胞的行为知之甚少。因此，MRI跟踪有助于监测间充质干细胞的命运和肌腱损伤的愈合过程。然而，尽管在大多数组织中都可以发现和区分spio标记的细胞，但是由于标记细胞和健康肌腱组织在标准图像中都显示低信号，因此无法明确区分。因此，使用魔术角技术增加肌腱信号和支持鉴别标记的间充质干细胞后注射到肌腱似乎是有利的。这种神奇角度的有益作用已经在体外得到证实[12,13和在家兔体内[14，但迄今尚未在大型动物体内实验中进行[7,8,15]。伯克等人。在2013年已经表明，魔角效应是midmetacarpal区域的SDFT可行的。

我们假设魔角的图像可以从站在低场MRI马SDFT获得。此外，我们的目的是评估从而建立技术造福于肌腱病变细胞跟踪，hypothesising的魔角效应（ )改善肌腱组织内标记的细胞相比，标准的可视化（ )核磁共振成像。

2。材料和方法

2.1。诱导肌腱病变

本研究经莱比锡州伦理委员会(Landesdirektion Leipzig, TVV 34/13)批准，并遵守所有伦理指南。纳入健康标准人群6名，女3名，男3名，年龄3 - 10岁，体重400-550公斤。

肌腱损伤是由在全身麻醉下两前肢SDFT的midmetacarpal区域同一医生诱导。马置于侧卧，并在无菌条件下制备的外科领域。Via a 2 cm vertical skin incision, an 11-gauge bone marrow aspiration needle (Walter Veterinär-Instrumente e.K., Baruth/Mark, Germany) was advanced 2 cm in the proximal direction into the SDFT. During retraction of the needle, 0.4 ml collagenase I (4.8 mg/ml; Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) was injected into the tendon tissue. Subsequently, peritendineum and skin were sutured and the limbs were bandaged. Postoperative management included standardised pain management with nonsteroidal anti-inflammatory drugs (flunixin meglumine; pre- and 10 h postsurgery: 1.1 mg/kg bwt i.v.; day 1 to day 4 postsurgery: 0.55 mg/kg bwt p.o. twice daily; and day 5 to day 6 post surgery: 0.55 mg/kg bwt p.o. once daily). The horses were assessed for pain by a pain scoring system [16术后10天内，每日3次，如有必要，还会给予额外的止痛剂。

2.2。MSC分离和标记

在同一个手术中，皮下脂肪组织从supragluteal区域收集自体MSC的分离如前所述[17,18]。的塑料贴壁细胞级分膨胀，直至通路2，并标以SPIO（Molday ION罗丹明B™;铁浓度：25 μg Fe/ml培养基，培养20小时;BioPAL, Inc.，伍斯特，美国)。MSC被收获 cells per treated tendon were resuspended in 1 ml autologous serum for the intralesional injection. Labelled MSC from each animal were also used to confirm labelling by Prussian Blue staining and flow cytometry, trilineage differentiation potential, and MSC surface marker expression [19]。

2.3。MSC注入

诱导肌腱病变三周后，对肌腱病变进行治疗。 重悬的MSC病灶内注射到1个随机选择的各动物的前肢。1 ml autologous serum was injected as a control into the contralateral forelimb. For this purpose, horses were sedated and perineural anaesthesia of the ulnar nerve and local anaesthesia were performed. The skin was prepared aseptically. A 20-gauge needle was placed in the tendon lesion under ultrasonographic monitoring (10 MHz linear transducer, LOGIQ 5 Expert; GE Healthcare, Munich, Germany), and the cell suspension or serum was injected by the same blinded veterinarian. From week 2 to week 24 after cell injection, the horses were subjected to an increasing exercise program [20.]。

2.4。核磁共振成像

对于MSC跟踪超过24周，两前肢的SDFT在使用马专用低场MRI系统站立，镇静动物（0.27特斯拉MRI单元; Hallmarq兽医成像，吉尔福德，萨里，UK）进行了检查如前所述[8]。考试之前和细胞注射后立即进行，以及1，2，3，4，6，8，12，和24周注射后。每个检查包括横向T1加权和T2 -加权梯度回声MRI序列(表)1)，既作为一个标准系列，也作为一个魔术角度系列。在标准系列中，扫描整个受伤区域。在mscs治疗的前肢的magic angle系列中，成像局限于spio诱导的低点假体区域，而在对侧前肢的magic angle系列中，在注射区域获得了8块切片。

在标准系列中，MRI的极点在掌骨的内侧和外侧形成一个角度 在SDFT和静磁场之间 。对于魔角系列，SDFT被定位于大约一个角度 到磁场 。为了实现这一点，将动物（移动侧身到磁铁，在离开MRI背侧和手掌的掌区域的极点，而腕是弯曲和由一个人手动固定图1)。

2.5。图像分析

使用针杆查看个人版3.4.0.2（针杆信息技术有限公司，奥地利因斯布鲁克）和数学10.1（沃尔夫勒姆研究公司，香槟，IL，USA）进行图像分析。所有的T1和T2 -加权标准和魔角图像系列被随机化，每幅图像中潜在低角人工制品的存在由两名盲法观察者一致定性地确定。首先，显示潜在人工制品的图像被分为两类(第一类:“极有可能与SPIO相关的低点区域”;第2类:“可疑低点区”)以位置、形状和强度为基础(例如见图2)。第1类文物的特点一般是硅含量较低，面积较大，而且往往局限在SDFT内和周围。在此之后，仅使用具有潜在低聚物的图像(第1和第2类)进行进一步分析。使用感兴趣的区域(圆形ROI: 1毫米)来测量这些人工制品的SI²)。此外，伪影区及其SI基于整个可见伪影面积进行了测量。在分配给第1类的所有图像，周围SDFT SI被加测量。In standard images assigned to category 1, tendon lesion SI were determined using a region of interest (circular ROI: 1 mm²)。这在由于肌腱病变和周围腱组织之间的困难划定魔角图像是不可能的。所有的测量由一个单一的观察者重复三次，并用于进一步分析的平均值。此外，背景噪声的标准偏差（SD），基于整个背景区域，获得。

为进一步分析所有第一类图像，请参阅不同结构的信噪比( )及噪音比对比率( )被使用。相比之下，在第2类图像中，仅计算人工信噪比进行比较。毕竟，这些数据是无盲的，所选择的分类是被评估的。全肢系列中所有类别1图像所显示的人工体体积( ;6 mm representing a slice thickness of 5 mm and a gap of 1 mm) were calculated.

2.6。组织学

在本研究另一部分的框架内[19]中，从相同的马在第24周安乐死之后获得的筋的组织学切片。从处理过的腱切片用于确认SPIO标记的MSC仍然存在基于标记试剂的若丹明B分量上。简言之，将切片进行用DAPI（卡尔罗斯GMBH＆Co. KG的，卡尔斯鲁厄，德国）的核的复染。其他样品与普鲁士蓝核固红复染（卡尔·罗斯GMBH＆Co. KG的，卡尔斯鲁厄，德国）进行染色，以评估成纤维细胞样结构的存在。使用Pannoramic扫描II（3DHISTECH有限公司，布达佩斯，匈牙利）所有图像记录。DAPI染色切片在共识由两位观察者定性评价，和普鲁士蓝染色的切片进行两个盲，独立的观察者定量评价。

2.7。统计分析

采用SPSS®Statistics 22 (IBM, Ehningen, Germany)进行统计分析。对同一图像内的SI进行比较，采用威尔金森检验;为了比较不同的图像，Mann-Whitney的然后进行实验。< 0.05为差异显著。

3.结果

3.1。魔角的影响

在低场MRI检查所有SDFT观察魔角效应。我们比较了在两个T1和T2标准图像而获得的健康腱组织高信号和显著更高SDFT SNR在魔角的图像 -加权序列及在所有时间点( )（数据3.和4(一))。

3.2。人工制品歧视

盲审的评估显示，第一类人工制品(图像: )从肢体获得的图像系列的所有部分注射SPIO标记的MSC，这表明SPIO假象的正确的识别（图2)。然而，在第2类人工制品中(图像: ),也有（从控制肢体获得的图像 )或MSC注射之前（ ),因此证明这些图像没有可靠地显示所造成的SPIO标记的MSC假象（图2)。

相比之下，人工制品在magic angle和标准类别1图像中都表现为低信噪比和低信噪比，在大多数时间点没有观察到显著差异(图)3.和4 (b))。有趣的是，SPIO SNR在假阳性类别2倍的图像是不是低至第1类的图像（ ),的差在T1加权的魔角的图像是最明显（图5)。然而，界定SPIO-感生的伪影阈值的SNR值不能被定义。

所有第2类图像都被排除在下面的分析之外。在标准图像中，当SPIO被高强度肌腱损伤所包围时，其边界是清楚的，但当它局限在健康肌腱组织中时，只有在魔术角图像中才能清楚地区分。从人工制品、病变和SDFT得到的SNR值反映了这一观察结果(图)4 (b))。在T1和T2标准图像中，病变的信噪比均明显高于假体 -加权序列及在所有时间点( )。与此相反，SDFT SNR在标准图像在相似范围为伪影信噪比，特别是考虑从整个伪影区域中获得的值。然而，在魔角的图像，SDFT SNR比在两个T1-和T2假象SNR显著更高 -加权序列及在所有时间点( )。这一发现对应于基于SI SDFT和SI人工合成的CNR在magic angle和标准图像之间的比较(图)4 (c))。在T1和T2的幻角图像中，它显著地更高 -加权序列及在所有时间点( )。然而，尽管这些差异，人工制品体积不显著魔角和90°的图像（数据未示出）之间是不同的。

3.3。跟进

类别1个假象可以在MSC注射部位在整个随访期间被区分直到第24周人工制品SNR不断仍然很低，并且相应CNR仍然很高，并没有因减小的信号肌腱愈合期间随时间的T1加权的影响图片。相比之下，T2 -加权图像显示在SDFT SNR，这也是在魔角的图像明显的，并且由CNR在这些图像中的反射减少的趋势。然而，标准和魔角的图像之间的CNR的差异仍然存在，直到第24周（显著 )(图4)。

组织切片的评价显示SPIO标记的细胞仍然存在于在第24周的病变部位，这表明在MRI观察到的伪影对应于标记的MSC（图6)。

4。讨论

本研究的第一个重要的发现是魔角图像可以从站立导致在SDFT具有较高SI图像低场MRI马SDFT来获得。因此，它可用于在马临床前和临床研究。作为展示的一样，细胞跟踪研究这提供了相当大的优势。此外，可用于在肌腱疾病更详细的诊断[魔角的图像5,6]。然而，尽管目前的数据表明这种技术的可行性，但应当承认，SDFT和主磁场之间的可实现的角由所使用的低场MRI扫描仪和动物大小的刚性杆的限制。因此，图像获取的标准化是具有挑战性的和使用的楔的是不可能的。此外，动物的定位应谨慎进行，并有可能成为受伤的马和人的高风险。成功和安全性可能取决于各自的马训练和磨练。

本研究的第二个重要的发现是，魔角技术改善了SDFT SPIO-伪影识别的准确度和可靠性。到目前为止，利用体内细胞追踪魔角效应仅被报道在一个体内研究兔[14]，其中未与标准图像进行比较。

虽然在本研究中，在标准图像系列中确定的人工体积与在魔角图像系列中分析的相似，但不应假设细胞一直单独位于肌腱损伤内。注射入病变后，它们很可能分布在病变周围的健康肌腱和肌腱鞘内[8,15,21]。在我们的研究中显示，在标准图像中，SPIO损伤和健康肌腱组织显示同样的低信号。只有肌腱损伤处的信噪比高于人工制品，因此可以清楚地分辨出来。然而，在整个肌腱内的人工区域的可靠识别几乎是不可能的。这些问题可以克服使用额外的魔法角度图像，以确定文物更准确的位置。在魔角图像中，只有SPIO人工制品显示低信号。因此，将其与周围的肌腱组织区分是可能的，这对于详细跟踪spio标记的间充质干细胞尤为重要。

有趣的是，主观盲审查证明是出奇的准确，在控制肢体或MSC注射前没有低信号区已被归类为“最有可能与SPIO。”相反，所有低信号区域控制肢体或细胞注射液已被认为是之前发现“可疑低信号区”，表明潜在的假阳性文物的正确识别。非特异性假象可以将在不同组织的过渡高磁化的结果出现。然而，由于在可疑和SPIO假象很少离群SNR值，这是不可能的，以限定一固定的阈值的SNR值限定在标准和魔角MRI图像真正SPIO假象。可能地，在SPIO假象这些异常值是由在MRI图像，这导致的信号的干扰，并且因此可以提高特别是小伪影区域的SI所述部分容积效应引起的。对缺乏的假象体积之间显著的差异，这是一个令人惊讶的发现，并强调文物的主观歧视适用于大多数情况下（如也由主观假象分类所示）。然而，魔角效应仍是具有挑战性的情况下非常有用的。

为了证实MRI上看到的人工制品与spio标记细胞相对应，组织学可被视为金标准技术[7,14,15]。在目前的研究中，组织学显示SPIO颗粒存在并定位于重要的纺锤形细胞，直到第24周(图)6)，如先前更详细地描述[19]。然而，虽然组织学仍然验证MRI结果最可靠的方法，它显然不适合用于体内跟踪纵向。因此，在使用MRI来获得标准以及魔角图像系列，细胞追踪是可行历经24周期长。但是，应该承认，低场MRI，尽管使用魔角技术，是不适合检测标记细胞的小数字。使用低场MRI，100000 SPIO标记的MSC是可见的在琼脂凝胶，但较低的浓度可肯定不能区分[8]。肌腱中的细胞浓度随着时间的推移而减少，在MRI和组织学切片检查中表现为人工制品体积的减少[7,19]。除此之外，还有与图8和9周的检测周期筋但没有进一步的后续[分别为约SPIO标记的MSC的纵向细胞跟踪体内研究不同7,8和关节的检测期为12周，无需进一步随访[22]。

这项研究的一个局限是使用低场MRI系统，从而降低图像的分辨率，相对较宽的切片厚度，和运动伪影的风险。然而，由于死亡率的1％的风险，需要在高场系统的马匹检查全身麻醉是一个重大的缺点[23]。此外，恢复阶段可能导致SDFT内高应变，导致上肌腱愈合的可能的负面影响。因此，特别是对于研究涉及到重复检查以及检查马的病人，使用低站在场强MRI与动物的一个风险较低的是有利的。

5.结论

总之，体内魔角成像还没有在大型动物中被描述。目前的数据首次表明，这种方法在马身上是可行的，这对未来的体内研究很有意义。同时，实验结果也证明了该技术在实际应用中用于长期电池跟踪的优越性。

数据可用性

支持本研究结果的数据可从通讯作者处获得。

利益冲突

每个作者证明，他或她有可能会造成与所提交的文章连接的利益冲突没有商业协会。

致谢

我们承认教授的支持MED值。habil。克里斯托夫·乔斯滕该项目包括动物研究。我们感谢亨丽埃特Juelke博士和苏珊·罗斯支持分别给出了关于研究设计提出宝贵的意见，并与兽医护理帮助，动物研究。我们承认卡斯滕博士冬季用于确定背景噪声的标准偏差的援助。我们承认开放获取出版的程序中，从德国研究基金会（DFG）和莱比锡大学的支持。本文介绍的工作也由来自教育和研究的德国联邦教育部（BMBF 1315883）和科学撒克逊部和美术（SMWK）资金成为可能。

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