文摘
肌腱组织破裂往往需要更换受损组织。使用汽车或同种异体是出了名的由于稀缺的供应有限和高免疫不良反应的风险。为了克服这些限制,组织工程(TE)已经被认为是一种很有前途的方法。在一些生物材料,脱细胞异种移植在大量和肌腱重建可以代表一种可能的解决方案。本研究的目的是评估在跟腱TE异种移植的缺陷。具体来说,加强生物力学功能的能力,同时提高移植物与宿主,进行了测试。脱细胞的结合equine-derived肌腱异种移植有或没有矩阵重新与自体骨髓间充质干细胞(bmsc) stretch-perfusion动态条件下可能改善左右肌腱重建。36个新西兰兔被用来创建2厘米长节段性跟腱的缺陷。然后,动物被植入自体(AG)作为黄金标准控制、脱细胞移植(DG),或体外组织工程移植物(羊毛),评估术后12周。牺牲后,组织学、免疫组织化学、生化和生物力学分析以及基质金属蛋白酶。 The results demonstrated the beneficial role of undifferentiated BMSCs loaded within decellularized xenografts undergoing a stretch-perfusion culture as an immunomodulatory weapon reducing the inflammatory process. Interestingly, AG and TEG groups exhibited similar results, behaved similarly, and showed a significant superior tissue healing compared to DG in terms of newly formed collagen fibres and biomechanical parameters. Whereas, DG demonstrated a massive inflammatory and giant cell response associated with graft destruction and necrosis, absence of type I and III collagen, and a higher amount of proteoglycans and MMP-2, thus unfavourably affecting the biomechanical response. In conclusion, this in vivo study suggests a potential use of the proposed tissue-engineered constructs for tendon reconstruction.
1。介绍
越来越多的创伤性事件导致肌腱损失和/或变性病变导致复杂的破裂通常需要更换受损的组织,特别是在老年患者和运动员。事实上,肌腱自我修复能力差是由于稀缺的存在和居民细胞的代谢活动,不能正确引导恢复原生组织功能所需的愈合过程(1,2]。执行的一般外科手术治疗与汽车或同种异体肌腱断裂可能不能保证成功修复肌腱功能,除此之外,复发频繁(3]。此外,使用汽车或同种异体是出了名的有限由于稀缺的供应和高风险与免疫不良反应或疾病传播肌腱替代后,分别。在这种情况下,组织的重建与合成移植进行了广泛的调查(4),加上几个组织工程策略来提高植入移植物的再生潜力(5]。然而,合成生物材料的使用提出了可疑的结果而言,生物相容性和生物力学性能(6]。
不可否认的是,没有更好的办法替代与同源健康受损组织结构。因此,理想的移植肌腱替代nonimmunogenic,容易与机械性能类似于细胞外基质(ECM)的本地组织提供一个有效的脚手架宿主细胞的生成(6]。在这方面,去细胞异种移植的似乎是一个有前途的战略治疗肌腱撕裂和断裂。特别是,屈肌腱生物力学属性,大量供应,和更少的不受控制的跨物种疾病相比,其他动物(猪、牛等)提供了几个优势人为和合成支架(7]。先前的研究表明,屈肌腱的去细胞似乎是一种很有前途的一个非细胞矩阵的生成策略缺乏抗原保存矩阵和提供细胞自然环境(7,8]。然而,一个植入脱细胞矩阵将需要很长时间才能最终利用宿主细胞和居民成为重要的生物支架。因此,干细胞的方法可能被利用鼓励脱细胞基质殖民而指导肌腱再生(9]。一些研究展示了人类和动物的能力骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)分化成tenocyte-like细胞化学和物理反应刺激体外和体内(10- - - - - -12]。支持细胞定位、差异化和ECM沉积在非细胞矩阵,一个振荡stretch-perfusion生物反应器(OSPB)最近被设计和验证体外的功能化梗塞部位脱细胞肌腱马(13]。在这项研究中,它已经描述了如何使用OSPB赋予未分化细胞高度东方种子细胞所需的机械刺激和新废黜的胶原蛋白,同时保留支架的生物力学性能,从而保证较高的细胞移植在工程结构(13]。尽管体外获得的有前景的结果,使用动物模型试验的可行性提出再生治疗肌腱受伤是强制性的。为了确定最合适的动物模型来验证提出的科学假说,文献之回顾评价动物模型和治疗跟腱的重建和屈肌肌腱最近进行的(14]。从这个分析,兔子是最常用的动物物种由于内在优势,如简单的处理和适当的肌腱大小和生物力学性质类似人类的屈肌肌腱(14,15]。考虑到体外的上述结果,本研究旨在测试的小说在一只兔子biofabricated肌腱异种移植模型跟腱完全横断。具体来说,增加生物力学功能的能力,同时提高肌腱移植物与宿主的交互,将测试和比较标准的自体控制。完整的脱细胞的结合马异种移植与自体的细胞重新矩阵在动态条件下可能是一种很有前途的方法来修复跟腱断裂在诊所。
2。材料和方法
2.1。道德声明
整个研究机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)大学的摩德纳和Reggio Emilia(允许联合国915/2016-PR)。动物们被安置在协会的动物保健设施,符合国际标准。摩德纳大学和Reggio Emilia坚持原则在以下法律、规定和政策管理的护理和使用实验动物:意大利适用法律(d .腿26/2014)和欧盟指令和指导方针(欧共体理事会指令2010/63 /问题)。动物被认证兽医负责定期检查卫生监测、动物福利监督实验协议和程序修改。所有手术全身麻醉下进行,所有正在努力减少动物痛苦。
2.2。研究设计
36个雄性新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus;体重 ,15周大)被用于这项研究(Envigo RMS Srl, s Pietro al Natisone乌迪内,意大利)。所有的动物都被单独关在笼子里,保持受控条件下:室温20°C,湿度45%,15每小时换气次数,光/暗周期12 h。兔子可以免费获得水和标准食物颗粒ab随意(饮食2 rb15 Mucedola开发。,Settimo米兰,意大利)。动物适应手术前两周内;此后,受试者被随机分为三组:(1)自体( )(AG)、自体反转),(2)脱细胞移植( )(DG)和(3)体外组织工程移植物( )(羊毛)。每只动物后肢,接受了外科手术治疗和对侧肢体担任本机肌腱(NT)。
2.3。麻醉和术后治疗
所有程序在兔子全身麻醉下进行。兔子与肌肉的鸡尾酒的盐酸氯胺酮麻醉(30毫克/公斤;1000年Imalgene,梅里亚,意大利米兰)和甲苯噻嗪(4毫克/公斤;Srl Sedaxylan 2%, Dechra兽医产品,西班牙巴塞罗那)与异氟烷和维护(1 - 3%;异氟烷兽医,梅里亚,意大利米兰)氧气面罩。边际耳静脉乳胶,动物与无菌溶液水合。在术后疼痛控制、盐酸丁丙诺啡(0.03毫克/公斤;Buprenodale Dechra Srl,意大利都灵)静脉注射。氟尼辛葡甲胺的其他术后治疗包括皮下政府(1毫克/公斤;Finadyne,默沙东动物卫生Srl、贝、意大利)和肠外政府marbofloxacin(2毫克/公斤,Marbocyl Vetoquinol意大利Srl, Bertinoro,意大利)为5天。 After 12 weeks of follow-up, animals were anesthetized as aforementioned, then euthanized with an overdose of pentobarbital-sodium (90 mg/kg, Pentothal Sodium, Intervet Productions Srl, Aprilia, Italy) in order to proceed with the ex vivo analyses.
2.4。骨髓收获和rbBMSC文化
兔羊毛集团接受了骨髓中收获检索自体rbBMSCs。简而言之,在全身麻醉下,动物被安置在腹侧后肢弯曲下面休息。背地区刮和消毒程序。髂嵴标识,进行皮肤切口小,骨髓愿望针(静态活检针7厘米;18 G;Byopsibell意大利摩德纳)介绍了通过骨髓腔顺时针和逆时针旋转。然后,针笔被除去,包含5000 UI /毫升10毫升注射器肝素钠(Pharepa PharmaTex意大利,意大利米兰)连接到luer-lock。肝素注射后,大约5毫升的骨髓立即被轻轻吸气和混合,注射器被堵住,样本存储在几个小时内处理4°C。
皮肤切口关闭与单丝尼龙缝线(Monosof 3:0,美敦力公司,意大利米兰)和兔子从麻醉中恢复过来。后,rbBMSCs被离心法分离骨髓样本400 xg 5分钟,去除上层清液,收集巴菲的单核细胞层,洗两次磷酸盐(PBS, Gibco)。随后,获得颗粒悬浮在一个完全培养基(CM)组成的高葡萄糖杜尔贝科的修改鹰中含4.5 g / l的葡萄糖(DMEM-HG) (Gibco), 10%胎牛血清(的边后卫,HyClone), 100 U /毫升penicillin-streptomycin, 2毫米谷酰胺、丙酮酸钠1%,1%玫瑰从Gibco(所有),和10 ng / ml的碱性纤维母细胞生长因子(bFGF、表达载体、米兰、意大利)和镀在细胞培养瓶。兔子bmsc被塑料坚持选择(16),进一步扩大播种细胞密度6000细胞/厘米2在37°C, 5%的公司2)厘米。新媒介改变了每周两次,细胞亚文化融合后12天达到90%后,所述其他地方(12]。第2通道细胞被冻结,直到使用。
2.5。脱细胞异种移植的细胞再播在生物反应器和动态文化
去细胞异种移植获得的马表面数字屈肌肌腱DNA含量的测定( SD干重)来评估细胞去除效率,然后,他们晚期消毒广泛描述在我们先前的研究[8,17]。自体rbBMSCs解冻在第二通道,扩大,播种到第三段和脱细胞异种移植。脱细胞异种移植的大小 ,及其表面播种50000细胞/厘米2resuspended在30μl CM和孵化2 h,允许细胞附件。此外,十二注射20000 rbBMSCs / 20μl进行垂直于脱细胞基质中纤维长度。后来,CM添加到完全覆盖结构,表面和rbBMSCs培养脱细胞异种移植为72 h在静态条件。然后,梗塞部位脱细胞异种移植的文化室安装在一个定制的生物反应器和动态培养7天基于我们之前的研究(13]。最后,组织工程异种移植移植肌腱替代品,验证后受移植者细胞通过活沙门氏菌和已经死亡的可行性分析(数据没有显示)。
2.6。外科手术植入肌腱移植
在全身麻醉下,在腹侧躺着,每个主题的一个后肢是剃和消毒作为标准。跟腱复杂被中线接触皮肤,皮下组织,筋膜切口在腓肠肌肌远端0.5厘米和0.5厘米以上跟骨(图1(一))。创建一个2厘米长节段切除在跟腱的研究,包括内侧和外侧腓肠肌。节段切除肌腱被用作AG组自体逆转。后立即固顶,根据实验组,肌腱缺损与AG)桥接端到端(图1 (b))、DG或羊毛constructs-shaped适合在缺陷与4 - 0可吸收材料(Polysorb,美敦力公司)使用修改后的凯斯勒技术,连接本机的树桩肌腱和特定的植入移植物(图1 (c))。腱的边缘也通过运行epitendinous缝合针缝合材料,相同的基于其它地方描述的技术(18,19]。跖肌肌腱,也称为superficialis屈肌腱牵向前(FD),保住了自己作为一个内部夹板。paratenon被关闭,以吸收性材料(Polysorb,美敦力公司)(图1 (d)),皮肤缝合时作为标准与缝合(Monosof 3:0,美敦力公司,意大利米兰)。paratenon缝合后,羊毛组也得到了当地注入自体rbBMSCs ( 细胞/公斤合著)与目的改善组织愈合和调节宿主应对异种移植后植入(图1 (e))。手术后,抗菌软膏(Hyalosilver Fidia制药学,Abano Terme (PD),意大利)喷在伤口,治疗腿被包裹了一个软垫在石膏绷带之前(X-Lite A3-MED,左拉Predosa、意大利)。演员扩展到踝关节是申请10天150°弯曲,防止超载(图1 (f))[20.]。动物们在笼子里没有自由移动的限制。10天后,石膏,在全身麻醉下,高频超声波进行在纵向平面线性探针18 MHz (MyLab™, Esaote公司。、热那亚、意大利)监控状态的肌腱替代所有的动物。侧健康肌腱被评估为控制(NT)。特别是,附件的移植肌腱的近端和远端进行评估。然后,软铸(Vetrap、3 m、Pioltello、意大利)穿了两周,然后彻底删除。12周后,动物被牺牲和肌腱标本收获从跟骨肌肉腱膜结。特别是,对于每一个实验组,六个外植体处理了(除了AG组组织学分析 )和六个外植体在-80°C dry-stored生化和生物力学测试。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
2.7。生化分析粘多糖量化
小段肌腱移植组织的加权,剁碎,和2毫克/毫升蛋白酶K消化(pH值7.6)(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)56°C下16 h风潮。消化样本离心机在RT 10000 xg 10分钟,和上层清液收集分析。量化的葡糖氨基葡聚糖(sGAG)都使用了1,9-dimethylmethylene蓝色(DMMB)染色法测定(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)。短暂,样本孵化40 mM对羟苯甘氨酸/生理盐水(pH值3.0)与16毫克/毫升DMMB rt, sGAG浓度是由阅读500海里的吸光度(珀金埃尔默维克多X3标)和比较结果标准曲线的硫酸软骨素(Blyscan, Biocolor、洋红色、意大利)。sGAG内容分析的数据归一化的样本干燥重量。
2.8。组织学分析
被移植肌腱很长,在固定和包容,每个样本为整个宽度的中间三分之二分为近端和远端部分,代表之间的过渡区域的本机肌腱移植。然后,在10%中性缓冲福尔马林固定标本24 h和脱水酒精在石蜡包埋前切成4μ米纵向部分。幻灯片与阿尔新蓝染色(AB)。组织的显微照片都被通过一个奥林巴斯IX71奥林巴斯光学显微镜和一个XC10相机(日本)。审查员蒙蔽了双眼,三个独立评估根据修改后的半定量的肌腱组织病理学分级评分,提出的其他(20.,21]。特别是,以下参数评估:组织细胞外基质(0 - 2),细胞结构(0 - 2),细胞排列(0 - 2)和分布(0 - 1),细胞核的形态学(0 - 2),组织肌腱修复组织的愈伤组织(0 - 2),从缺陷过渡到正常组织(0 - 2),血管化(0 - 1)退行性变化(0 - 3),炎症(得分0 - 1)和蛋白聚糖内容(0 - 1)。最高得分(19)代表肌腱组织完整性方面的最好的结果,和最小值(0)代表最糟糕的状况。
2.9。免疫组织化学我和III型胶原蛋白检测
评估的分配我和III型胶原,免疫组织化学进行deparaffinised部分。的部分与单克隆抗体主要孵化anticollagen I型(1:200稀释)和类型III(1: 2000稀释)(Sigma-Aldrich公司,圣路易斯,密苏里州)1 h rt,然后,部分暴露在一个生物素化的anti-mouse二级抗体(1:200稀释;芬奇物化学,芬奇,意大利的佛罗伦萨)30分钟。检测到的信号通过streptavidin-biotin方法加上3 - - - - - -学生物化学Diaminobenzidine (DAB)色原系统(达芬奇)。部分与苏木精复染色,显微镜下分析。消极的控制是由省略主要抗体。积极控制染色获得兔耳组织。
2.10。通过Stereological Histomorphometric分析方法
硫酸的存在蛋白聚糖是通过histomorphometry AB-stained部分评估。特别是,组织学量化进行了使用ImageJ 1.45软件(开源:http://rsbweb.nih.gov/ij),所述其他地方(22]。具体地说,该地区被蛋白聚糖在感兴趣的区域(ROI)进行了分析后去除白色和胶原蛋白矩阵通过颜色阈值的区域。数据报告为总数的百分比ROI的组织。
2.11。明胶Zymography
的蛋白水解活性基质金属蛋白酶2 (MMP-2)和9 (MMP-9)通过明胶zymography评估。蛋白质提取从肌腱标本如前所述23,24]。短暂,50毫克的肌腱被切碎的孵化和500毫升的提取缓冲由10毫米卡可基酸(pH值5.0),氯化钠0.15米,1μM ZnCl2,20毫米CaCl21.5毫米,南3,0.01%的Triton x - 100在4°C(所有从Sigma-Aldrich) 24 h。然后,提取缓冲收集和刷新,样本进一步治疗24小时。在蛋白质分离、收集提取缓冲的pH值提高到7.5通过添加1米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0,Sigma-Aldrich)和液溶液提取的蛋白质是量化使用皮尔斯™BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学)。之后,0.12%明胶预制凝胶(Novex™,生活技术)是含有20μ克蛋白质和运行在125 V,直到染料前面跑了凝胶。凝胶被从磁带和孵化第一在复性缓冲(Novex™,生活技术)与温和搅拌30分钟,然后同样在发展中缓冲了30分钟。随后,发展中缓冲区提供了和刷新,一夜之间,凝胶被孵化37°C的最大灵敏度。染色之前,凝胶和dH冲洗三次2O删除任何剩余的钠十二烷基硫酸盐(SDS)和沉浸在Coomassie蓝染色溶液(SimplyBlue™SafeStain,生活技术),持续15分钟。金属蛋白酶活动可视化为明确乐队的蓝色的凝胶。的凝胶图像是通过ChemiDoc™成像系统(Bio-Rad),并使用ImageJ带强度测量软件(https://imagej.nih.gov/ij/)。数据报告为峰面积值归一化积极控制(的边后卫,HyClone)。
2.12。生物力学分析
在12周的参与,从肌肉腱腱膜标本收获向近端远侧地跟骨骨插入,然后储存在-80°C到处理。生物力学测试在室温下进行外植体上使用一个机电试验机(美国MTS Synergie、伊甸草原、锰),配备1 kN的负载细胞。短暂,解冻后,为了防止滑动的样品,跟骨插入和肌肉肌腱过渡用床单裹着砂纸,与cyanoacrylate粘,夹紧抓住。在生物力学测试,样品与PBS不断灌溉,以防止脱水。六个预处理周期直到10%的初长度被应用于每个样本在测试之前。然后,标本最终加载失败在单轴拉伸/ s应变率在1%以下的协议之前的研究(8,17]。弹性模量在高株(EM, MPa),评估最终的线性部分的斜率的应力-应变曲线,和失败的压力(MPa)的肌腱超弹性的反应来自失败的测试。数据集被正常化分析结果在每个试件的横截面积。
2.13。统计分析
统计分析与GraphPad棱镜5软件(美国拉霍亚GraphPad软件Inc .)。Shapiro-Wilk测试是用来评估数据的正态分布。
数据获得正常的分布值进行分析与单向方差分析(方差分析),加上Bonferroni事后考验;对于非参数数据,克鲁斯卡尔-沃利斯检验加上瘸子的事后。的值 被认为是具有统计学意义。数据表示为 (SE)。在体内研究中,计算出的样本大小是功率分析假设80%功率检测的差异的存在或没有移植异种移植集成本机内组织,使用两面 - - - - - -测试一个 (G3.1软件,杜塞尔多夫,德国)。考官的评分者间信度的分数组织病理学评价与组内相关系数(ICC)计算: ,完美的可靠性; ,优秀的可靠性(25]。
3所示。结果
3.1。临床检查、超声成像和外观
三周后手术,一个兔子的AG组抑制创伤后发生在笼子里,损害了动物流动性和确定的发展严重的褥疮。因此,这个问题被排除在研究之外。没有任何组中包含的其他动物死亡或有局部或全身性感染的临床证据,如炎症(充血或渗出物),腹泻,和行为变化。
所有伤口完全愈合良好,术后10天。在那个时候,所有的动物都能走动与全方位的运动后删除。
在超声检查在纵向平面(图2所有治疗组),显示一个增强回声midthird部分。DG组表现出更大的hyperechogenicity AG)和羊毛相比。此外,DG组的,细长的,线性的形状肌腱迷路了,一个伟大的存在的活性组织一起hypoechogenic肉芽组织中被发现的过渡区。DG组,灰度超声显示的异质性的存在肿胀组织内部和周围的移植的移植,以及无序的纤维结构。最后,存在粘连植入移植物和皮肤表面的平面在DG组明显。尽管缝合材料的检测和hypoechogenic地区维修站点旁边被辨认,植入区是均匀略增强回声AG)和羊毛。更重要的是,超声分析确定的扩大面积在所有治疗组相比,更可检测的羊毛组DG和AG)。
postrepair 12周,治疗肌腱相比出现了NT总检查(数据没有显示)。DG和羊毛组织表现出相对扩大中间三分之一的屈肌肌腱复杂而AG和NT。特别是,移植的标本的测量表明更大的扩大的羊毛DG和NT组相比,如表所示1,从而确认超声记录的数据。
3.2。粘多糖含量
更大数量的硫酸化葡糖氨基葡聚糖被发现在所有治疗组。特别是AG组有更高的sGAG内容相比NT和羊毛团体 和0.05,分别。DG之间没有显著差异被发现或羊毛和NT(图3)。
3.3。定性和半定量的组织病理学和免疫组织化学的分析评估
定性的组织学和免疫组织化学我和III型胶原蛋白是描绘在图4。
在NT组,所有的样品平行波浪密集的I型胶原纤维束和缺乏III型胶原蛋白被发现。单轴和均匀分布的细长tenocytes以及没有发现异常的退行性组织,血管化或炎症反应。
AG组的可辨认的过渡区提出了异构外观紧凑,轻度紊乱的胶原纤维主要包括III型胶原蛋白。突出显示的AB染色稍有增强蛋白聚糖和适度增加细胞密度,圆形细胞,排列不规则,细长的细胞之间插入。neoangiogenesis有点增加和与一些相关淋巴细胞的存在中度水肿的形成。
DG组肉芽组织提供的明显过渡区混合蛋白聚糖和新形成的纤维软骨组织(图4小盒子)。有大量的炎症细胞(图5);特别是,异物巨细胞一起检测显著增加细胞数量,显示无组织的模式。贪污破坏的地区存在明显的坏死改变,与超声检查关联。失去了整个组织结构和矩阵描述了一个几乎没有I型胶原蛋白和一个贫穷的III型胶原蛋白被小范围内炎症反应(图4)。此外,越来越多的小型和大型毛细血管中检测出这组(图5)。
羊毛组,尽管存在轻微的蛋白多糖沉积和一些退行性变化,如脂肪浸润组织和hypervascularization,过渡区呈现卷曲和紊乱的胶原纤维之间的变化。一些稀疏的炎症细胞存在,从而可能改变I型胶原的沉积。然而,III型胶原蛋白被识别为应对居民细胞沉积新形成的矩阵。事实上,12周后愈合过程的扩散(第二阶段),从epitenon肌腱成纤维细胞和滑膜鞘和内在tenocytes endotenon招募到损伤部位产生胶原蛋白类型III和ECM组件(例如,蛋白聚糖)创建一个最初无组织的ECM。然后,胶原蛋白的生产类型III开始进一步取代了更强的胶原蛋白I型。
组织学评分者间信度的分数由三个观察员蒙蔽了优秀的ICC 0.93 (95% CI 0.8865 - 0.9599)。表2报告修改的每一个参数的平均值斯托尔的分数评估三个失明观察家对治疗组AG) ( ),DG ( ),和羊毛( )。
的整体和组织病理学评分显示显著区别DG和AG)或羊毛 和 ,分别。AG)和羊毛之间没有差异被发现。正如所料,所有的治疗组得分显著不同的相比,本机肌腱( )(图6)。
3.4。硫酸盐蛋白聚糖的定量评估
histomorphometric蛋白多糖的分析内容显示增加在所有治疗组相比,本机肌腱。特别是AG组蛋白聚糖的存在不同于NT ,DG和羊毛描绘一个更高的增加与NT ( )。更重要的是,没有发现显著差异的蛋白多糖AG)和羊毛之间的内容,而这些粘蛋白的显著增加在场DG组相比AG)和羊毛( )(图7)。
3.5。基质金属蛋白酶的检测
zymography方法允许蛋白酶酶的识别与gelatinolytic活动乐队报道在图中描述8。的72 kD乐队代表了潜在的形式MMP-2 (Pro-MMP-2),而迁移62 kD乐队代表了MMP-2酶的活化形式。没有明显变化的强度Pro-MMP-2乐队在治疗肌腱和治疗肌腱和NT之间。不同,激活的MMP-2显示活动显著提高DG和羊毛相比NT (一)和 (b),明显高于活动也发现DG和羊毛相比AG) ( )。没有结果MMP-9由于低质量的乐队在凝胶上依稀可见。
3.6。生物力学测试
单轴拉伸测试的结果进行直到失败NT和肌腱的替代品(AG)、DG和羊毛)报道,在图9。图9(一个)给出了弹性模量(EM)在高压力计算在每个应力-应变曲线的线性区域外植体失败。肌腱治疗自体移植或DG和羊毛组间没有差异,虽然之间存在显著的减少EM治疗肌腱和NT组。虽然没有显著差异,发现改进的EM的羊毛组相比AG和DG。破坏应力如图8(b)。AG)和NT之间没有发现差异,而DG和羊毛相比显示较低的破坏应力NT 和 ,分别。尽管没有发现差异之间的羊毛和DG,最后一个有显著降低破坏应力相比AG) ( ),虽然没有AG)和羊毛之间的差异被发现。
(一)
(b)
4所示。讨论
腱断裂和大缺陷是伟大的负担在诊所,总是需要富有挑战性的手术和移植过程。可行的移植材料,作为肌腱修复的替代品,在骨科一直在探索,提出了新颖的生物移植供临床使用。在生物支架,用脱细胞tendon-derived矩阵代表一种很有前途的方法来治疗跟腱断裂(7,8]。在目前的研究中,对脱细胞肌腱异种移植肌腱再生效果丰富与否与自体骨髓间充质干细胞通过生物反应器动态文化已经在一只兔子模型的完整评估肌腱横断和比较自体的黄金标准。兔子已经被选为跟腱横断模型由于其广泛使用的用于肌腱工程由于大小适当的肌腱,允许活体的评估(如超声波),一个intrasynovial组件和屈肌肌腱生物力学相似的人手8,20.,26]。这个模型允许临床可译性高的评价脱细胞异种移植的再生策略,涉及使用。实际上,最终的目标是生成一个没有供体细胞的支架组件,同时保持其生物相容性。在这种背景下,基于单元的方法发展的生物重要支架已被广泛证明是一个有效的策略27]。自体bmsc的使用被认为是由于众所周知这些未分化的细胞增殖和分化的能力对肌腱细胞(28),特别是在动态拉伸和灌注条件下培养肌腱内矩阵(13]。的确,我们小组曾表明,未分化的动态文化rbBMSCs脱细胞肌腱移植物内注入了体外成熟和胶原蛋白排列矩阵(13]。这些证据被其他人也支持使用不同支架材料(29日- - - - - -31日]。更重要的是,bmsc的再生和免疫调节的潜力已经被广泛报道的文献,以及能力的bmsc分泌生长因子和细胞因子的激活tissue-resident细胞,刺激neoangiogenesis,抑制炎症的32]。基于这些前提,采用动物模型基本检查影响本地组织内的集成和脱细胞肌腱的宿主反应异种移植与自体bmsc专门培养丰富定制的生物反应器。结果表明未分化的bmsc的有益作用,当加载在脱细胞异种移植接受stretch-perfusion文化作为免疫调节的武器,减少炎症过程通常与异物,有关生物植入物。一个至关重要的角色,在异种移植物植入后的宿主反应的评估是通过组织学分析,允许调查不仅组织结构的形态变化,也炎症状态和愈合过程由治疗。关于恢复和再生过程,修改后的斯托尔的分数能够想象一个好的评估植入移植手术后12周的治疗状况。AG)和羊毛组之间未发现显著差异,显示一个明确的上级组织愈合相比DG组。具体来说,组织学结果显示浓度的增加胶原纤维在AG和羊毛组织,作为一个索引的愈合过程33]。同样,轻度炎症的存在模式在这些团体代表愈合过程的基础(34]。事实上,之间的重叠的后期炎症和成纤维细胞的增殖阶段统计合成胶原蛋白类型III可能,然后其次是迟发的改造阶段(35]。这些发现也被其他作者证明了炎症反应改善成纤维细胞的响应,控制细胞行为和矩阵的生产(3]。一般来说,AG)和羊毛显示相似的响应新形成的胶原纤维,主要是III型胶原蛋白。尽管III型胶原蛋白保留可怜的生物力学属性,兔早期动员的四肢可以III型转化为功能性I型胶原蛋白随着时间的推移,也支持其他[18]。也可能是可能的,羊毛的优点在脱细胞肌腱种子细胞的影响矩阵和局部注射自体rbBMSCs,从而导致更大的生产胶原蛋白相比,不结果实的DG [36]。尽管胶原蛋白定位和分布评估在目前的研究中,胶原基因表达的定量分析缺乏为了证实这个免疫组织化学发现。形态,细胞密度增加在所有治疗肌腱与预期的一样,表现出更多的生理细胞分布和细长的细胞形态学AG)与羊毛相比。随访,然而,尽管羊毛集团可能会产生类似的愈合过程,细胞排列相比AG组。事实上,居民的迁移细胞修复网站不仅来自于肌腱树桩也来自于epitenon,因此需要更长的时间达到受伤部位(2]。总的来说,更高的细胞和新成立的胶原纤维可能的原因更大,更厚的羊毛肌腱结构组,通过超声波诊断和测量在外植体。增加细胞结构的细胞能够合成tendon-specific ECM也反映在大水平的蛋白聚糖和粘多糖中发现AG)和羊毛组(37- - - - - -39),以及DG组炎症细胞,从而诱导共同增加肿胀。事实上,DG组表现出巨大的炎症和巨细胞反应与贪污破坏和坏死有关,同样发现了其他细胞外基质支架植入后(40- - - - - -42]。这可能是由于使用异基因的生物材料,在没有自体,免疫调节bmsc确定主机的不良免疫反应。更重要的是,更大程度的蛋白聚糖检测DG组相比AG)和羊毛也可能改变机械载荷的结果可能会增加当地的生长因子和细胞因子的水平,从而影响基质金属蛋白酶的激活,从而瓦解的肌腱ECM (38]。事实上,在生理条件下,低水平的潜在形式的矩阵和内基质金属蛋白酶存在基质金属蛋白酶激活只在组织营业额(24]。不同,在病理事件,有一个矩阵的合成和降解组件之间的不平衡(即。、胶原蛋白、糖蛋白和sGAG)为首的基质金属蛋白酶的表达和激活。在这种背景下,MMP活性增加可能表明矩阵退化,作为改造过程的一部分组织愈合(43]。特别是MMP-9通常参与胶原降解,而MMP-2参与胶原降解和改造(44,45]。尽管没有发现差异MMP-2 DG和羊毛之间的水平,它可以推测,严重损害DG组的炎症和坏死,MMP-2可能有更强的影响在变性胶原蛋白类型我和三世,从而支持免疫组织化学结果,即。,没有这两种类型的胶原蛋白。这种现象尤其是当分析执行时间点,直到后期改造过程(46]。在这种情况下,它也会有助于评估MMP-9的水平,有一个更深的洞察机制推动胶原蛋白降解过程。众所周知,细胞不存在在肌腱和脱细胞肌腱更密集的组织。尽管如此,基质金属蛋白酶是很难提取被紧紧地连着ECM (47]。由于这些原因,从移植的标本的提取蛋白质导致要求过程和产量稀缺,因此代表的一个限制MMP的分析通过明胶zymography在目前的研究报道。的确,最终提取的蛋白质浓度确实足以检测MMP-2的活动,但并不足以欣赏MMP-9的水平,蒙泰罗和他的同事们还建议,只加载8μ检测MMP-2和50克蛋白质μg检测MMP-9稀缺的结果(48]。在生物力学方面,治疗组相比低等的生物力学属性NT由于缝合线的存在用于广泛采用凯斯勒的腱缝合术33),可能会影响整个植入的弹性,如预期。此外,胶原蛋白的存在类型III AG)和羊毛,通常在肌腱愈合过程中沉积,肯定影响了肌腱生物力学[49]。然而,AG)显示失败压力非常类似于NT。也希望DG和羊毛治疗肌腱描绘一个较弱的行为与AG)相比,由其他人确认数据报告(50,51]。然而,植入12周后,我们发现羊毛的EM和破坏应力增加组DG相比,支持与其他所有获得的数据分析。自体bmsc的存在和从动态文化获得一个更成熟的构造OPBS可能负责改善reimplanted组织的弹性和阻力,也展示了在其他地方(52]。此外,缺乏适量的胶原蛋白类型我和三世和更高的蛋白聚糖和DG组炎症细胞可能影响不利的生物力学响应在这个集团,特别是相比cell-reseeded羊的羊毛。的确,存在严重的局部炎性反应和灶性坏死,连同大量的蛋白聚糖和MMP-2 DG组,破坏胶原蛋白沉积具有显著的影响,不仅在建筑结构(组织学)但也主要在生物力学属性(53]。我们的结果是一致的与庄et al。18]在intratendinous BMSC疗法改善早期肌腱愈合的组织学和生物力学参数的缺陷模型。否则,我们的发现与研究对比Zhang et al。51),受移植者脱细胞肌腱移植显示类似的结果不结果实的移植。好的结果在本研究可以解释为利用OPBS前提梗塞部位异种移植。尽管这项研究仅限于功效的分析在一个时间点(12周),允许使用超声波监测植入移植还处于初期阶段的治疗(10天),一个良好的特异性病变和组织变化,也支持其他[26]。更重要的是,这种技术避免了包括一个更大的样本量,避免无用的动物牺牲为了评估肌腱愈合过程的进展,因此尊重3 r原则。再次,缺乏内部控制的羊毛集团最终由受移植者,改造移植没有当地注入BMSCs-did不允许歧视的影响播种或局部注射细胞方面的治疗和免疫调节作用。最后,进一步的分析也应该监督组织金属蛋白酶抑制剂的调制(TIMPs)根据MMP的表达水平在不同地区的肌腱通过反向zymography方法。
事实上,评价MMP与TIMP表达式之间的平衡将是有用的有一个完整的肌腱改造过程由测试再生策略。
5。结论
tissue-engineering-based方法组成的脱细胞肌腱异种移植含有自体bmsc和培养定制stretch-perfusion生物反应器可以代表一个有效的替代自体肌腱修复完整的缺陷。事实上,这项研究的结果表明,羊毛结构支持左右肌腱修复新胶原纤维的形成和生物力学特性类似于自体用作控制。总体而言,目前的研究发现另一种治疗,这为代表的羊毛,标准使用自体(AG)。根据获得的结果,羊毛可以有效选项的情况严重的跟腱断裂的组织损失,显示类似的组织病理学结果为羊毛和AG对DG组。根据这个,羊毛可能是一个合适的移植材料替代肌腱重建,绕过有限的可用性缺损的维度和网站的收获,以及随之而来的施主能级发病率和延长手术时间。相反,意想不到的结果发生在DG一无所知,肉芽组织和炎症pattern-open进一步调查改善的新方法去细胞过程和减少异常主机响应显然惰性去细胞移植。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
玛尔塔Bottagisio和丹尼尔·达瑞格同样这项工作。
确认
这项研究是由意大利卫生部(格兰特号码rf - gr 201102348899)。作者感谢艾琳Paganelli博士(数字式电压表在广场工作Tricolore Formigine诊所,摩德纳,意大利)为她在执行高频超声波技术支持;我们感谢瓦斯科Lolli博士和保罗Parmeggiani(数字式电压表在广场工作Tricolore Formigine诊所,摩德纳,意大利)anaesthesiologic支持。作者非常欣赏弗博士的组织支持麻省理工大学的生物医学科学系的摩德纳。