设计原则为多能干细胞瀑样工程

文摘

人类的形态发生是一个复杂的过程,涉及不同的微环境和物理信号操纵在时间和空间上产生复杂的组织和器官。多能干细胞(PSC)技术的进步促进了在体外娱乐的人类形态发生过程。瀑样从人类的发展已经被认为代表一个可靠来源的建模光谱的人类疾病,以及一个有前途的药物筛选方法和毒性测试。基于干细胞的“自组织”能力,不同PSC-derived瀑样创建;然而,相当大的差异在体外生成PSC-derived瀑样和他们在活的有机体内同行已报告。生物工程领域方面的进展允许不同组件的操作,包括细胞和非细胞的因素,更好地模拟在活的有机体内微环境。在本文中,我们专注于不同的生物工程的方法用于促进干细胞的自我组织,包括装配、模式和形态发生在体外,造成组织如结构的形成。

1。介绍

的应用生物仿生概念,定义为生物系统的模仿,加剧了过去几年再生医学的重要创新。这个概念通常是与新方法,旨在实现自然形式或功能的重演,自然过程或自然系统(1,2]。在生物工程领域,一直努力模仿人体的自然形式和功能在体外,从分子水平到细胞水平,为了再现复杂性水平最高,有机体。

最近,发现多能干细胞的能力已经被协调各种关键信号和概括不同的结构在活的有机体内,包括组织和迷你organ-like结构,我们的知识对人类发展和形态发生在健康和疾病环境大大改善3,4]。人类器官形成的重演在体外,“瀑样”的概念出现了。1946年,首次采用“瀑样”术语定义tumor-derived质量与人体组织(5]。随后,所有群众组织合成移植被定义为“瀑样”6,7),而产生的概念演变包括文化动物——和tissue-derived细胞分裂和聚合8- - - - - -10]。最近的进步人类文化和PSC扩张直接分化,随后的“瀑样”定义相同的进化,现在指的一个在体外3 d多细胞结构与自组织包含不同类型的细胞,如人体组织,通常来源于干细胞(2]。频繁,瀑样显示球形或不规则形状在暂停或嵌入在不同类型的矩阵(11]。

内的娱乐功能和结构模仿瀑样需要最小数量的设计灵感的原始生物系统组件。这些包括细胞和非细胞的参数,如细胞类型和微环境和物理参数,以及由此产生的内部和外部的相互作用,像信息一样,cell-matrix, cell-microenvironment [12]。最终目标是重建人类组织的一些特性,特别是存在不同的细胞类型概括多细胞异质性,并控制微环境重新创建一个高水平的组织,促进瀑样成熟实现组织功能(11]。因此,生物工程的应用策略操纵细胞和非细胞的组件可能会成为一个强大的工具直接3 d人体瀑样形态发生。

瀑样显著进步的一代小说提供了可能使用这些平台对于理解人类发展和器官形成的复杂过程。瀑样的使用在药物筛选和毒理学测试还可以提高药物的安全性和效率达到临床试验之前,使药物开发过程更划算。最后,disease-derived瀑样也可以提供一个有价值的平台,研究疾病表现和所涉及的机制来识别可能的治疗靶点。

在这里,我们审查不同的生物工程方法直接细胞的干细胞进一步承诺和自我组织,所有关键组织形态发生在体外。首先,细胞的自组织能力是探索基于信息和cell-matrix交互。之后,作为自组织是基于三种不同的细胞相关的能力,包括自组装,self-patterning, self-morphogenesis,我们突出的例子生物工程方法来控制初始状态和细胞的时空定位,最后,多细胞总量的增长和重构来实现复杂的结构(表1)。

2。自组织在PSC-Derived瀑样

人类的能力已经被生产繁殖特性的高度有组织的结构类似于胚胎和成年组织首次发现是在注射后的畸胎瘤形成人类胚胎干细胞(ESCs)拥有(综述[老鼠13])。“自组织”能力包括三个不同的类别:第一,控制细胞的相对位置,名为“自组装”;第二,细胞的时空控制阶段,定义为“self-patterning”;最后,促进变形的能力,发展,和改造,这称为“self-morphogenesis”(图1)[14]。这种内在能力的组织强烈依赖的生理和形态特性的细胞,他们获得的自体和外源信号,以及系统的机械特性。

2.1。信息胶粘剂互动

在胚胎发生过程中,发挥重要作用和信息交互动态变化的细胞分类,安排,和移民来自不同的组织形态。细胞间粘附力是至关重要的装配和组织成一个三维结构。最重要的和全球机制是由钙粘着蛋白介导的细胞粘附交互,Ca^{2 +}端依赖跨膜蛋白,促进亲同种抗原的细胞外信息附着力的域,而胞内域与伴侣蛋白,连环蛋白(综述[15])。信息后粘连,形成蛋白质复合体的连环蛋白多肽组成α- - - - - -,β——或者γ-catenins(了16])。随后,α连环蛋白肌动蛋白细胞骨架介导物理交互,证明钙粘着蛋白还可以指导细胞细胞骨架锚定(17,18]。不同的钙粘蛋白的表达在不同的组织,研究古典脊椎动物钙粘蛋白,包括N-cadherin、神经组织中高度表达(19,20.,钙粘蛋白,主要在上皮细胞中表达21]。模钙粘蛋白可以找到在其他人体组织,例如,VE-cadherin,血管内皮钙粘蛋白(22),R-cadherin在视网膜组织中表达19]。

在形态发生过程中,不同的机制涉及影响细胞钙粘着蛋白出现排序,从而改变细胞的空间组织。不同类型的钙粘蛋白的表达在不同的细胞类型促进细胞的选择性识别和连接表达相同类型的钙粘着蛋白导致细胞分类和分离成不同的组织(23- - - - - -25]。例如,N-cadherin表达神经细胞允许分离的上皮细胞表达钙粘蛋白(图2(一个))[26]。在其他情况下,钙粘着蛋白类型的独立表达,细胞排序也观察到基于微分的钙粘蛋白表达水平(25,27,28]。epithelial-mesenchymal过渡(EMT),上皮形成的反向,强烈的自我组装能力细胞由钙粘蛋白的表达和调控(图2 (b))[29日]。这个过程是通过改变和信息联系,促进细胞迁移。特别是,钙粘蛋白表达下调是在转换到间质状态,导致信息交互的减少(30.,31日]。同时,改变细胞信号配置文件和细胞骨架的二次调制是观察,允许细胞迁移(了32])。

此外,其他生理因素与cadherin-mediated信号可以影响细胞钙粘着蛋白表达的独立排序。在开发期间,创建了一个前后轴线形成间的界限。尽管上皮细胞表达高水平的钙选择性粘附观察创建不同的边界在回应刺猬(Hh)信号33,34]。激活后Hh表达的细胞有助于扩散前后信号的边界,确定一些前细胞的分类边界,不能够接受Hh和排序后的区域(34]。此外,钙粘蛋白的动态监管粘连可能驱动细胞重组和迁移。打破和改革钙粘着蛋白胶粘剂债券,收敛扩展运动有助于组织形态发生改变当地的细胞排列对邻近细胞(35,36]。

除了钙粘着蛋白在形态发生的重要功能,其关键作用在细胞聚集形成并进一步分化已经证明。ESCs E-cadherin-mediated的抑制粘附,聚集在细胞聚集是预防以及它们的分化37- - - - - -39]。因此,控制干细胞分化的技术操作和信息交互创建了。例如,表面工程的固定钙粘着蛋白已经被用于操纵cadherin-mediated信号通路,从而直接干细胞命运决定(40,41]。此外,它被证明不仅钙粘着蛋白调节干细胞分化的固定,但与相邻细胞的相互作用也有重要的作用模式特定的细胞类型。某些祖细胞的公司允许的特定的信息交互模拟在活的有机体内条件和操作分化过程。例如,coculture organ-matched间充质细胞允许祖细胞的增殖、分化,导致祖细胞,能够有效地产生大量的特异性分化细胞(42]。

2.2。Cell-Matrix交互

不仅信息交互提供重要的细胞信号利基,但其他的结构,物理、电气、或生化信号出现在胚胎发育期间复杂的微环境也会影响细胞命运的决定(了43])。细胞外基质(ECM)是一个重要组成部分,给出了结构支持细胞利基也贡献为调解信号细胞迁移,保留和极化(44,45]。ECM是由主要由葡糖氨基葡聚糖和纤维蛋白分泌的细胞生成自己的物理脚手架(综述(43])。细胞与ECM分子通过整合蛋白,细胞粘附受体,调控细胞行为(了46])。

整合蛋白的一个家庭heterodimeric跨膜糖蛋白是由非共价连接形成的地方α和β子单元(47]。在脊椎动物中,24个不同导致形成不同组件的18岁α子单元和8β子单元已被描述。根据他们的亚基组成,整合蛋白可分为不同的子组。在一定条件下,每一个细胞类型展览具体的整合素的签名,包括整合蛋白的子群和数量(了48])。然而,这是一个动态的过程,发展阶段和微环境条件可以改变整合素曲目(了49])。而整合蛋白的细胞外域与ECM组件,包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、胞内域与细胞骨架和调节蛋白,如α辅肌动蛋白细丝蛋白,calreticulin, cytohesin(了50])。也知道,相同的ECM组件与不同的整合素受体相互作用,在相同的方式,一个特定的整合素受体可以识别不同的ECM组件(综述(48])。

整合蛋白在胚胎发生的作用已被广泛研究和数据积累到目前为止已经足够在受精整合蛋白作为重要的球员,在原肠胚形成细胞迁移,粘附在胚胎植入,和一代不同的器官系统,神经系统(了50])。此外,它已经表明,ECM的合成能够影响ESC行为发展的三维结构以及它们的分化。例如,据报道,纤连蛋白强烈刺激内皮细胞和血管细胞分化,而层粘连蛋白促进跳动的心肌细胞的生成(51]。最常用的矩阵PSC分化和一代的不同类型的瀑样人工基底膜,这是一种凝胶状的蛋白质混合物提取Engelbreth-Holm-Swarm老鼠肉瘤细胞(52,53),容易lot-to-lot变异。很少有研究试图解决的确切机制基底膜基质支持瀑样开发。虽然直接信号转导过程的操作干细胞的命运仍然是非常困难的,有些团体一直在研究具体的整合蛋白的参与在PSC分化,与关注识别ECM组件直接互动与特定的整合素子群和促进选择性内胚层[54],中胚层[55),或外胚层56分化。

除了这些化学线索从ECM、机械和物理刺激,如孔隙度和刚度,还对细胞施加其影响力的承诺(57]。刚度矩阵可以感觉到通过机械还包括整合蛋白、细胞调控细胞行为(了58])。虽然中间衬底刚度偏内胚层的血统,软基板来源于外胚层的组织(59]。也表明,中胚层分化是非常敏感的ECM的机械性能60]。而软基质增强中胚层承诺,僵硬的矩阵诱导只有最小的中胚层分化60]。在后面的研究中,作者表明,软底物,人类的ESCs礼物β连环蛋白积累在信息粘连导致增强WNT信号和随后WNT-dependent中胚层分化。相比之下,硬材料促进integrin-dependentβ连环蛋白降解,从而抑制中胚层的承诺(60]。因此,通过玩生化ECM组件,以及其机械和物理参数,细胞增殖和分化可以操纵三维微环境。

2.3。打破对称

对称破坏是一个关键的现象在动物发展模式形成之前,允许更高的形态和功能专门化的生成。在活的有机体内在单个细胞水平对称性被打破,细胞细胞骨架和膜相关蛋白重新创建apicobasal极性(图3(一个))。例如,尽管整合蛋白积累基底一侧的细胞,形成肌动蛋白丝环在顶端的一面。肌动蛋白环收缩可以推动顶端收缩导致细胞形状改变和上皮薄板弯曲(了61年,62年])。此外,对称性破坏还发生在多细胞层面,可以看到在小鼠早期胚胎。这种形态事件称为压缩变换球面无极性细胞的胚胎从一个松散的集群成一个紧密的质量,信息联系的加强,细胞极化(图实现3(一个))。几种机制参与的压实过程:信息胶粘剂交互,涉及钙粘蛋白的再分配;皮质紧张,由肌动球蛋白生成网络收缩性决定细胞的形状;和扩展的长膜突起(综述(63年,64年])。

精确的分子和生理特性,以及对称破坏发生的准确时间,仍然知之甚少。一些事件似乎细胞自动,根据基因表达在胚胎细胞不对称,和其他人似乎由成形素梯度引起的。事实上,对称性破坏可以通过一个最初形态均匀分布,可以变成一个浓度梯度由于反应扩散65年]。在反应扩散模型中,细胞的自组织能力导致对称性破坏激活系统的随机扰动没有要求主导“主因素”(66年]。因此,细胞特征,包括基因表达和细胞极性,和当地的细胞之间的相互作用可以由自己负责血统。报道研究已经证明,一个统一的整体的干细胞能够产生高水平的组织,与观察是什么在本地组织(67年- - - - - -69年]。一些瀑样模型以最小的但足够的复杂性能够自发对称性破缺没有了空间线索。在本例中,创建了一个特定的模式包括rostral-caudal极化在皮质瀑样67年),前后在3 d模式下gastruloids [68年,70年,71年],dorsal-ventral模式在神经管瀑样69年,72年]。因此,可以达到对称破坏事件在体外添加一个形态形成的机制,通过扩散反应机制,或通过使用更复杂的生物工程方法创建对称打破基于局部成形素交付(图3 (b))。

3所示。组装已经被控制

代瀑样开始通过促进已经被装配到一个3 d结构。类似于人类胚胎,最早的细胞命运的决定是基于细胞的空间定位(了64年])。因此,方法来控制细胞排列在最初瀑样装配可以进一步影响形态发生感应。可以实现装配过程基于细胞的自组装性质scaffold-free组织工程方法或通过使用不同的生物工程策略指导和控制细胞的排列。

3.1。Scaffold-Free方法

scaffold-free方式瀑样的生成是基于干细胞的“自组织”属性,细胞能够组装在一个三维结构。不同的方法已经被应用于3 d形式已经被聚集,与胚状体体悬滴法(EB)形成的第一个用于生产的同类细胞聚集。这项技术是基于重力迫使细胞总,由创建小滴一个中等细胞悬浮在一个盖子73年]。克服可能扰乱EBs的操作的局限性,这种技术是适应尖底,圆底多井盘子,被迫迅速聚集,细胞通过应用旋转力(74年]。然而,这种方法并不避免个人操纵细胞的聚集。因此,不同microwells所使用的光刻技术被用来同时产生100年代到1000年代的细胞聚集通过离心分离,允许扩大的多井板技术75年- - - - - -77年]。此外,微流体通道也被用于细胞总量的不断形成,成为一个强大的工具为高通量应用程序(78年]。

在这些scaffold-free方法,最重要的参数是控制生成的聚合物的大小。这是证明细胞定位影响的大小分化轨迹因为它对微环境参数的影响,包括可溶性分子的空间梯度,和和cell-matrix交互79年,80年]。因此,由于细胞数量的变化转换成不同的总大小,控制总大小可以影响细胞信号通路进行更有效的承诺和分化。事实上,不同的研究小组一直在优化骨料直径改善中胚层或neuroectodermal感应,实现更高收益率的心脏和神经细胞(81年- - - - - -83年]。

最近,谢等人报道,不仅细胞总量的大小可以影响分化走向不同的血统也自组装动力学。研究表明,聚合动力学改变了EB结构;特别是,孔隙度较高的慢动力学起源于EBs促进细胞生长因子的暴露。最终,更快的聚合似乎忙外胚层的承诺而缓慢聚合促进mesoendodermal分化(84年]。

3.2。实施外部和内部架构的支架

细胞组织工程中的组织包括组装细胞变成了模仿的架构的具体安排本地组织。模仿的在活的有机体内物理和生化性质的组织微环境,可以使用不同的矩阵,包括那些从自然资源或人工合成。一个特定的体系结构可以通过使用不同的方法来操纵外部强加的组织形态,如模具和支架。例如,微触印刷可以提供不同的模具从不同的材料如琼脂糖,聚二甲硅氧烷,或聚丙烯酰胺,用最小的粘附特性,只有迫使细胞聚合和获得一个特定的形状85年,86年]。除此之外,这项技术可以用来介绍一些功能化通过直接沉淀蛋白或ECM组件到部分聚合基质(87年]。此外,控制的形状、大小、空间,在不同的生物材料和组织对称纳米功能已经通过使用不同的纳米策略。在不同的nanotopography方法中,电纺的允许nanofibrous基质的形成从天然或合成聚合物,当电子束,选择性腐蚀,和nanoimprinting用于创建nanopits, nanopillars或各种材料纳米通道。通过应用这些不同的方法,基底膜的自然维度纤维和孔隙大小的孔隙度可以达到允许模仿天然ECM(了88年])。

支架用于施加外部形状和模仿天然ECM主要有固定形态。然而,人类发展开始在微尺度,发生相当大的形态学变化来实现最终的形态发生。因此,它是非常重要的来动态地控制瀑样形态以达到正确的组织如组织。不同类型的水凝胶的应用能够提高3 d微尺度的控制瀑样的形态。水凝胶亲水性三维聚合物网络与不溶性的天然或合成的起源由于化学交联或物理的存在89年,90年]。内部结构的水凝胶可以通过使用不同的技术来操作,包括3 d打印(91年和牺牲成型92年],它能调节形态生成的结构。

在过去的几年,显著改善了关于3 d印刷机械性能和功能的水凝胶。有不同的报道水凝胶复合3 d打印技术,允许制造复杂和高度可定制的支架结构,包括nozzle-based、激光和inkjet-based 3 d印刷系统(了93年])。nozzle-based 3 d印刷是最常用的方法,在粘性液体或熔融聚合物被迫挤出喷嘴,注射器,顺序或孔以构建一个三维结构基于预先设计路径由计算机建模。辛顿等人报道,最近一个适应力强、具有成本效益的nozzle-based 3 d打印技术,称为自由悬浮水凝胶的可逆嵌入(新鲜),使用thermo-reversible支持浴,使沉积的水凝胶。基于3 d成像数据从全器官,新鲜能够打印支架与复杂的内部和外部的架构,包括胚胎心脏的三维CAD模型(94年在器官形成),展示了一个有价值的适用性。此外,激光三维打印系统也能够构建3 d结构photo-treatable水凝胶在激光能量的沉积,通常紫外线,为特定的设计模式(95年]。最后,喷墨印刷是一种非接触印刷技术用于创建墨水滴到材料平台(了96年])。虽然生物分子和结构是脆弱和敏感,这种方法似乎是适当的引入生物修改生成的支架,因为它已成功地用于核酸等生物分子转移到固体支持(97年]。

米勒等人是第一个报告的生成圆柱形网络在不同使用3 d丝网络水凝胶的碳水化合物玻璃作为牺牲模板(92年]。因此,他们能够模式血管网络成型通道的三维组织结构。在这项研究中,这种牺牲成型技术也被其他组织建立内部蛀牙微观到宏观尺度的维度不同的水凝胶材料通过应用不同的模具,包括海藻酸钙和聚乙烯醇(PVOH)模板98年,99年]。短暂,牺牲成型技术是基于封装在第二个水凝胶材料可溶解的或可降解材料。复合水凝胶形成后,内部牺牲材料被创建和水凝胶内部架构定义。操纵这个内部结构的水凝胶不仅提供了重要的工具来创建血管组织也为瀑样封装、内部空间允许的增长,变形,重塑瀑样的生成定义的形态。

3.3。生物工程方法来操纵瀑样组装

应用了若干生物工程方法指导细胞组装以达到所需的细胞排列和瀑样的形状。Todhunter等人报道,2015年DNA-programmed组装细胞(DPAC)的大小、形状、组成、程序和空间异质性,从而再现瀑样的多细胞组织(One hundred.]。在DPAC, 2 d DNA-patterned基质用于指导细胞组织通过提供免费油脂修改寡核苷酸。执行这个程序汇编后,DNase治疗释放一个组织良好的细胞聚集,紧随其后的是封装在ECM凝胶(One hundred.,101年]。

如前所述的制造支架结构,3 d打印技术也被应用于控制细胞沉积组装的单个或多个类型的细胞有不同的支持矩阵。这种类型的生物打印方法需要不同的方法,如喷墨生物打印,microextrusion系统和激光直写技术,不同的驱动方法应用(综述[102年])。在喷墨生物打印,使用两种不同的驱动方法,压电和热,即声波或热部队,分别用于液体滴做准备。在液滴的热方法变量大小,在压电技术,定期生成和同等大小(103年,104年]。这是一个低成本的技术与高分辨率和打印速度;然而,它有一些局限性有关材料的类型,可以打印出来。虽然有些热,机械应力可以引入到细胞,这种技术已经成功地应用于不同的哺乳动物细胞打印可行性85%以上(104年]。另一方面,microextrusion技术来源于喷墨打印机的修改,这是pressure-assisted机械装置,可以通过气动或机械挤压cell-laden水凝胶分发到衬底(了105年,106年])。人类软骨细胞和成骨的祖细胞结合一个海藻酸凝胶已经挤压通过使用气动注射器分发器,证明能够创建3 d结构高细胞生存能力(107年]。

激光直写技术是最应用生物打印技术。这种技术使用一束激光,重点是捐赠者的支持层底层cell-containing矩阵打印色带,迫使其快速挥发,允许细胞转移到相邻的本地化接收衬底(综述(108年])。高细胞的异常报告使用这种技术,由于低剪切应力及其高分辨率允许单细胞沉积,产生scaffold-free 3 d细胞结构(109年]。对于细胞的应用程序,最常见的激光技术是生物激光加工(BioLP) matrix-assisted脉冲激光蒸发直接写(MAPLE-DW),激光正向传递(电梯),吸收film-assisted激光正向传递(AFALIFT)和激光制导直接写(LG-DW)(综述(108年])。MAPLE-DW被成功用于沉积模式不同的细胞类型和基底膜基质内,证明可以实现空间相干性(110年,111年]。此外,人类骨肉瘤细胞被BioLP印花,转移到人工基底膜,制作一个3 d细胞构造与95%的细胞生存能力112年]。这个方法后来改进的可行的细胞达到100%和单细胞决议(113年]。因此,达到高控制细胞组装,使操纵细胞排列和组合在一个定义3 d微尺度形态学瀑样。

4所示。导演瀑样模式和形态发生

有关信号通路参与多能性的知识维护、以及不同微生物层的生成,使得PSC的操纵和控制不同的血统和承诺进一步分化成特定的细胞类型。例如,很容易通过操纵TGF neuroectoderm承诺β信号(114年]。神经感应从已经被认为是最有效方法的双重SMAD抑制BMP和激活素信号(图4),分别由‘诺金’的敌意和左撇子(114年,115年]。其他化学拮抗剂已经被用来促进BMP信号抑制,Dorsomorphin和ldn - 193189,阻止承诺向滋养外胚层(115年,116年]。对于节点/激活素信号抑制,化学拮抗剂SB431542是有效防止mesendodermal分化TGF通过阻断β信号(115年,117年]。

面对面,双重SMAD监管者的激活,以及WNT信号,似乎是临界初始mesendoderm承诺,引起Brachyury⁺(T) /加工⁺/ MIXL1⁺细胞(118年,119年]。mesendoderm感应后,通过操纵T和加工的水平,进一步向中胚层和内胚层分化可以指定(图4)[120年]。T行动似乎是重要的中胚层的命运,压抑的内胚层分化(120年]。另一方面,高水平的加工对内胚层标记的表达至关重要(FOXA2和SOX17) (121年]。而苯丙酸诺龙会导致人口的发展FOXA2表达升高,导致内胚层规范,WNT FOXA2表达较低的激活生成细胞,重要的中胚层的命运(122年]。有趣的是,尽管BMP mesendoderm承诺不是必需的,孤独,它能够诱导的发展人口FOXA2表达较低的(119年,123年]。在中胚层的规范中,WNT和BMP信号诱导分岔两中胚层亚型,近轴侧中胚层,分别为(124年]。虽然对中胚层WNT似乎重要规范,进一步代软骨细胞,抑制WNT信号是至关重要的促进心脏分化(124年- - - - - -126年]。

另一方面,activin-induced明确的内胚层的建立后,可能会出现不同的细胞群,如肝细胞和胰腺细胞。BMP和WNT信号通路在胰腺的生成有重要作用的血统,而胰岛素生产细胞可以通过规范FGF信号(127年,128年]。FGF和BMP4信号与肝有关规范[命运129年]。

基于之前的操纵信号通路,以及干细胞的“自组织”能力,瀑样不同血统的产生包括大脑、肾、肝、胰腺、肺、肠道(3,130年- - - - - -134年]。Eiraku等人首先展示的能力已经被皮质组织的自组织和概括胚胎大脑发育135年]。之后,兰卡斯特等人能够直接人类PSC分化成不同的大脑皮层区域疾病建模并应用这种技术(3]。各种组织神经元瀑样后来报道,包括前脑、中脑、丘脑下部、和cerebellum-like结构(136年- - - - - -139年]。除了大脑瀑样,由导演已经向中间中胚层,瀑样,反映出人类的妊娠前三个月胎儿肾脏也生成。这些瀑样个人nephron-like结构划分为远端和近端小管周围endothelia和肾间质,展示组织结构(133年]。这些都是一些例子概括人类器官发生的能力在体外从已经只有几个信号提示。然而,本地器官差异,PSC-derived瀑样仍然可以观察到。这可能是由于不恰当的选择微环境线索或静态信号表示在空间和时间。因此,需要更高的时空控制实现原生微环境更相似。

4.1。生物工程方法机械信号的时空控制

正如前面演示的,细胞微环境强烈的机械性能影响细胞分化,以及细胞增殖和细胞凋亡60,140年,141年]。此外,这种特定的机械特性不同器官,甚至在相同的器官,不同组件呈现截然不同的力学性能,使细胞行为的调制和促进多元器官发生(142年,143年]。随后,瀑样代,机械的空间调制特性是一个关键问题,可以通过生成复合水凝胶。例如,传统水凝胶的功能化,如人工基底膜或胶原蛋白,ECM合成类似物可以操纵机械性能(144年,145年]。的粘附肽许可控制流动性,因为长肽束缚导致细胞附着和传播,而短肽束缚诱导细胞粘附阻力,导致细胞集群(146年]。肽底物的结合,也容易受到酶的乳沟也可以调节水凝胶降解细胞,从而促进细胞迁移(147年]。模块化设计的多孔支架丝蛋白质也用于生产水凝胶相结合,再现人类大脑皮层的six-layered架构。同心的报道方法包括一个不用粘着剂组装单位创建模块化结构基于拼图puzzle-like切割过程。通过这种方式,不同的层填充不同类型的神经元,达成和功能3 d皮质组织建设(148年]。替代路线产生复杂的结构与复合水凝胶是一种DNA-directed组装shape-controlled单位。这种技术提出了同样的原则如前所述细胞组装,包括在不同的块圆的浓缩DNA链“胶水。“基于每个DNA块的互补性,可以实现可编程的复杂的宏观尺度结构(149年]。

除了技术报道,使机械的空间调制特性,进一步指导时间可能是由light-mediated模式。可光降解的水凝胶的形成,通过融合对光不稳的根在网络骨干的水凝胶,如聚(乙二醇),使操纵ECM的物理特性可能通过使用不同波长的光。曝光后,本地网络交联密度减少和裂解水凝胶,导致物理性能的变化,包括刚度、含水量、扩散系数,或完全侵蚀,甚至在细胞的存在150年]。这个局部软化相比,光的存在产生额外的交联后暴露于紫外线,提供当地加劲[151年]。

除了light-patterning外,其他方法已经申请调优水凝胶的刚度通过使用的组合pH-sensitive聚(2 - (diisopropylamino)甲基丙烯酸乙酯)(PDPA)和生物相容性的聚(2 -乙基磷酰胆碱(methacryloyloxy)) (PMPC) [152年]。仔细调整pH值,水凝胶膜弹性可以可逆地调制允许硬化或软化的物质和时间动态操纵细胞粘附/分离[152年]。这个可逆可调刚度也可以达到在cell-laden基于超分子水凝胶“主-客体”互动。在这个报道方法,刚度是被共价和可逆的主客体之间的相互作用吊坠“主人”主题,它们存在于主水凝胶网络和可溶性聚合物。因此,当这些可溶性聚合物添加额外的物理交联形成的水凝胶交联密度增加,弹性模量(153年]。水凝胶可以动态地加入了使用酶反应,在与其他氨基酸残基的肽连接器容易创建一个特定的酶catalyzation。酶接触后,实现一个特定的二聚体的形成导致额外的交联,最后加强cell-laden水凝胶(154年]。

因此,基于这些技术,机械特性的时空模式是直接到达。通过控制刚度矩阵,邻近组织的生长,因此机械约束在活的有机体内可以模仿瀑样的微环境(155年]。

4.2。生物工程方法成形素扩散的时空控制

形态因子分子能够协调器官生长和模式,建立分级浓度分布和剂量依赖性的方式引出不同的细胞反应。他们可以是cytoplasmatic蛋白质,能促进细胞内的扩散梯度,或分泌的信号分子156年]。这些信号分子的梯度似乎直接组织模式在胚胎发生(157年,158年]。特定结构的形成可以通过梯度诱导产生的信号分子邻近细胞,导致微分基因表达,组织模式和形态发生159年]。在体外,各种形态因子,包括小分子、生长因子和激素,用于调节细胞命运在瀑样。此外,生物工程领域的进展允许的时空控制成形素梯度在瀑样做可以指导正确的形态发生。

正如上面已经提到的,light-mediated模式方法现在还一个有前途的应用程序来控制地貌成因的信号在空间和时间。生物分子中引入水凝胶在所需的位置,保护可光降解的一半(160年,161年]。在适当的时机,导致一个特定的曝光photo-releasing生物分子。超越了空间和时间交付控制,对于给定的曝光,释放的生物分子可以预测161年]。此外,使用微流体系统或微/纳米粒子允许一个有效的时空形态梯度的控制。光刻技术可用于生产渠道内创建功能微流体结构水凝胶。鉴于巩膜的水动力特性,在生物分子的初始均匀分布在渠道,形成浓度梯度,通过调整流量。交付的支架内的生物分子可以改变随着时间的推移,这些分子的时间调制可以实现在整个网络空间统一的方式(162年]。这些微流控设备已经成功地用于调节神经管模式在体外。Uzel等人报道微流体设计创建正交线性梯度在3 d cell-embedded脚手架163年]。作者报告设备用于生成渐变的视黄酸(RA)和凹陷,声波刺猬的受体激动剂(嘘)[164年),在三维胶原水凝胶与鼠标ESC-derived总量(163年]。自从RA caudalizing影响神经上皮和嘘分泌最腹侧的部分神经管(165年,166年),这两个的组合效应形态因子指定祖细胞进入尾和腹侧身份导致随后的腹侧脊髓神经元形成(163年]。类似的方法也被Demers等。除了RA和嘘信号,他们引入了BMP4梯度在微流体装置能够模仿神经上皮的背模式(167年]。在神经分化,dorsal-ventral身份是通过建立反对嘘和BMP的梯度,而正交交付的RA梯度允许代rostral-caudal轴(167年]。这两个不同的研究展示了生成的能力暂时控制成形素梯度,使空间模式在干细胞的三维结构。

因此,使用微流体可以提供transorganoid成形素梯度,以及生物分子的固定化生物材料空间控制(168年]。事实上,生物分子的直接集成到支架允许操纵细胞附着,移民,和命运,但是当结合运载工具,如微/纳米颗粒生物分子的控释是可能的,允许的生成空间梯度(169年]。马奥尼和萨尔兹曼是第一个组装细胞的控释高分子微粒与可编程合成细胞外微环境发展组织(170年]。这种技术后来被用于促进内部形态因子的控释瀑样(171年]。内含有RA,降解PLGA微球结合ESC-derived总量达到控制成形素表示和囊性球体形成(171年]。生成一个有效的细胞分化和形态发生的结构类似于早期小鼠胚胎(E6.75),和一个外部内脏内胚层包络epiblast-like层,是证明171年]。此外,微粒子的结合,呈现不同的动态版本允许控制和顺序成形素表示,因此预先确定交货时间进程和完成一个有效的诱导172年]。这些方法代表了一种通用的工具来创建成形素梯度提供一个准确的时空调控,能够诱导对称打破正确的瀑样形态发生的必要条件。

5。扩大瀑样的一代

之外的其他参数,生化信号和ECM的物理属性,应考虑瀑样一代,包括足够的营养和氧气供应。瀑样大小的增加而生成的结构的复杂性,它的范围可以从200年μm[4毫米14]。大瀑样通常呈现扩散限制很难模仿一些发育特性(173年]。基于物理的扩散、细胞密度、和低氧的代谢消耗报告率范围,脑瀑样可以达到最大直径1.4毫米没有呈现中央坏死(174年]。然而,预测直径仅基于低代谢活动出现在瀑样,由于自发的神经活动是罕见的(174年]。使用一个动态系统,像一个旋转生物反应器,能够支持瀑样增长是由于一个高效的运输营养物质和氧气扩散,允许维护大型瀑样,约4毫米,有效地概括大脑结构(3]。事实上,生物反应器主要用于扩大和区分已经向中胚层,内胚层的,和外胚层的血统,没有细胞结构安排在3 d聚合干细胞(175年- - - - - -179年]。瀑样代使用生物反应器的协议通常涉及最初承诺在静态条件下,进一步的嵌入瀑样在水凝胶,其次是瀑样转移到生物反应器(3,180年- - - - - -182年]。这种方法限制了潜在的扩大和瀑样文化的应用高通量药物发现和毒理学研究过程。最近,报道一个新的平台,允许通过使用人工基底膜核心电子喷雾,胶囊生产的胶囊和微环境支持和瀑样强劲增长通过包裹着一层海藻酸壳的生成,保护cell-Matrigel核心(183年]。然而,规模总量控制的产生和进一步分化成组织瀑样使用生物反应器,在一个持续的过程,仍然是一个挑战。此外,生物反应器设计如何影响的组织和形态发生瀑样仍知之甚少。

6。结论和未来的挑战

已经被证明思想的强大的自组织能力在体外代不同的迷你organ-like结构,只有通过提供一些重要的线索。因此,在体外形态发生重演可以为再生医学提供重要的见解,疾病药物筛选模型,应用程序。然而,控制的器官发生会产生nonconsistent瀑样变量解剖学和细胞成分,一些细胞类型,以及功能特性,可能会丢失。工程方法论指导瀑样组织的应用程序允许更好地模仿人类的形态发生。在本文中,我们专注于不同的生物工程方法实现高水平的细胞组织内PSC-derived瀑样,通过控制初始细胞位置,时空的细胞阶段,生成组织的重构。

3 d的重演人体组织更好地理解生物系统提供了机会,是一个必要的可靠瀑样的分析,结构和功能的完整描述。然而,只有少数方法允许表型的鉴定和形态发生在不破坏3 d瀑样的组织,通过使用先进的显微镜方法。例如,使用一个结算方法,可以减少组织的散射和结构变得更加透明,加强深光渗透到深层结构的组织和成像(184年]。事实上,随着纸张显微镜、三维图像是通过扫描plane-by-plane示例生成的,允许更深的可视化与高时空分辨率(组织185年]。除了成像技术,可靠的方法来评估功能生成的3 d结构发展。例如,电生理学是用来描述心肌细胞和神经元的功能,因为它们是电激。然而,这些技术只允许使用单个细胞单层(膜片箝)和(微电极阵列)。一些适应了记录生理参数的三维结构。为了评估功能生成的神经元网络在一个完整的系统中,膜片钳在瀑样部分已经完成(139年,186年]。然而,更好的方法来评估整个瀑样的功能性质是必要的。

除了描述挑战瀑样的功能和结构的评估,我们从已经生成瀑样的能力也受到一些限制(187年]。首先,需要产生大量的瀑样使用在高吞吐量的应用程序,以及大瀑样需要更好地概括人体组织解剖学。其次,由于PSC-derived瀑样倾向于人类胚胎发育的组织,也有需要提高的功能生成的组织为了生产更多成熟的瀑样。试图克服这些挑战,和瀑样仍有巨大的潜力用于生物和治疗方法的研究,旨在更好地了解人类发展与疾病表现和对有效治疗一些疾病提供重要的见解。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

确认

t席尔瓦和J.P. Cotovio承认FundaCao para Ciencia e Tecnologia (FCT;葡萄牙,http://www.fct.pt)通过个人对金融支持赠款:SFRH / BD / 105773/2014和PD / BD135500/2018,分别。资金也收到FCT通过格兰特:UID /生物/ 04565/2013。收到资金从项目得到菲德尔(葡京2020 -下Operacional地区de葡京葡萄牙2020)并通过葡京格兰特PAC-PRECISE FCT - 01 - 0145 -菲德尔- 016394和CEREBEX代小脑共济失调研究瀑样葡京格兰特- 01 - 0145 -菲德尔- 029298。资金也来自欧盟的地平线2020研究和创新计划,根据授权协议号码739572 -发现再生和精密医学中心h2020 -广泛- 01 - 2016 - 2017。

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