文摘
据报道,成人肝脏含有造血干细胞和祖细胞(公司),这与长期造血重建活动。肝脏造血作用中发挥着重要作用的细胞参与肝脏疾病。然而,祖细胞如何分化成功能性髓细胞和淋巴细胞在肝脏微环境仍然是未知的。在目前的研究中,公司移植实验被用来证实成年小鼠肝脏公司分化成髓细胞和淋巴细胞(优先T细胞)与骨髓相比公司。使用coculture系统由枯氏细胞和公司,我们发现枯氏细胞促进成人肝公司主要产生T细胞和B细胞。然后我们表明,枯氏细胞还可以促进公司扩张。封锁在细胞间的细胞粘附molecule-1 (ICAM-1)肝脏公司和枯氏细胞coculture系统受损的附着力,公司的扩张,和分化。这些结果表明枯氏细胞的关键作用在维护和促进成年小鼠肝脏造血作用。这些发现提供了重要的见解认识肝脏骨髓造血作用及其意义,尤其是一些肝脏疾病的状态下,如肝炎、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和肝细胞癌(HCC)。
1。介绍
已经建立,肝脏是主要的造血器官在胎儿时期。出生后,骨髓中的造血干细胞主要存在。在成人中,骨髓造血作用发生在肝、脾、和其他固体器官骨髓造血作用时失败,由于一些病理条件(1- - - - - -4]。据报道,成人肝脏包含林lo / -本来就+c - kit+细胞克隆形成能力在体外的multilineage造血重建致命辐照接受者老鼠在活的有机体内(3]。后来,CD45+肝脏一边人口(SP)细胞,分离基于赫斯特33342染料染色,报告可能的造血重建和生成淋巴,骨髓,红色的血统的致命辐照受体小鼠(4]。此外,公司被发现在成年人的人类肝脏和肝移植后广泛灌注可以恢复收件人multilineage造血作用在某种程度上(5- - - - - -7]。虽然肝造血作用中发挥着重要作用的细胞参与肿瘤监测和拒绝(8),缺乏系统性的研究比较之间的差异造血和lymphogenesis成人肝脏和骨髓和肝脏微环境如何导致这些事件。平静、增殖和分化的骨髓中的公司需要一个特定的利基。巨噬细胞、内皮细胞、血管周的细胞,和其他基质细胞在维持造血干细胞池扮演关键角色和规范公司活动通过产生各种细胞因子、造血生长因子,趋化因子和粘附分子(9- - - - - -11]。其中,粘附受体及其配体(如ICAM-1 / LFA-1和VCAM-1 / VLA-4)是重要的调节造血功能和锚定公司利基市场(12,13]。事实上,一个ICAM-1不足会损害公司的静止和重新活动的骨髓利基(13,14]。然而,在成人肝脏造血因子适合公司仍然知之甚少。
在目前的研究中,我们发现存在的异构林- - - - - -本来就+c - kit+(LSK含有造血干细胞,多能祖细胞)细胞(15在成年小鼠肝脏。通过公司移植实验中,我们观察到肝脏LSK细胞分化成髓细胞和淋巴细胞,特别是优先生成T细胞与骨髓相比公司。我们接下来了解肝脏微环境促进肝脏造血和淋巴细胞分化,哪些因素是必需的。我们发现枯氏细胞能诱导肝公司分化成T和B淋巴细胞的比例相对较高ICAM-1 / LFA-1 interaction-dependent方式。
2。材料和方法
2.1。动物菌株和治疗协议
六到八周大的雄性C57BL / 6 j小鼠获得从华富康生物技术有限公司(中国,北京)和无菌动物设施维护。男性和女性的C57BL / 6-Ly5.1 (CD45.1)从北京获得至关重要的河实验动物技术有限公司成年小鼠肝脏的腹腔内注射骨髓造血模型建立了10μg / mL有限合伙人为三天。clodronate-liposome的静脉注射(CL,上海逸生生物技术有限公司)是用来去除肝脏枯氏细胞(16]。CL注射到老鼠在第一和第三天。从第二天,C57BL / 6 j小鼠的腹腔内注射治疗10μg / mL有限合伙人为三天。组织在第四天收获和组织单核细胞被流式细胞仪检测。所有动物协议机构批准的动物保健和使用委员会山东大学。
2.2。克隆形成单位分析
总共 排序骨髓或肝脏LSK细胞悬浮在甲基纤维素半固体培养基(1.5%甲基纤维素IMDM)和播种24-well培养板的造血生长因子(自洽场50 ng / mL, Flt3-L 50 ng / mL, IL-3 20 ng / mL, IL-7 20 ng / mL, csf 50 ng / mL,和gm - csf 50 ng / mL)被添加。这些细胞被孵化有限公司37°C的5%2为14天。殖民地的数量(> 50个细胞)的克隆形成unit-granulo-macrophage (CFU-GM)和CFU-macrophage (CFU-M)计算光学显微镜下14天(17]。
2.3。流式细胞术
骨髓和肝脏单核细胞收获(18]。单个细胞悬浮液被封锁的Fc受体CD16 / CD32室温。10分钟后,细胞被染色的鸡尾酒抗体。对HSC染色,单核细胞从骨髓和肝脏与抗体染色血统抗体cocktain-percpcyTM5.5, sca-1-APC CD117-PE-eFluor610, Flk2-PE, CD34-FITC鸡尾酒。30分钟后在室温下染色,细胞用1×磷酸缓冲溶液(PBS)。外周血移植的研究获得了retro-orbital出血和血红细胞耗竭。样本染色与抗体在室温下30分钟CD45.1-PE-CF594, CD45.2-APC, CD3-PE-cy7, CD19-PE CD11b-FITC, NK1.1-APC-cy7。coculture研究,样本染色30分钟在室温下与抗体CD3-PE-cy7, CD19-APC-cy7 CD11b-PE, NK1.1-APC。流仪排序和LSK细胞分析、肝脏单核细胞和抗体染色血统抗体cocktain-percpcyTM5.5, sca-1-APC, CD117-PE-eFluor610 LFA-1-PE-cy7, VLA-4-FITC。枯氏细胞和抗体染色F4/80-PE-CF594, CD11b-PE ICAM-1-APC, VCAM-1-FITC。 For Ki-67 staining of LSK cells, the samples were stained for 30 min at room temperature with antibodies against lineage antibody cocktain-percpcyTM5.5, sca-1-APC, CD117-PE-eFluor610, and Ki-67-PE. The cells were analyzed and sorted using a FACSAria III cell sorter (BD). The purity of sorting was higher than 95%. The antibodies are presented in TableS1。
2.4。枯氏细胞隔离
枯氏细胞被胶原酶消化和孤立Percoll密度梯度离心法。老鼠与2毫克/毫升/ 20公斤利多卡因麻醉前剖腹手术。门静脉插管24 G留置针,和EGTA肝脏灌注了1 - 3毫升/哈佛商学院的解决方案。下腔静脉肝后迅速切断了完全苍白。接下来,肝脏灌注了37°C prewarmed胶原酶解5分钟。肝脏切除,然后转移到培养皿中含有胶原酶溶液和消化了15分钟37°C孵化器。肝脏匀浆被过滤到一个50毫升离心管。细胞悬液离心三次在50 g×3分钟。最终的细胞上清液离心机在500 g×8分钟。细胞沉淀在25% resuspended Percoll Percoll,慢慢地增加了50%。 The 25%/50% Percoll gradient was centrifuged at 800 × g for 15 min. The interface of the gradient kupffer cell-enriched fraction was resuspended in 1× PBS and centrifuged at 500 × g for 8 min. The cellular precipitate was resuspended in 1 mL DMEM+10% FBS medium. The cells were then seeded into 24-well plates at a density of 细胞/。37°C的细胞被孵化有限公司5%2孵化器。30分钟后,中温柔地删除和细胞被洗了三次1×PBS,然后替换为500μL新的DMEM培养基。
2.5。实时聚合酶链反应
肝组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA浓度量化使用Nanodrop 2000(美国佛蒙特州BioTek)。互补脱氧核糖核酸生成使用FastQuant RT工具包(Tiangen生物技术有限公司,北京)。实时聚合酶链反应(存在)进行使用SYBR绿色Supermix(罗氏、巴塞尔、瑞士)。并给出了引物在表S2。
2.6。公司坚持试验
执行公司坚持试验根据王等描述的方法。19)与某些修改。肝脏单核细胞与CFSE标记15分钟然后洗1×PBS。细胞悬浊液和anti-CD16 Fc阻塞/ CD32室温。10分钟后,细胞被染色的鸡尾酒血统抗体cocktain-percpcy5.5, Sca-1-APC, CD117-PE-eFluor610抗体。接下来,CFSE+LSK细胞被流式细胞术进行排序。的密度 排序CFSE+500年LSK细胞μ每口井的L IMDM补充10%的边后卫被播种 枯氏细胞单层(提前孵化1 h 10μg / mL anti-ICAM-1阻止抗体)24-well板和孵化37°C。12小时后,板动摇了30年代的摇床在120 rpm。不依从CFSE+细胞被移液取出。这些细胞被轻轻洗两次,通过流式细胞仪计数。附着CFSE的比率+LSK细胞最初添加计算。
2.7。细胞因子的检测ELISA
新孤立枯氏细胞( 每口井)被播种到24-well盘子和孵化在37°C。文化的上层清液收集在24小时和48 h,分别。的coculture上层清液收集在72 h。自洽场IL-3, il - 6, TNF -α、地震和il - 1β在细胞培养上清液用ELISA试剂盒检测(美国新泽西州PeproTech)按照制造商的指示。
2.8。公司移植
CD45.1老鼠致命剂量的辐照10 Gy。老鼠与2毫克/毫升新霉素与水补充。总共 LSK CD45.2小鼠细胞混合 未分离CD45.1+竞争对手静脉注射骨髓细胞和注入辐照CD45.2接受者老鼠。外周血得到每周和髓细胞和淋巴细胞的比例计算通过流式细胞术。
2.9。免疫荧光显微镜
肝脏单核细胞收获与CFSE标记。CFSE+LSK细胞分类通过流式细胞术和通过尾静脉注入小鼠。第二天,肝组织收割,浸泡在场外诱捕剂。冻结部分肝组织是由第一次修复肝脏在4%多聚甲醛,持续15分钟。样本和1×PBS洗了三次5分钟。然后,组织孵化在5% BSA在室温下30分钟(20.组织部分沾anti-ICAM-1之前和anti-F4/80抗体在一夜之间在4°C。样本然后洗了三次1×5分钟PBS和沾7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic酸(AMCA)山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)和Alexa面粉594山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)在室温下1 H。样本和1×PBS洗了三次5分钟和显微图像是利用激光共焦显微镜(LSM780、卡尔蔡司AG)、德国)。
2.10。统计分析
数据分析使用GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件公司USA Inc .)。使用双尾学生统计差异计算 - - - - - -测试。的阈值 被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。成年小鼠肝脏含有造血祖细胞
造血干细胞首先出现在aorta-gonad-mesonephros (AGM)地区胚胎10.5天(E),然后迁移到胎儿肝脏E11.5周围,他们经历急剧扩张21- - - - - -26]。此外,先前的研究已经确定了LSK成人肝细胞的存在(3]。确认存在造血祖细胞在成年小鼠肝脏,我们发现,相比LSK从小鼠肝脏细胞的比例在不同发展阶段通过流式细胞术(图S1 (a)和数字1(一)- - - - - -1 (d))。结果表明,有一个更高比例的LSK胎儿肝细胞周围E13.5(数字1(一)和1 (b)从E13.5),随后逐渐降低新生儿出生的频率 来 林- - - - - -细胞(图1 (b))。从新生儿出生到成人,少数LSK细胞仍在肝脏,尽管较低的数字相比,表现出在胚胎阶段。LSK成人肝细胞的比例大约是 的林- - - - - -细胞在肝脏(图1 (c)),低于观察骨髓(数字1 (c)和1 (d))。
(一)
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(c)
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(g)
(h)
进一步验证LSK细胞的造血活动来自于成人肝脏,我们首先检测肝脏单核细胞的集落形成活动与骨髓单核细胞作为一种控制用甲基纤维素半固体培养基测定。正如所料,肝脏单核细胞可以形成GM-CFU M-CFU克隆(图1 (e))。如图1 (f), GM-CFU克隆和 M-CFU克隆从肝脏单核细胞被发现在12天的文化。这些结果表明,肝脏造血祖细胞和单核细胞包含有能力形成菌落,尽管这种能力低于来自骨髓。我们下一个检测LSK细胞的集落形成能力排序通过流式细胞术从肝脏和骨髓。我们发现LSK细胞来源于肝脏有能力形成GM-CFU和M-CFU克隆(图1 (g));然而,GM-CFU的总数和M-CFU克隆来自肝脏LSK细胞明显低于那些从骨髓分离(图1 (h))。这些发现表明肝脏LSK可以形成造血细胞克隆,尽管是在一个较弱的程度上比骨髓LSK细胞。总之,这些结果表明存在造血祖细胞在成年小鼠肝脏和肝LSK细胞的造血潜能。
3.2。鼠成年肝脏LSK细胞能够产生淋巴和髓细胞在活的有机体内
早在1996年,伊藤等人发现LSK成人肝细胞可以重建multilineage造血作用[3]。然而,CD3的比例+T细胞和NK1.1+细胞中没有检测到之前的报告。确认LSK小鼠细胞的造血功能成人肝脏,LSK细胞的重新繁衍能力与竞争重新繁衍化验检查。总共 LSK细胞悬浮液从肝脏或获得骨髓捐赠者CD45.2+老鼠是混合 竞争对手从CD45.1小鼠骨髓单核细胞悬浊液,注入致命辐照CD45.1+收件人确认hematopoietic-reconstitution活动(图S1 (a)和1 (b))。Donor-derived (CD45.2+)CD3+,CD19+,NK1.1+,CD11b+细胞被CD45.1外周血中检测到+受体小鼠移植后不同时间点。如数据所示2(一个)- - - - - -2 (f),LSK细胞来源于肝脏可以产生一个高比例的淋巴细胞(包括T细胞和B细胞)移植后三周;然而,LSK细胞的造血重建能力来源于肝脏显著弱于孤立的骨髓。我们发现LSK优先从肝细胞分化成T细胞与骨髓相比。此外,LSK细胞来源于骨髓生成主要是生产的B细胞和T细胞少。没有观察到的差异的重新NK和髓细胞来源于LSK的肝脏和骨骼细胞(数字2(一个)- - - - - -2 (f))。确定目标,网站的区别肝LSK细胞移植后,我们发现CD45.2+细胞受体肝脏和BM LSK移植后在第九周。结果表明,CD45.2+在肝脏细胞能被探测到的但不是在大英博物馆在老鼠身上接受肝脏移植LSK(图2 (g))。类似与外周血(图2 (e)),分化CD3+T细胞,CD19+B细胞,NK1.1+T细胞,CD11b+髓细胞,尤其是CD3+从CD45.2 T细胞+供体细胞在肝脏中发现(图2 (g))。然而,对于BM LSK移植,CD45.2+细胞被发现在两个收件人BM和肝脏;CD45.2+donor-derived CD3+T细胞,CD19+B细胞,NK1.1+T细胞,CD11b+肝脏中髓细胞生成,其中CD19+主导(图B细胞2 (g))。这些结果表明liver-derived LSK细胞特别是肝脏,在那里他们进一步分化成髓细胞和淋巴细胞,但很少回到大英博物馆。然而,BM-derived LSK细胞可以转移到大英博物馆和肝脏。综上所述,这些结果表明,成人肝脏公司可以预定到肝脏分化成髓细胞和淋巴,特别是优惠T细胞分化。
(一)
(b)
(c)
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3.3。枯氏细胞促进LPS-Induced肝脏造血作用
接下来,我们探讨是否成人肝脏、骨髓中的造血利基,包含因素调节保留,增殖,静止,和公司的区别。多个细胞和分子组件参与骨髓造血干细胞利基的维护。特别是,据报道,在骨髓巨噬细胞有助于公司维护CXCL12-CXCR4趋化因子信号(10,27- - - - - -31日]。因此,我们调查是否枯氏细胞,肝的重要常驻巨噬细胞,参与维护和促进公司利基在肝脏和相关的机制。由于只有少量的造血干细胞位于正常成人肝在静止状态,我们使用LPS-stimulated小鼠骨髓造血作用模型(1)促进成人肝脏造血作用。我们发现肝脏LSK细胞的频率后腹腔内注射LPS(图S2)。首先,我们测量LSK细胞的数量和长期造血干细胞(LT-HSC,林- - - - - -本来就+ckit+Flk2- - - - - -CD34- - - - - -)与流式细胞术的骨髓和肝脏。如果老鼠肝脏中只有少数LSK(约 的林- - - - - -细胞)和LT-HSC(约 LSK细胞)细胞。然而,肝脏LSK和LT-HSC细胞的绝对数字在LPS-treated显著增加小鼠相比,如果老鼠(LSK:从 增加到 ;LT-HSC:从 增加到0.046×104±0.049×104)(数据3(一个)和3 (c))。类似于肝脏、骨髓LSK细胞和LT-HSCs LPS-treated老鼠也增加(数据3 (b)和3 (d))。这些结果表明LPS刺激促进骨髓肝造血作用,类似于对脾造血作用的影响(1]。
(一)
(b)
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(e)
(f)
(g)
调查的贡献枯氏细胞肝骨髓造血作用的过程中,我们通过静脉注入了CL LPS-treated删除小鼠巨噬细胞和枯否细胞(图S2)。我们第一次观察到治疗单独使用CL并不影响公司的分布在大英博物馆,肝脏和脾脏(图3 (e))。如图S3、治疗与CL显著降低(CD11b枯氏细胞的比例+F4/80+)在肝脏,肝LSK LPS-treated小鼠细胞的比例也显著降低(数字3 (f)和3 (g))。根据以上数据,我们建议枯氏细胞可能导致LPS-induced肝脏造血作用。
3.4。枯氏细胞维持肝脏公司分化成T细胞和B细胞在体外
探讨枯氏细胞有助于肝脏造血作用,我们评估的造血生长因子(自洽场、il - 6和IL-3) (32)分泌由枯氏细胞培养新孤立枯氏细胞24小时和48小时在体外。如图4(一),某种程度的自洽场、il - 6和IL-3能被探测到的上层清液培养枯氏细胞,这表明枯氏细胞持续表达这三个造血生长因子。
(一)
(b)
(c)
(d)
接下来,我们评估枯氏细胞是否可以支持肝脏公司的增殖和分化。我们cocultured肝脏LSK细胞和新鲜孤立枯氏细胞的自洽场有或没有1μg / mL有限合伙人为14天检测分化淋巴的比例和骨髓细胞在不同的时间点。第七天,CD3的比例较低+T, CD19+B, NK1.1+,CD11b+细胞中检测出coculture系统(数据没有显示)。14天,我们只观察到肝脏LSK细胞培养介质和自洽场不能分化成髓细胞和淋巴。虽然枯氏细胞的存在差异化CD3的比例增加+T, CD19+coculture系统的B细胞总细胞与对照组相比,添加系统中有限合伙人枯氏细胞(数据的增强这种效果4 (b)和4 (c))。进一步研究哪些因素促进肝脏分化公司LPS刺激后,我们评估了促炎因子水平coculture LPS刺激后上层清液通过ELISA。我们发现LPS刺激的il - 6水平增加,TNF -α,il - 1βcoculture系统(图4 (d)),而其他细胞因子如地震显示无显著差异。这些结果表明,枯氏细胞维持肝脏LSK细胞的分化在体外有限合伙人可以促进这种效应,一些细胞因子,il - 6等可能会玩一些监管职责。
3.5。枯氏细胞促进肝脏公司的扩散
我们进一步研究了肝枯氏细胞的增殖的影响公司。与1枯氏细胞被刺激μg / mL有限合伙人6 h,之后LSK细胞被添加到枯氏细胞单层膜和cocultured 24 h。LSK细胞测量(图的比例5(一个)),结果表明,LSK细胞的比例和数量显著增加与LPS-stimulated coculturing后枯氏细胞(图5 (b))。探讨LPS-stimulated枯氏细胞增加LSK细胞的增殖,我们评估LSK细胞的增殖能力通过检测ki - 67的表达。首先,我们观察到的比例ki - 67+LSK细胞在肝脏后腹腔内注射LPS和枯氏细胞耗竭的影响特点在活的有机体内(图S2)。我们发现LPS刺激增强肝ki - 67的百分比+LSK细胞相比,接受pbs组(数字5 (c)和5 (e)),而枯氏细胞的清除的比例显著降低肝ki - 67+LSK细胞(数据5 (c)和5 (e))。也观察到类似的结果骨髓(数字5 (d)和5 (f))。上述结果表明,枯氏细胞确实有助于LPS-induced扩散公司在肝脏造血利基。
(一)
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3.6。枯氏细胞促进通过ICAM-1 LPS-Induced肝脏造血和淋巴细胞分化和LFA-1交互
以上结果证实枯氏细胞可以促进肝脏LSK细胞的增殖和分化。我们下一个旨在探索枯氏细胞是否影响维护LSK细胞在肝脏。我们测量了CXCL12水平,血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1),细胞间细胞粘附molecule-1 (ICAM-1), c - kit配体,而表达在肝脏,这些因素已报告参与公司的保留骨髓利基(27,29日,33- - - - - -35]。我们第一次发现mRNA的表达这些因素的水平在肝脏组织脱离鼠标模型中描述的图S2。如图S4 (a)LPS刺激明显增强ICAM-1的水平,VCAM-1, CXCL12 mRNA在整个肝脏组织,但不影响c - kit配体的水平和他们。枯氏细胞的损耗显著降低的水平ICAM-1 VCAM-1 mRNA,但不是CXCL12。我们怀疑VCAM-1、ICAM-1 CXCL12表情枯氏细胞可能导致公司的保留与LPS-induced肝脏骨髓造血作用有关。因此,我们发现CXCL12水平在肝组织匀浆ELISA。我们发现CXCL12生产未达到统计上的显著水平的变化后枯氏细胞耗竭(图S4 (b))。然后我们孤立枯氏细胞和检测到的变化ICAM-1通过流式细胞术和VCAM-1表达。有限合伙人的治疗后,虽然ICAM-1的表达显著增加,VCAM-1没有改变(图的表达6(一))。我们进一步检查的表达LFA-1 VLA-4,相应的配体ICAM-1和VCAM-1,分别在LSK细胞。如图6 (b),但不是VLA-1 LFA-1的表达是有限合伙人治疗后显著升高。根据这些结果,我们推测,ICAM-1之间的交互和LFA-1扮演主要角色在肝脏枯氏细胞维护公司。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
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(g)
接下来,我们进一步测试是否肝脏LSKs驻留紧密ICAM-1-expressing枯氏细胞在肝脏的解剖结构。对于这个试验,肝脏LSKs是从CD45.2排序的+老鼠通过流式细胞术、静脉注射和CFSE标记,然后转入CD45.1+老鼠。肝组织部分创建了一天后,观察LSK细胞的位置使用免疫荧光测定。我们发现CFSE-labeled LSK细胞局部ICAM-1附近+枯氏细胞在肝脏(图6 (c))。确认ICAM-1之间的交互和LFA-1附着试验。新孤立枯氏细胞preincubated anti-ICAM-1 Ab (10μg / mL),然后用新鲜cocultured排序LSK细胞。不依从细胞数在12 h。我们发现LSK和枯氏细胞之间的粘附程度阻断ICAM-1(图后显著降低6 (d))。这些结果表明,枯氏细胞可能保留少量的LSK肝细胞通过ICAM-1之间的交互和LFA-1正弦信号。
我们进一步研究了枯氏细胞对造血干细胞的影响在阻塞ICAM-1 coculture系统。肝脏林- - - - - -细胞分类和cocultured枯氏细胞自洽场的存在有或没有一个anti-ICAM-1抗体七天,和LSK细胞随后被发现(图S4 (c))。我们发现LSK细胞总数和林- - - - - -细胞ICAM-1封锁后显著下降(数字6 (e)和6 (f))。我们进一步分析了影响枯氏细胞对造血干细胞的分化。肝脏LSK细胞纯化和cocultured枯氏细胞为14天,然后,分化淋巴和髓细胞被检测到。我们观察到CD3的总数+T细胞和CD19+B细胞拒绝当anti-ICAM-1治疗组与对照组相比(图6 (g))。综上所述,这些现象表明ICAM-1 / LFA-1维护和分化中起着重要作用的肝HPSCs通过调解枯氏细胞和公司之间的密切联系。
4所示。讨论
先前的报道表明,成人肝脏包含公司拥有hematopoietic-reconstitution能力(3- - - - - -6]。然而,没有研究全面比较之间的差异在造血和lymphogenesis成人肝脏和骨髓。此外,成人肝脏微环境的关键因素,有助于肝脏造血作用尚不清楚。在这项研究中,我们证实成年小鼠肝脏公司分化成髓细胞和淋巴。值得注意的是,肝脏LSK细胞产生T细胞的能力明显强于BM-LSK的细胞,而BM-derived LSK细胞主要是B细胞产生。这些发现表明,肝脏造血展览不同于骨髓造血的功能。此外,我们证实肝常驻巨噬细胞、枯氏细胞,能促进肝脏公司来生成一个高比例的T和B淋巴细胞通过ICAM-1和LFA-1之间的交互。阻塞ICAM-1枯氏细胞受损的附着力,扩张,和分化的成年肝脏公司。我们的研究结果表明枯氏细胞的关键作用在维护和促进成年小鼠肝脏造血作用,特别是肝脏的T细胞和B细胞分化。
造血微环境,尤其是干细胞利基,支持自我更新是至关重要的,公司的扩张,和分化造血组织(36]。除了所需生长因子(例如,干细胞因子,flt3配体,IL - 6和IL-3),公司和细胞之间的直接交互组件(如血管内皮细胞、成骨细胞和间充质干细胞)内为调节造血干细胞利基是至关重要的(11,37,38]。虽然细胞基础的骨髓造血利基是明确的,成人肝脏造血利基的成分和机制保持澄清。时,Barbera-Guillem报道,肝脏正弦内皮细胞(LSECs)扮演着一个关键角色,支持公司的增殖和分化39]。此外,证据表明,LSECs提供所需的信号骨髓造血干细胞的迁移和归巢和促进B淋巴细胞增殖40,41]。然而,枯氏细胞肝脏造血的作用尚未完全阐明。大冢等人报道,枯氏细胞作为基质细胞和支持骨髓红细胞生成splenectomized小鼠的肝脏(42]。此外,在F4/80 phenylhydrazine-induced骨髓造血模型+巨噬细胞被发现是紧密包围成红血球细胞的肝血窦,类似于胎儿肝脏(红细胞生成43]。然而,枯氏细胞的作用和分子机制在lymphocytopoiesis知之甚少。在目前的研究中,我们发现枯氏细胞促进肝脏造血作用。我们的数据表明,枯氏细胞有助于支持肝脏公司的扩散和维持肝脏公司,分化成淋巴细胞。关于相关的机制,我们建议(1)在稳态条件下,枯氏细胞分泌IL-3 hematopoietic-promoting因素,il - 6,和自洽场支持维护公司和(2)枯氏细胞促进肝脏造血作用和通过ICAM-1 lymphogenesis LFA-1交互。据我们所知,这是第一个报告调查枯氏细胞的作用和机制在促进lymphogenesis肝脏骨髓造血作用。我们的数据也提供了证据,枯氏细胞肝脏造血利基市场的一个重要组成部分。
虽然一些证据表明,可能存在不同的特征之间的肝脏和骨髓造血作用,缺乏全面的比较研究。Golden-Mason et al。8)报道,正常成人肝是能够支持T细胞的发展。他们发现,正常成人肝含有相当比例的肝星状细胞表达lymphoid-associated标记,而大多数CD34+骨髓细胞表达myeloid-associated抗原,B细胞标记,CD19 CD33+,但表现出更少的T细胞祖细胞(8]。根据一项研究的结果(44),本研究比较了骨髓造血和lymphopoietic能力之间,liver-derived公司使用一个在活的有机体内模型和一个在体外coculture。我们发现liver-derived LSK细胞特别是肝脏,在那里他们进一步分化成髓细胞和淋巴细胞,然后进入末梢循环。然而,BM-derived LSK细胞可以转移到大英博物馆和肝脏。值得注意的是,肝脏LSK细胞优先分化成T细胞,而LSK细胞来源于骨髓生成主要是生产的B细胞和T细胞少。没有差异的重新NK和髓细胞来源于LSK的肝脏和骨骼细胞之间。这些发现与先前的报道是一致的证据关于人类肝脏的T细胞发展支持作用[8]。Extrathymic T细胞分化在肝脏肿瘤也被观察到小鼠和肿瘤患者或接受肝移植(8,45- - - - - -47]。建议extrathymic原产地T细胞可能参与肿瘤免疫和促进器官移植后免疫耐受7,48,49]。我们还发现,有限合伙人可以帮助枯氏细胞促进肝脏分化公司成T细胞和B细胞。最近的研究强调了重要作用的有限合伙人生产在肝脏疾病的发病机制,如非酒精性脂肪肝/纳什和肝细胞癌(HCC) (50]。我们的研究结果可能有助于研究这些肝脏疾病的状态下肝脏造血作用。
然而,肝脏公司的起源和T细胞的功能来源于肝脏公司仍不清楚。接下来,我们需要进一步确认是否成人肝脏公司来自胎儿所剩下的公司或从骨marrow-circulating公司。还需要说明肝脏骨髓造血的功能和意义,尤其是治疗肝肿瘤及相关疾病。
5。结论
总之,本研究的结果表明,成年小鼠肝脏造血公司展览活动,主要区分为T和B淋巴细胞。可以促进我们进一步证实,枯氏细胞粘附、增殖和分化的成人肝公司ICAM-1和LFA-1之间的互动。这些发现提供了重要的见解认识肝脏造血微环境,并可能帮助liver-related疾病新的治疗方法的发展和维护肝移植后免疫耐受的。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
信息披露
抽象的手稿已经作为会议文摘”13国家免疫学学术会议Sub-meeting交易所报告”由中国免疫学学会(51]。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
C.Z.定向研究项目,实验设计提供指导和建议,分析数据,并写了手稿。D.M.表现和设计实验,分析数据,并写了手稿。Y.Q. K.F.进行实验。N.L.为试验设计提供了指导,导致对数据进行分析和讨论。区域时间为该研究提供了指导和建议。
确认
这个工作是由以下C.Z.赠款:中国的国家自然科学基金(91842305,91842305,81771686),中国全国973基础研究项目(2013 cb944901)和国家重大科技项目的控制和预防重大传染病在中国(2018 zx10301401)。
补充材料
补充表S1:小鼠抗体列表。补充表S2:用于实时PCR引物序列。补充图S1:分析和排序策略的骨髓,肝脏和胎儿肝脏LSK细胞。补充图S2:枯氏细胞耗竭和LPS处理的流程图。补充图S3: clodronate-liposome治疗显著降低肝枯氏细胞的比例。补充图S4:因素促进和维护肝脏造血作用。(补充材料)