血管内皮生长因子的影响在大鼠骨髓间充质干细胞移植纤维化肝脏移植

文摘

背景。根据现有的相关实验和研究报告,干细胞移植疗法已被证明有积极影响肝纤维化、肝硬化的复苏,但出于某种原因,这个治疗仍不能广泛应用于临床工作。不容忽视的一个原因是低数量的外源性干细胞移植到体内肝脏。因此,我们调查是否使用血管内皮生长因子(VEGF)可以增加干细胞移植的数量,提高干细胞移植疗法的疗效。方法。使用Sprague-Dawley大鼠肝纤维化模型,我们移植到纤维化肝脏移植骨髓间充质干细胞(bmsc)与chlormethylbenzamido-1贴上标签,1-dioctadecyl-3, 3、3所示3-tetramethylin-docarbocyamine (CM-DiI)或通过尾静脉注射VEGF腺病毒解决上述两个操作同时进行的。细胞表面受体的BMSC被流式细胞仪和免疫荧光染色检查。肝血管漏测量正弦和埃文的蓝色染料测定。石蜡切片染色,染色immunofluorescent RT-qPCR(定量逆转录聚合酶链式反应),和免疫印迹被用来评估肝脏病理变化和生理功能。结果。体内研究表明,与其他组大鼠比较,综合治疗的老鼠BMSC移植和VEGF注入表现出明显降低肝纤维化。埃文的蓝色染料试验表明,注射VEGF腺病毒解决方案后,老鼠的肝正弦磁导率会增加。我们确认很晚antigen-4 (VLA4,整合素的表达α₄β₁)在大鼠bmsc的表达升高血管粘连molecule-1 (VCAM-1)肝正弦内皮细胞。此外,分析CM-DiI-labeled BMSC表明BMSC + VEGF组表现出更好的细胞移植和道细胞主要分布在肝实质。此外,相比之下,其他情况下,最好是重建后大鼠的肝脏分泌和再生功能应用VEGF和BMSC相结合。结论。我们表明,VEGF促进bmsc移植的肝纤维化,肝脏的再生,改善肝脏功能。这些结果可能与增加肝正弦内皮渗透性和VCAM-1-increased表达式。

1。背景

肝纤维化是一种慢性疾病导致的重复伤害到肝脏,引起感染,药物毒性,代谢紊乱,免疫细胞毒性(1]。纤维化的特点是独特的隔板组成的细胞外基质蛋白和形式通过多个单元之间的相互作用和因素(2,3]。临床上,晚期肝纤维化称为肝硬化表示肝功能的重要障碍。肝纤维化和肝硬化是13^th全世界成年人死亡的主要原因(8^th在美国),每年造成约1.03亿人死亡4,5]。治疗肝纤维化、肝硬化是有限的,肝移植是最知名的治疗策略。然而,由于缺乏可用的供体肝脏,并不是每一个病人需要肝脏移植是可以治疗的。具体地说,研究显示,只有三分之一的终末期肝病患者能够接受肝脏移植手术,在接下来的20年里,对肝移植的需求将增加23%6,7]。因此,迫切需要开发替代治疗慢性肝病患者。重要的是,应用干细胞疗法治疗肝纤维化/肝硬化近年来已成为一个热点话题。特别是,间充质干细胞(msc)分化成肝脏,就好像细胞后嫁接到肝脏,促进肝脏再生,并调节免疫系统功能降低肝损伤(8- - - - - -10]。然而,一个关键的挑战与应用msc治疗肝纤维化/肝硬化是道的少量msc在肝脏可能限制他们有益的功能(11,12]。

VEGF增加血管通透性,首先报道了圣吉et al。13]。肝正弦内皮是有孔的,由独特的内皮细胞与特定的频道(孔隙大小6 - 9μ米),缺乏基底膜和展览高导磁率(12,14]。VEGF增加了孔隙大小和肝正弦内皮细胞的渗透性,促进循环的招聘细胞(单核细胞等)通过肝肝实质正弦内皮(15,16]。此外,VEGF促进某些干细胞特异性受体的表达于内皮细胞,如VCAM-1。VCAM-1特别是干细胞表面受体结合α₄β₁整合素和介导外源性干细胞的移植肝实质(17,18]。基于可用的文学,因此我们假设VEGF促进外源性干细胞移植肝正弦内皮的渗透性增加和诱导VCAM-1表达式。在这项研究中,我们调查了VEGF在BMSC移植肝脏的影响通过使用肝纤维化大鼠模型。

2。材料和方法

2.1。实验动物

成熟女性Sprague-Dawley (SD)老鼠(8-week-old, 180 - 220 g)和不成熟的SD雌性大鼠(枚)两星期购买实验动物研究所的四川省医学科学院&四川省人民医院(成都,四川,中国)。成熟的无菌老鼠被关在笼子里,温度 和相对湿度 。综述了动物实验和动物实验伦理委员会批准的机构实验动物研究所的四川省医学科学院&四川省人民医院(成都,四川,中国;批准)。按照规定的程序进行事务管理部门的有关实验动物(中国,1988)。

2.2。肝纤维化大鼠模型

经过一个星期的适应,8-week-old老鼠和CCl 40%四氯化碳(管理₄无菌条件下,恒星、天津、中国)0.3 mL / 100克体重通过腹腔内注射,每周两次为12周。12周后注射6从幸存的老鼠和老鼠随机选择安乐死。尾状叶的组织切片和染色,以确保纤维化水平均匀的老鼠。马森染色用于检查证实肝纤维化胶原蛋白的存在。

2.3。BMSC分离、培养和鉴定

BMSC的隔离和文化进行了根据以前公布的方法(19]。总之,骨髓细胞收集的股骨和胫骨枚SD大鼠两星期。骨髓细胞收集到一个单独的细胞悬液,旋转 5分钟,上层的移除,并完成培养基(CCM)添加到resuspend细胞。bmsc培养25厘米²培养瓶的密度 。细胞被维持在37°C, 5%的公司₂在饱和湿度孵化器(设计马力- 9082,逸恒公司,上海,中国。CCM DMEM-Low葡萄糖组成的(美国犹他州洛根SH30021.01B, HyClone)含10%胎牛血清(的边后卫;10099、Gibco卡尔斯巴德、钙、美国)和0.5%青霉素和链霉素(ST488, Beyotime、海门、江苏、中国)。bmsc从骨髓细胞纯化使用附着的方法。一旦细胞融合达到70 - 80%,他们收获的连续的段落。第三通过对数阶段收集的bmsc移植。

2.4。流式细胞术

P3鼠bmsc与PBS洗两次,分离trypsin-EDTA为0.25%(25200年,Gibco)。然后离心机BMSC悬挂 5分钟27°C收集细胞沉积。bmsc再次洗两次PBS和屏蔽5%正常山羊血清1 h在4°C。然后,bmsc与fluorescein-labeled孵化抗体,包括anti-CD90(1: 100年,ab225 Abcam,旧金山、钙、美国),anti-CD29(1: 100年,ab78502 Abcam) anti-CD45(1: 100年,ab30446 Abcam)和anti-VLA4(1: 100年,ab25247 Abcam)抗体。非特异性的兔免疫球蛋白担任同形像控制。之后,荧光信号的综合定量分析通过BriCyte E6(迈瑞DS Inc .,新泽西,美国)流式细胞分析仪波长488 nm和FlowJo 7.6.1软件(树明星,Inc .)、亚什兰,美国)。

2.5。体内治疗组

纤维化模型SD大鼠随机分为4组( 老鼠/组),包括模型组VEGF组BMSC集团,BMSC + VEGF组。从第一周开始,VEGF组和BMSC + VEGF组静脉注射一次VEGF-overexpressing腺病毒(AdVEGF OBiO技术、上海、中国) (0.5毫升),每周4周。其他两组静脉注射生理盐水(0.5毫升),每周4周。在第二周,老鼠在所有组与3%戊巴比妥麻醉(3毫克/ 100克,MFCD00070198,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)剖腹手术之前。BMSC + VEGF组和BMSC集团, BMSC悬挂(0.5毫升)是通过注入门静脉移植使用BD胰岛素注射器(Becton, Dickinson和公司、上海、中国)。对于其他两组,0.5毫升生理盐水通过肝门静脉注射。在每一组中,老鼠牺牲BMSC移植后28天。所有动物的乳头状叶的活检在手术过程中,以确保相同的每组肝纤维化。此外,为了确定腺病毒在肝纤维化过程中发挥作用,我们建立了两个新的组( );肝纤维化大鼠治疗伴着孤独和BMSC + adenoviral向量。从第一周开始,BMSC + adenoviral向量组静脉注射腺病毒载体(OBiO技术,中国上海) (0.5毫升),每周4周,和BMSC单独组静脉注射生理盐水(0.5毫升),每周4周。在第二个星期, BMSC悬挂(0.5毫升)是通过注入门静脉移植使用BD胰岛素注射器。老鼠的组织也牺牲了BMSC移植后28天,和乳头状叶采集标本,供病理切片检查。进行的所有操作在一个无菌的环境中,和动物带回他们的笼子从麻醉中醒来之后。

2.6。制备肝组织学标本

2.6.1。石蜡包埋肝组织部分

新鲜肝组织固定在4%多聚甲醛(AR1068 BosterBio,,而钙、美国)至少24小时。在梯度酒精脱水后,组织是嵌入在石蜡(泰康、TKY-BMB、湖北,中国),使用冷冻切片机切片(呼吸暂停,MNT、美因茨、德国)的厚度4μm。

2.6.2。Hematoxylin-Eosin染色(圆)染色法)

发布的染色根据协议执行卡迪夫et al。20.]。简单地说,是脱蜡,石蜡包埋肝部分患者,苏木精和伊红染色(C0105、Solarbio科技、北京、中国)可视化细胞核和细胞质。接下来,部分脱水,二甲苯清除,和盖玻片安装与合成媒体(Permount徐占云(音译)先生办,中国上海)。分析了部分生物显微镜下(CX43奥林巴斯,Shinjuku-ku,东京,日本)和图像。

2.6.3。马森染色

石蜡包埋肝脏部分脱蜡、水化,并与苏木精染色和朱红色年代之后,磷钼酸治疗和苯胺蓝染色(415049年,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。幻灯片分化在1%乙酸1分钟。使用显微镜检查的部分(CX43,奥林巴斯)和图像捕获。

2.6.4。小天狼星红染色

石蜡包埋肝脏部分脱蜡、水化、染色饱和Picro-Sirius红色解决方案(365548年,σ)8分钟,用100%乙醇洗净,干在烤箱60°C,清除在二甲苯为5分钟,安装在一个中立的香脂安装介质(E675007、Solarbio科技、北京、中国)。使用显微镜检查的部分(CX43,奥林巴斯)和代表图像被抓获。

2.7。Immunofluorescent(如果)染色

Immunofluorescent染色的BMSC表面标记进行six-hole盘子。six-hole板块中的细胞培养在孵化器(热,沃尔瑟姆,马,美国)37°C, 5%的股份有限公司₂和饱和湿度。细胞生长和融合在一个覆盖-100%下滑至95%,固定为4%甲醛在室温下30分钟后洗3次,冲洗triton x - 100 0.2% (Bomei生物科技有限公司、合肥、中国)3分钟,然后封锁在室温血清为30分钟,其次是主要抗体孵育过夜在4°C: anti-CD29抗体(1μg / mL, ab95623 Abcam,旧金山,美国),anti-CD45抗体(1μg / mL, ab25386 Abcam,旧金山,美国),和anti-CD34抗体(1μg / mL, ab81289 Abcam,旧金山)。洗3次后,二次抗体(1:1000年,山羊anti-mouse IgMμ链,ab97228, Abcam,旧金山,美国)被用来孵化为30分钟在黑暗中在室温下。部分再次洗和密封95%甘油。石蜡包埋的肝脏部分准备如上所述。石蜡包埋的肝脏部分脱蜡、水化。抗原检索使用EDTA进行柠檬酸(pH值6.0)抗原检索缓冲区(G1202、Servicebio、武汉、湖北、中国)在80°C恒温水浴(Jinpai, hh - 600、上海、中国)。幻灯片冷却下来后,他们洗3次瓶(5分钟)。部分是围绕用组织学和笔淬火的自体荧光冷却器(G1221 Servicebio) 5分钟。清洗步骤(10分钟),后部分被封锁在血清30分钟,其次是主要抗体孵育过夜在4°C:反αsma (αGB13044平滑肌肉肌动蛋白,1:500年,Servicebio), anti-collagen III(1: 200年,ab7778 Abcam), vegf(1: 200年,ab39250 Abcam) anti-VCAM-1(1: 100年,ab134047 Abcam) anti-PCNA(增殖细胞核抗原,1:1000年,GB11010, Servicebio),和anti-Ki67(1: 1000年,ab15580 Abcam)。部分被洗3次瓶(5分钟),其次是二次抗体(山羊anti-rabbit alexa - 488, ab150077, 1: 500年,Abcam)孵化50分钟在黑暗中在室温下。部分被洗3次,其次是DAPI核染色(G1012 Servicebio)。部分再次清洗和安装不变色安装介质(G1401 Servicebio)。幻灯片是在荧光显微镜下分析和图像捕获。

2.8。免疫印迹

总蛋白样本提取肝组织使用缓冲区里帕(G2002 Servicebio)和蛋白质浓度测定用BCA蛋白质化验设备(G2026 Servicebio)。蛋白质样本解决使用10% sds - page,然后转移到PVDF膜(IPVH00010,微孔,丹弗斯,妈,美国)。膜在一夜之间被封锁和孵化主要抗体在4°C。总共有8商业抗体用于免疫印迹,包括反α博士德sma(1: 1000年,美国),anti-TGFβ1(转化生长因子β1:1000年,Abcam), anti-collagen III(1: 1000年,ab6310 Abcam), vegf(1: 1000年,ab46154 Abcam) anti-CYP3A1(1: 1000年,ab22724 Abcam) anti-ALB(白蛋白,1:1000年,Abcam) anti-VCAM-1(1: 1000年,Abcam)β肌动蛋白(1:1000年,Servicebio)。膜在室温下孵化了一个适当的二次抗体,和蛋白质检测使用一个增强化学发光方法。蛋白表达是归一化的表达β肌动蛋白作为内部控制。

2.9。RT-qPCR

肝组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(G3013 Servicebio)。接下来,互补脱氧核糖核酸合成使用RevertAid M-MuLV逆转录酶(RevertAid第一链cDNA合成装备,K1622,热科学、沃尔瑟姆,妈,美国)2μg总RNA和低聚糖dT18-primers。RT-qPCR进行了一式三份,每个25μL反应包括2 x qPCR混合(12.5μL), 7.5μM gene-specific引物(2.0μ(2.5 L), cDNA模板μL), ddH₂O (8.0μL),引物序列表中列出1。基因表达结果规范化内生GADPH mRNA的表达。Thermocycler条件如下:最初在95°C 10分钟,其次是40 95°C的两步PCR程序的周期为15秒和60°C,持续60秒anABI7500系统(ABI,促进城市、钙、美国)。数据收集从相同的仪器和定量分析。每个目标mRNA的表达水平表示为一个褶皱变化相对于未经处理的控制。数据分析使用GraphPad软件版本6。

2.10。荧光标记bmsc的

在第二个通道(bmsc 细胞)在PBS resuspended(1毫升)和混合5μL 1 g / L的荧光染料(CM-DiI, 40718 es50 Yeasen,上海,中国)为5分钟37°C,然后搬到4°C,持续15分钟。的最终浓度CM-DiI是5μmol / L。最后,这些细胞被洗除去游离CM-DiI PBS。

2.11。测量肝正弦内皮渗透性

埃文是蓝色的(σ)染色被用来评估正弦内皮的通透性白蛋白。这项技术是基于原则,埃文带负电的蓝色染料结合贪婪地血管内白蛋白,因此大分子transvascular通量的可靠估计。BMSC移植28天后,老鼠与3%戊巴比妥麻醉(3毫克/ 100克),然后注射2% Evan的蓝色染料经股静脉(30毫克/公斤)。染料被允许流通的大鼠肝脏和肝素灌注前30分钟——包含PBS (50 U /毫升)。灌注时停止污水变得清晰,肝脏是收获。肝脏被干48 h 60°C和体重。整个肝脏均质在PBS(0.1毫克组织/ 1毫升)和孵化双甲酰胺的体积为18 h 56°C。组织匀浆然后旋转 30分钟。接下来,1毫升的上层清液的收集,和埃文的蓝色是检查使用分光光度计(sp - 756 p,频谱、上海、中国)在620海里。结果表示为埃文是蓝色的数量每克组织,高数量的Evan的蓝色染料从组织(每克)与船渗透率越高的组织(18,19]。

2.12。肝纤维化评分标准

为了让读者有直接、准确的理解在每个组大鼠的肝脏病理变化在我们的实验中,我们用双盲法研究与雷奈克纤维化评分系统(21)评估肝纤维化。表2评分标准的具体细节。

2.13。统计数据

未配对学生的 - - - - - -测试是用来制造比较两个实验小组。三个或更多组相比时,多个比较了使用方差分析其次是Bonferroni事后测试来确定意义。值被认为是重要的 。

3所示。结果

在体内研究中,我们确认所有的老鼠每组肝纤维化几乎相同。马森染色被用来评估肝纤维化的程度(图1)。我们没有观察到任何团体之间的差异纤维化的发展。肝脏标本展出严重纤维化,广泛而完整的隔膜,分隔作用,圆形的轮廓和得分4使用雷奈克纤维化评分系统,表明严重的肝纤维化或肝硬化。

培养bmsc需要限定在几个方法之前被移植到大鼠肝纤维化模型。第三段在对数生长期的bmsc收集和相差光学显微镜下检查(Shinjuku-ku CKX31,奥林巴斯,东京,日本)。这些细胞被定期安排在一个旋转模式,大多是长轴的形状(图2(一个))。Immunofluorescent染色显示,第三通过bmsc CD29-positive和CD34, CD45-negative(图2 (b))。为了进一步描述bmsc,细胞表面标记蛋白质被流仪分析和immunofluorescent染色检查。流式细胞术的结果发现高水平的表面抗原CD29(99.3%)和CD90(96.3%)和消极的乙肝表面抗原CD45(0%)(图2 (c))。研究表明VLA4表面主要是表达干细胞和它可以绑定到VCAM-1 [17]。我们证实VLA4表示培养bmsc在第三个通过流式细胞术分析(图2 (d))。

肝纤维化程度的四组老鼠的BMSC处理和/或VEGF是全面评估使用组织染色,immunofluorescent染色、免疫印迹,RT-qPCR(图3)。组织学部分得分使用雷奈克纤维化评分系统。具体来说,我们发现,模型组表现出严重纤维化,广泛而完整的隔膜,分隔作用,和圆的轮廓(得分4)。BMSC组表现出适度薄隔和不完整的肝硬化(3分),而BMSC + VEGF组表现出薄和不完整的隔膜与门户纤维化(分2)。最后,VEGF组与模型组表现出相似的表型(图3(一个))。此外,immunofluorescent染色显示胶原三世和αsma,对肝纤维化指标,分布在隔板和肝实质和隔板特别丰富。模型组和VEGF组表现出明显的胶原蛋白沉积,但这两组之间没有差别。BMSC组中度胶原沉积,胶原蛋白三世主要在隔板和分发αsma主要分布在汇管区和隔膜,而BMSC + VEGF组最低数量的胶原蛋白沉积(图3 (b))。TGFβ是一个重要因素在肝纤维化的形成22]。蛋白质免疫印迹分析进一步验证BMSC, BMSC + VEGF组TGF水平较低β模型和VEGF组相比,BMSC + VEGF组TGF的最低水平β在所有组(图表达3 (c))。这些结果表明,有效地抑制了profibrotic因素的表达的BMSC + VEGF组。

重要的是,il - 6(白介素6)也已被证明能够促进肝纤维化的起始。与模型组相比,BMSC, BMSC + VEGF组il - 6 mRNA水平较低,最低的BMSC + il - 6表达的VEGF组(图3 (d))。VEGF组和模型组的il - 6水平可比和COL3A1信使rna。此外,我们还研究了epithelial-mesenchymal过渡(EMT)在基因层面的因素。与模型组相比,BMSC组和BMSC + VEGF组波形蛋白的表达减少,Twist1 Snail1,蛞蝓和增加钙粘蛋白的表达和occludin(图3 (e))。总的来说,我们观察到的基因表达谱VEGF组几乎相同的模型组,基因表达谱的BMSC + VEGF和BMSC组也比较。

此外,我们检查了VEGF表达水平在肝脏使用immunofluorescent染色(图4),观察VEGF组和BMSC + VEGF组有更多强烈的染色相比,模型组(图4(一)),又一次重复的VEGF免疫印迹结果(图4 (b))。此外,RT-qPCR分析表明VEGF组和BMSC + VEGF组VEGF mRNA的水平明显高于模型组相比。此外,VEGF mRNA水平BMSC + VEGF组显著高于BMSC组(图4 (c))。此外,VCAM-1表达的水平和模式类似于VEGF在四组,表明VCAM-1表达升高肝正弦内皮细胞(数字4(一)- - - - - -4 (c))。

bmsc与CM-DiI标记在体外,其余CM-DiI-labeled细胞在肝脏被表明移植的供体bmsc(图4 (d))。BMSC组表现出低水平的BMSC移植,细胞主要分布门户和相邻隔板。相比之下,BMSC移植是更高的BMSC + VEGF组细胞主要分布在肝实质(图4 (d))。此外,我们研究了渗透率肝正弦内皮的四组。Evan的蓝色在肝脏的保留是反映肝正弦内皮的渗透率。数据显示在图4 (e)表明,VEGF组和BMSC + VEGF组最高水平的残余Evan的蓝色染料(图4 (e))。

评估肝功能在所有四组治疗的老鼠,我们检查肝Ki67的表达,对细胞增殖核抗原和PCNA,肝脏再生的象征(图5)。与模型组相比,BMSC和BMSC + VEGF组Ki67的比例更高⁺和PCNA⁺细胞。此外,BMSC组相比,BMSC + VEGF组有更多的Ki67⁺和PCNA⁺细胞,而VEGF组和模型组增殖细胞的数量大致相似(图5(一个))。

此外,我们研究了两个肝功能指标的蛋白质含量,CYP3A1和铝青铜,免疫印迹(图5 (b))。与模型组相比,BMSC和BMSC + VEGF组有更高水平的CYP3A1和铝青铜。重要的是,CYP3A1和铝青铜的BMSC + VEGF组高于BMSC组(图5 (b))。此外,葡萄糖的mRNA水平6-phosphatase (G6pase)和铝青铜也检查RT-qPCR(图5 (c))。G6Pase是一个重要的病原反应酶,调节肝醣类(23]。与模型组相比,BMSC和BMSC + VEGF组有更高水平的G6pase和铝青铜,而VEGF和模型组并没有不同。尽管G6pase和铝青铜稍高的BMSC + VEGF组相比BMSC组;差异没有统计学意义(图5 (c))。

为了确定腺病毒在肝纤维化过程中发挥作用,两组肝纤维化大鼠治疗伴着孤独和BMSC + adenoviral向量。从上面的结果,我们没有发现不同程度的纤维化。两组有隔膜的中等厚度和不完整的纤维化(雷奈克得分3)(图6)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们已经表明,伴着有能力减轻肝纤维化,包括标记的恢复与改善肝功能,抑制炎症,增加肝细胞再生。此外,我们的研究表明,外源性VEGF的政府,bmsc对肝纤维化的治疗效果可以得到改善。

许多最近的报告一直专注于干细胞疗法治疗终末期肝脏疾病(24,25]。重要的是,许多临床研究已经证明,干细胞移植改善肝病患者肝功能(26]。然而,它具有重要意义知道如何增加外源性干细胞的移植肝脏受伤的进一步改善治疗的疗效。肝脏正弦信号,接收血液来自门静脉和肝动脉、肝循环系统是一个重要的组成部分。循环系统中的其他组件相比,肝脏正弦曲线可以区分两个独特的特点:(1)肝正弦内皮与特定的渠道(有孔的孔隙大小6 - 9μ米)没有基板,使其高度渗透;(2)血液流动缓慢的正弦曲线允许其他循环细胞保持在肝脏。这些独特的特性允许循环细胞迁移进入肝实质(2,27]。的确,互动,通过肝正弦内皮迁移循环的第一步干细胞向肝实质灌输(28,29日]。与先前的研究一致,胶原蛋白分布在肝脏组织病理学评估治疗的老鼠证实外源性BMSC移植改善肝纤维化在某种程度上(3,30.),而VEGF治疗对肝功能影响很小(图3)。此外,BMSC移植相比,VEGF的BMSC移植治疗显著降低肝纤维化大鼠(图3)。主要负责肝纤维化细胞肝星状细胞(hsc)。研究表明,TGFβ1激活肝星状细胞和被认为是最有效的细胞因子,使得肝脏纤维化反应(31日]。BMSC + VEGF组胶原沉积减少,减少的星状细胞的激活,降低TGFβ和il - 6表达(炎症标记),这进一步表明,VEGF治疗和BMSC移植大大降低肝纤维化。我们的研究结果表明,VEGF肝脏的修复由外生BMSC,可能发生通过促进BMSC移植到肝脏。

许多研究表明,VEGF增加渗透率VEGFR-1正弦内皮的绑定(flt-1)和VEGFR-2 (KDR / flk-1),两个受体表达内皮细胞(14]。在肝纤维化的进展,这种机制使循环单核细胞和巨噬细胞的迁移到肝实质通过正弦内皮(17]。我们的研究结果还表明,VEGF正弦内皮通透性增加(图4)。这些结果表明,VEGF促进外源性BMSC移植通过增加正弦内皮渗透性。如果世行的测试结果,不同的基因表达VEGF略下降;我们发现没有明显统计学差异,可能没有决定性影响的区别,实验结果(图4 (c))。我们认为,这可能与bmsc的过程恢复肝脏。一些复杂的机制影响VEGF的转录后的基因表达。与此同时,我们还发现,与对照组相比,埃文是蓝色的结果表明,肝正弦渗透率略减少bmsc移植后,也许VEGF降低造成的。(图4 (d))。此外,通过绑定VEGFR-1 (flt-1)和VEGFR-2 (KDR / flk-1)和激活phospholipase-Cg和NF -κB, VEGF能诱导细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1) VCAM-1, E-selectin正弦内皮细胞(18]。上的VLA4造血干细胞介导造血干细胞粘附与内皮VCAM-1交互,其counterreceptor。这种交互促进造血干细胞对正弦内皮和迁移到实质通过正弦内皮(17]。根据我们的研究结果,结合VCAM-1和VLA4可能也是一个机制促进纤维化的BMSC移植肝脏,尽管只有4.7%的阳性染色VLA4。这还需要进一步的研究来探索VLA4促进BMSC移植的作用。先前的研究表明,移植的干细胞在肝脏通过减少炎症和改善肝功能改善肝脏微环境(30.,32]。因此,我们还研究了外源性BMSC移植肝脏功能的影响。BMSC组相比,BMSC + VEGF组有更高水平的铝青铜,CYP, G6Pase,表明改进的BMSC移植增加纤维化肝脏的分泌功能。重要的是,VEGF组没有表现出明显的肝功能的变化相比,模型组。检查肝再生的研究表明,PCNA Ki67高度诱导BMSC + VEGF组但没有不同的VEGF组和模型组。我们的数据也表明,VEGF不仅促进肝内移植BMSC,还提高了BMSC-mediated肝细胞再生和肝功能。

EMT是必不可少的组织发展和在疾病进展的机制。EMT过程中,上皮细胞失去上皮表型并获得间质表型(33]。EMT是一个重要的机制在肝纤维化,肝细胞和胆管上皮细胞转化为成纤维细胞。肝星状细胞也穿过EMT过程,成为活化和转化为成纤维细胞,细胞是主要的导致细胞外基质的沉积(如胶原蛋白)和肝纤维化(34- - - - - -36]。波形蛋白,Twist1、蜗牛和蛞蝓是至关重要的转录因子(protransforming因素)诱导EMT过程(37- - - - - -39]。钙粘蛋白和occludin也EMT的关键因素(antitransforming因素),和他们的表达抑制EMT过程中(36]。基于图的结果3 (e),protransforming因素的表达减少,antitransforming因素的表达增加post-BMSC移植,特别是在BMSC + VEGF组。整体而言,这些结果表明,EMT过程抑制了BMSC移植肝脏,从而可能提供一个机制外生BMSC改善肝纤维化的肝脏功能。此外,BMSC移植的组合与VEGF治疗更有效地抑制EMT过程,这可能源于VEGF加强BMSC移植。

5。结论

VEGF促进bmsc移植的肝纤维化,肝脏的再生,改善肝脏功能。的机制可能与增加肝正弦内皮渗透性和VCAM-1-increased表达式。

缩写

硕士:	间充质干细胞
VEGF:	血管内皮生长因子
VCAM-1:	血管粘连molecule-1
伴着:	骨髓间充质干细胞
创新领导力4:	四氯化碳
CCM:	完全培养基
的边后卫:	胎牛血清
他走时染色:	Hematoxylin-eosin染色
如果:	Immunofluorescent
αsma:	Alpha-smooth肌肉肌动蛋白
PCNA:	增殖细胞核抗原
TGFβ:	转化生长因子β
铝青铜:	白蛋白
RT-qPCR:	定量逆转录聚合酶链反应
VLA4:	很晚antigen-4
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
G6pase:	葡萄糖6-phosphatase
HSC:	肝星状细胞
il - 6:	白介素6。

数据可用性

在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

批准本研究从调查和医院的伦理委员会获得诊所。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

柯原著、Chunyou Lai和黄Xiaolun导致了概念、研究设计、数据解释和手稿撰写和编辑。玲玲,Qinyan杨,宇通姚明,光明香进行了研究和实验。冯Tianhang导致了数据收集和分析。Tianying张和道局域网导致样本收集和处理。柯原著和Chunyou赖同样贡献和分享第一作者。Xiaolun黄是通讯作者。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项研究得到了国家基础研究项目(授予数量:2015 cb964703),四川科研机构的科技变革项目(授予数量:2017 qn08)、四川省科技部门和项目(授予数量:2018 hh0062)。

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