自体Microfragmented脂肪组织分解代谢和纤维化反应减少了肌腱炎症细胞的体外模型

文摘

背景。间充质干细胞(msc)成为一个有前途的治疗肌腱疾病。Microfragmented脂肪组织(μ脂肪)代表一个方便的自体产品MSC-based疗法在临床的应用。在目前的研究中,的能力μ脂肪来抵消il - 1引起的炎症过程β在人类肌腱细胞(TCs)评估。方法。细胞生存和扩散进行评估后48小时transwell coculture TCs和自体μ脂肪在il - 1的存在与否β。基因表达scleraxis,胶原蛋白I型和III型,metalloproteinases-1和3,cyclooxygenase-2被实时rt - pcr进行评估。VEGF的含量、IL-1Ra TNFα,通过ELISA和il - 6是评估。结果。il - 1β对待TCs显示增强胶原蛋白类型III, metalloproteases, cyclooxygenase-2表达式。μ脂肪可以减少III型胶原的表达和metalloproteases-1以显著的方式,同时,它提高了生产VEGF、IL-1Ra, il - 6。结论。肌腱细胞的体外模型炎症的旁分泌作用μ脂肪,产生抗炎分子和生长因子,能够抑制纤维化和异化的标记物的表达。然后,这些结果表明应用程序μ脂肪可能代表一个有效的保守或辅助治疗治疗肌腱的障碍。

1。介绍

肌腱疾病领域的代表共同条件肌肉骨骼损伤。目前的治疗方法往往会导致不满意的结果,与持久性的痛苦和减少身体活动水平(1,2]。在保守的方法,使用间充质干细胞(msc)的骨髓和脂肪组织成为一个有前途的治疗,能够抵消病理过程描述退行性疾病在骨科领域(3),收集兴趣也肌腱疾病的治疗。的确,成功的应用培养的msc描述治疗肌腱损伤的临床前模型(4]。脂肪中提取干细胞的使用(对asc),或自体脂肪的产品,已经显示功效的肌腱疾病在临床和临床前试验(5- - - - - -8]。体外研究表明,coculture对asc或μ脂肪改善扩散、可行性和胶原蛋白和肌腱细胞VEGF生产(TCs) [9,10]。此外,在TC炎症的体外模型,培养脂肪msc能够减少促炎介质的生产(11]。然而,翻译MSC-based治疗意味着广泛操纵细胞生产的良好生产规范(GMP)条件和高成本是有限的生产和监管问题相关的先进治疗药品(12,13]。脂肪,因此,不同的解决方案和骨骨髓来源MSC隔离在护理点提出了近年来,和令人鼓舞的结果(5,14]。特别是,microfragmented脂肪组织(μ脂肪)代表一个方便的妥协的剥削msc在临床实践中,避免大量细胞操纵,和文化扩张15]。μ脂肪很容易获得通过从自体lipoaspirate商用设备,它已经证明对治疗在临床和临床前设置活动,提供积极的功能结果特别是治疗膝骨关节炎(16- - - - - -20.]。的程序μ脂肪注射生产和兼容是一个单级手术,可能加上不同的手术。本研究的目的是调查的旁分泌作用μ脂肪的促炎和分解反应tnterleukin-1 TCsβ- - - - - -(il - 1β-)介导的炎症。这种分子被描述为炎症状态预防的主要中介组织治疗肩袖损伤(21),和先前的报道表明,il - 1β对待TCs调节分解酶的表达和炎性细胞因子的产生22- - - - - -24]。因此,本研究的假设是,自体μ脂肪分解代谢和il - 1引发的促炎反应会抵消βTCs,提供洞察这个治疗方法的作用机理和强化的基本原理在肌腱疾病使用。

2。材料和方法

2.1。TCs和μ脂肪隔离和收获

肱二头肌肌腱活检和长μ脂肪收集从8例(5女性和3男性,平均年龄: y / o)接受关节镜肩袖修复增强μ脂肪。所有病人的知情同意了按协议批准的机构审查委员会(没有。148年/ INT / 2015年1月13日,2016)。手术前Lipoaspirate脂肪组织收集和处理由Lipogems®设备,根据制造商的指示(25]。一个整除的μ脂肪是在体外实验中收获。简单地说,每一个μ脂肪样本离心机 5分钟在室温下将水相分散的组织。前者是储存在-20°C,而后者被冻结在-80°C的1卷冻结方案(90%的边后卫,10%二甲亚砜;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。采用分离的两个阶段保持注射的构成μ脂肪甚至水冻结解冻和删除后的解决方案。这使得在实验中使用的相同的产品注入在外科手术。

人肌腱细胞(TCs)隔绝长脑袋的肱二头肌肌腱活检获得在关节镜肩袖修复。肌腱组织消化了0.3% 胶原酶I型解决方案(美国新泽西州沃辛顿,莱克伍德)16小时37°C,如前所报道(26]。TCs在完全培养基培养由high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Sigma-Aldrich) 10% 胎牛血清(的边后卫;Euroclone,佩罗,意大利),100 U / ml青霉素,100μg / ml链霉素,0.29毫克/毫升谷酰胺(美国Gibco沃尔瑟姆,MA)和5 ng / ml bFGF Peprotech,伦敦,英国。中每3天更换一次,所有的实验都在通过3。文化后,TCs代表混合人口终末分化和肌腱的祖细胞在分化的不同阶段,如前所报道(26,27]。

2.2。TCs与il - 1β和Cocultureμ脂肪

TCs在12-well盘子被播种密度50000细胞/。TCs都保持在正常培养基或介质添加1 ng / ml il - 1β。此外,细胞对il - 1β与未经处理的细胞被cocultured 250μl (μ脂肪,使of125μl microfragmented组织和125年μ相应的水相。这两个阶段是为了保持水的部分分开μ脂肪,即使融化和冻结的解决方案。μ脂肪被添加到最上层的transwell插入(孔隙大小:0.4μ米),TCs被播种在下面。相同体积的磷酸盐(PBS)添加到transwell最高部分的样品没有μ脂肪。经过48小时的治疗,文化媒体收集和储存在-20°C,而细胞使胰蛋白酶化和存储的小球在-80°C。

2.3。RNA隔离和基因表达

RNA是获得细胞颗粒使用三试剂(Sigma-Aldrich)。简单地说,300年的细胞细胞溶解μl三试剂,然后100年μl (1-bromo-3-chloropropane (Sigma-Aldrich)被添加到样本。离心后 10分钟,间期收集DNA提取RNA在水相沉淀与异丙醇,在75%乙醇洗然后resuspended 20μl RNAse-free水储存在-80°C。

从每个样本总RNA转录的互补使用iScript™互补脱氧核糖核酸合成装备(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA)按照制造商的指示。实时PCR进行从10 ng cDNA、使用PCR混合包含TaqMan®普遍PCR基因表达主人的混合和Assays-on-Demand探针(美国生活技术,沃尔瑟姆,MA)SCX(scleraxis;Hs03054634_g1),COL1A1(α1型胶原链;Hs01076777_m1),COL3A1(胶原蛋白类型IIIα1链;Hs00943809_m1),MMP1(metalloproteinase-1;Hs00899658_m1),MMP3(metalloproteinase-3;Hs00968305_m1),PTGS2(cyclooxygenase-2;Hs00153133_m1)。应用生物系统公司StepOnePlus®(生命技术)被用来执行所有实验(项目:1周期2分钟50°C, 1 10分钟的循环在95°C, 95°C, 15秒的周期和1分钟60°C)。结果规范化的意思表达两个管家基因:YWHAZ(酪氨酸3-monooxygenase /色氨酸5-monooxygenase激活蛋白ζ,Hs03044281_g1)ACTB(β肌动蛋白,Hs99999903_m1)中确定的一项研究[28]。两个复制为每个样本进行了分析,提出了根据数据方法(29日]。

2.4。DNA隔离和量化

获得的DNA分离间期(如上所述)的100%乙醇和离心 5分钟。DNA颗粒在0.1柠檬酸三钠的洗,10%的乙醇溶液30分钟,然后离心机 5分钟。DNA在75%乙醇,然后洗和可溶性50μl 8毫米氢氧化钠储存在-20°C。每个样本的DNA含量是衡量NanoDrop分光光度计在260 nm吸光度使用软件版本3.7.1 (NanoDrop nd - 1000, ThermoFisher科学)30.]。

2.5。TC代谢活动

可行性评估了alamarBlue测定治疗后48小时(美国马ThermoFisher科学、沃尔瑟姆)。简而言之,培养基被和10%的细胞被孵化 解决方案的DMEM alamarBlue 37°C。2小时孵化后,荧光分光光度计测定的(Victor X3,珀金埃尔默,沃尔瑟姆,妈,美国)激发的540 nm和590 nm的排放。

2.6。ELISA

释放interleukine-6 (il - 6)、interleukine-1抗原受体(IL-1Ra)、肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)(Peprotech)和血管内皮生长因子(VEGF)(研发系统,明尼阿波利斯,美国)文化传媒的TCs治疗48小时被ELISA化验分析,根据制造商的指示。检测范围如下:24 - 1500 pg / mL il - 6, 23 - 1500 pg / mL IL-1Ra, 31 - 2000 pg / mL TNFαVEGF和31.3 -2000 pg / ml。

2.7。μ脂肪细胞计数和可行性分析

解冻后,整除的μ脂肪消化0.075% 胶原酶I型(沃辛顿)45分钟37°C。细胞的数量和可行性评估NucleoCounter nc - 3000使用细胞染色可行性(Chemometech、Allerod、丹麦)31日]。的μ脂肪样本用于研究的意思是细胞计数 细胞/毫升,而细胞生存能力 。

2.8。统计分析

所有的分析使用Prism 5.0(美国Graphpad软件,拉霍亚,CA)。高斯分布的数据被Shapiro-Wilk测试评估。单向重复测量方差分析测试与Bonferroni的文章测试用于测量差异治疗当数据提出了一种高斯分布(数字1(一),2 (b),2 (c));否则,弗里德曼的测试和邓恩的测试后(使用数字1 (b),2(一个),3)。一定程度的 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。il - 1β和μ脂肪增强TC代谢活动

il - 1的代谢活动β对待TCs是显著增加对未经处理的TCs ( ),并没有进一步改善coculture引发的μ脂肪。检测不到发炎的迹象的情况下,在transwell cocultured样品μ脂肪表现出更高的代谢活动对未经处理的TCs ( )(图1(一))。DNA内容导致增加在所有情况下,即使在无意义的方式(图1 (b))。

3.2。μ脂肪减少分解和纤维化的基因表达标记

il - 1的存在βTC的表达显著增强SCX( ),MMP1( ),MMP3( ),COL3A1( ),和PTGS2( )对未经处理的TCs,虽然它没有施加任何影响COL1A1表达式(图3)。在这种炎症条件,cocultureμ脂肪减少的表达COL3A1(-57%, )和MMP1(-41%, )(数据3 (c)和3 (d)),对其他参数的影响。没有影响的μ脂肪在MMP3观察表达,而这是强烈诱导il - 1β治疗(图3 (e))。此外,TCs coculturedμ脂肪,有或没有il - 1β,显示出减少的表达COL1A1对未经处理的TCs ( 和 在il - 1的存在与否β分别(图)3 (b))。轻微的增加SCX表达在TCs coculturedμ脂肪和il - 1处理β,对il - 1β只有治疗细胞(+ 12%,n。)(图3(一个))。

总体增长了5倍COL3A1在il - 1 / COL1A1表达式比观察β对待TCs对未经处理的TCs ( ,数据未显示)。在炎症条件下(+ il - 1β),cocultureμ脂肪可以降低比率,即使增高无统计学意义的方式(-27%,n。),而在TCs +μ脂肪,增加比例以无意义的方式相比,未经处理的TCs样本,检测不到发炎炎症和迹象的条件。

3.3。il - 1β和μ脂肪提高细胞因子的生产和VEGF

在il - 1的存在β一个增强il - 6的生产( )观察对未经处理的TCs,这进一步增加了cocultureμ脂肪(+ 45%, 对TCs + il - 1β)(图2(一个))。相反,IL-1Ra生产不是il - 1诱导的β或μ脂肪,而当代的存在这些因素显著增加的生产这个分子(+ 217%和+ 290%,对未经处理的TCs和il - 1βTCs治疗; )(图2 (b))。VEGF诱导了il - 1的生产β对未经处理的细胞(+ 109%, )或μ脂肪coculture(+ 116%未经处理的细胞, );这两个因素的结合进一步增加VEGF与TCs相比产量(+ 29%接受il - 1β, )(图2 (c))。肿瘤坏死因子的内容α无法在所有样本(数据未显示)。

4所示。讨论

本研究旨在测试自体的能力μ脂肪在支持组织愈合肌腱细胞的炎症。我们的研究结果表明的旁分泌作用μ脂肪有效减少分解代谢和肝纤维化标志物的表达在pair-matched TCs在炎症条件下培养。这项工作的强度是使用patient-matched TCs和μ脂肪,允许考虑inter-donor变异性在这两个元素。

更多的细节,在细胞暴露于il - 1β的旁分泌作用μ脂肪能够显著降低COL3A1 / COL1A1积极与沉积的比例rupture-prone纤维化肌腱矩阵(32,33),证实了先前的发现获得cocultures TCs和脂肪msc (34,35]。il - 1β被描述为肌腱炎症的关键效应导致适当的愈合过程的抑制21,23,24),也提高分解酶的生产,如MMP1和MMP3参与肌腱矩阵退化(36,37),并增加胶原蛋白类型III表达式胶原蛋白类型。此外,il - 1β直接诱导酶的生产cyclooxygenase-2 (cox - 2),典型的炎症标记(38]。有趣的是,在炎症细胞培养条件的存在μ脂肪显示整体减少的绝对表达胶原蛋白I型和III。III型胶原的增加受伤后与疤痕组织的形成有关,它允许迅速愈合的组织质量和功能(39,40]。在这个视图中,较慢的基质沉积,不同类型的胶原蛋白之间的比例是相似的生理水平,代表了一种治疗旨在提高再生组织的质量目标。

此外,μ脂肪抑制MMP1表达,暗示对肌腱ECM完整性保护作用。Metalloproteases至关重要的生理维护肌腱细胞外基质(ECM)体内平衡(41),在一定程度上抑制基质金属蛋白酶的结果在病理变化和痛苦42]。另一方面,过度的MMP的表达与异常相关矩阵退化,典型的退化性肌腱疾病(43]。特别是MMP1显然参与肌腱病理学与il - 1的作用β(44,45]。的影响μ脂肪MMP的表达与之前是一致的观测报告的模型synoviocytes发炎,支持抑制MMP-related矩阵退化作为本品的作用机制(46]。此外,当炎症过程不涉及,μ脂肪对基质金属蛋白酶的表达几乎没有影响,这表明它不会抑制生理肌腱ECM重塑。

在这项研究中,il - 1的影响βtendon-specific转录因子的表达SCX也被评估。虽然以前的报告显示一个抑制其转录在炎症条件下(23,47,48),在我们的模型中,il - 1的存在β显著增加SCX表达式。文学作品中描述的结果之间的差异和在本研究报告可能是由于不同来源TCs和炎症性协议。因为脂肪msc已知生产营养mediator-specific TCs (49),略有减少SCX观察表达TCs cocultured时μ这个差别脂肪基础条件,对这些基因的标记已经报道后被其他作者TCs-MSCs coculture [34]。这些观察表明,μTCs脂肪(msc)营养行动可能是独立的SCXupregulation。

我们的研究结果显示,没有影响的μ脂肪在PTGS2表情,无论是在炎症还是检测不到发炎的迹象的条件。正如所料,PTGS2转录增强il - 1β治疗对基底条件,il - 1β这个基因编码的主要诱导物COX2 [38]。COX2已经报道,尽管它在炎症中的作用发挥了重要的作用在维护肌腱体内平衡和ECM成熟50,51]。因此,这种酶的表达可能代表不仅作为炎症的症状,而且作为响应TCs对组织愈合。

il - 1β和μ脂肪都展示了一个加强对TC代谢活动的影响和DNA含量,即使没有发现统计学意义后者。有趣的是,这种效果不是进一步增强il - 1的使用β在TCs coculturedμ脂肪,缺乏添加剂/协同行动的两个元素在这些参数。

在我们的模型中,由于使用transwell系统,修改引起的μ脂肪在TC基因表达及其代谢活动被归结为旁分泌活动。特别是,μ脂肪增加可溶性IL-1Ra的内容,il - 6和VEGF在培养基。IL-1Ra直接抑制il - 1的人β,它的作用与绑定的细胞因子il - 1受体1 (52),在某种程度上,开发了IL-1Ra-based治疗类风湿性关节炎和其他autoinflammatory疾病(53]。IL-1Ra生产了μ脂肪样品只有在炎症的存在条件,表明这是一个反应μ骨髓间充质这个条件FAT-embedded脂肪。事实上,这些细胞对il - 1β刺激通过释放IL-1Ra [54从其他来源),以及msc (55]。

正如预期的那样,在我们的模型中,il - 6的含量是增强il - 1的存在β(56),μ脂肪进一步增加了产量。这种效应可能是与il - 1β介导的il - 6的感应细胞中μ脂肪(54),即使有小的证据直接病理变化介导的il - 6在TCs和肌腱矩阵生产(57),这方面应该考虑可能的副作用当应用细胞再生医学产品。il - 6在肌腱病态的角色已经被一些研究证实,它被认为是炎症的证据之一参与病变(58]。的确,il - 6增加了眼泪和破裂后,以及剧烈运动和伤害后,在人类和动物59]。然而,尽管它在炎症中的作用,il - 6展示一个免疫调节活动,它演示了支持tenocyte增殖和生存,因此产生的效应物的肌腱愈合的早期阶段(60- - - - - -62年]。此外,il - 6产生VEGF的生产(63年),在血管生成生长因子主要是闻名的作用,这也是参与组织再生,施加一个自我平衡的函数(64年]。不同观察il - 6, VEGF诱导的il - 1β和μ脂肪治疗在相同的强度,进一步增强了这些因素的结合。然后,因为il - 6只是略有增强μ未经处理的TCs脂肪治疗相比,μFAT-induced VEGF生产似乎至少在一定程度上独立于il - 6的分泌途径。尽管促进血管生成可能导致有害的肌腱ECM完整性(65年),VEGF能改善肌腱愈合强度在几项研究[66年- - - - - -68年]。

msc和的能力μ脂肪旁分泌炎症介质,以抵消描述,据报道在几个模型涉及不同的细胞和组织,包括软骨细胞、synoviocytes,中枢神经系统(46,69年,70年]。事实上,增加产量的VEGF表达增强SCX在某种程度上,COL3A1,表明il - 1βTCs还引出一个初始修复反应(71年]。这个观察是一致的祖细胞的亚群,表明间充质干细胞的特性/基质细胞,在TCs (26,72年]。在病理条件下,老化,祖细胞的存在可能会减少,导致止血功能的丧失,因此组织变性(73年]。然后,向受伤的组织提供一种方便的自体msc体内平衡和免疫调节活动完全代表应用程序的基本原理的细胞集中在退行性疾病。

本研究的局限性是由使用nonphysiological炎症刺激,可能导致大大强于发生体内,因此部分屏蔽的能力μ脂肪,以抵消分解反应。此外,的数量μ根据以往的报道[脂肪被选9),但细胞和组织之间的比例几乎没有对应的生理比率。另一个限制是由可能的影响病人的特点的活动μ脂肪,并没有考虑在目前的工作,而它可能确实识别那些nonresponders的一小部分μ脂肪治疗由于病理或脂肪组织功能(74年),因此代表偏见的来源。

获得的结果在这个工作维持的基本原理μ脂肪应用肌腱疾病和他们可能为未来临床资料的解释提供依据,识别可能的机制μFAT-mediated对肌腱愈合的影响。临床试验目前正在进行的评估可能的临床受益μ脂肪注射在关节镜辅助治疗肩袖修复,尤其是retears的可能减少。

5。结论

在炎症情况下,分解代谢和profibrosis TCs展示了基因表达的模式,同时,产生分子与一个角色在组织愈合。的cocultureμ脂肪不仅减少纤维化和异化的标记的表达但也增强了细胞因子和生长因子的生产能够抵消炎症过程和促进组织再生。这些观察的临床应用提供理论基础μ脂肪治疗肌腱疾病。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由意大利卫生部“Ricerca Corrente。”

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