锶能促进人类胎盘蜕膜下橄榄的增殖和成骨分化和骨骨髓来源msc剂量依赖性的方式

文摘

间充质基质细胞的成骨的潜力(msc)组织来源的不同而不同。锶可以提高骨骨髓来源的成骨分化msc (BM-MSCs),但它是否产生类似的影响胎盘蜕膜basalis-derived msc (PDB-MSCs)仍然是未知的。在这里,我们比较了锶的增殖和成骨分化的影响人类的PDB和BM-MSCs在体外。我们发现1毫米,10毫米锶,但不是0.1毫米锶,明显促进了人类PDB和BM-MSCs的扩散。这些剂量的锶显示类似的碱性磷酸酶活性在两种类型的细胞,但其成骨基因表达式以剂量依赖性的方式得到晋升。锶剂量的0.1毫米和1毫米PDB-MSCs几个成骨基因表达升高,但不是那些BM-MSCs处于初期阶段。然而,他们未能提高矿化的细胞类型。相比之下,10毫米锶促进成骨的基因表达以及人类PDB的矿化和BM-MSCs。总的来说,这项研究表明,人类PDB和BM-MSCs共享相似锶,促进其增殖和成骨分化剂量依赖性的方式。

1。介绍

大骨缺陷,造成创伤、感染、先天性疾病,仍然是一个巨大的挑战在诊所。间充质基质细胞(msc)呈贴壁细胞具有自我更新能力和multipotency。他们被认为是有前途的骨再生的种子细胞,主要是由于其成骨的潜力和旁分泌作用[1,2]。目前,骨髓代表msc对临床研究的主要来源。大量的动物实验和一些临床试验表明,来源于msc (BM-MSCs)改善骨的骨再生(2,3]。然而,几个缺点阻碍了广泛的临床应用。例如,BM-MSCs需要侵入性程序的隔离,BM-MSCs的增殖和分化能力下降与供体年龄(4,5]。因此,许多研究试图探索其他来源的msc骨再生。

msc的人类胎盘是一个有吸引力的来源,因为非侵入性组织收集、缺乏道德问题,细胞收获率高、健壮的细胞增殖能力(6]。msc与胎盘的不同部分,包括绒毛膜、羊膜膜,和蜕膜下橄榄7- - - - - -10]。他们可以进行成骨分化在传统培养成骨的媒介或刺激成骨生长因子(例如,骨形态发生蛋白)在体外(11]。当嫁接结合论述支架,它们能够形成骨组织在异位网站(12,13]。明显,他们也增强骨再生移植后骨缺陷(14,15]。然而,一些研究表明,placenta-derived msc的成骨潜能的不如BM-MSCs [16- - - - - -18),强调发展的需要有效的策略来提高细胞的成骨的承诺。

锶是一种微量元素在自然骨组织,双对骨代谢的影响。它能增强osteoprogenitor细胞的增殖,抑制破骨细胞的分化终端(19]。考虑锶的化学稳定性和较低的成本,已经进行了很多努力在发展中strontium-modified支架加强骨修复结合msc (20.,21]。众所周知,锶能促进成骨细胞的成骨分化,BM-MSCs源自啮齿动物物种(22- - - - - -28]。然而,较少的研究已经确定了锶对msc的影响来源于人体组织(29日- - - - - -32),尤其是来自围产期组织。杨等人报道的增强成骨的响应人类脐cord-derived msc刺激锶(32),但锶对msc的影响来自其他人类围产期组织,如蜕膜下橄榄、还没有被调查。

自组织起源深刻影响msc的生物学性质,包括它们的增殖能力和分化潜能(16- - - - - -18,33),它是合理的假设人类BM-MSCs和胎盘蜕膜basalis-derived msc对锶刺激(PDB-MSCs)可能有不同的反应。在这项研究中,我们首先确定合适的治疗剂量的细胞类型和锶然后比较锶对其成骨分化的影响在体外,目标是为潜在的应用提供有价值的信息的锶MSC-based骨再生。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离

本研究中国西部医院的伦理委员会批准,四川大学。人类胎盘获得从四个健康献血者(年龄从25到33)知情同意。我们的以前的报告中描述PDB-MSCs被孤立7]。简单地说,从胎盘蜕膜是解剖,在磷酸盐(PBS)洗,碎成小块组织,并与0.25%胰蛋白酶消化(美国Gibco)和0.1%胶原酶IV(美国表达载体)。离心后,有核细胞resuspended和培养生长介质包含杜尔贝科的修改鹰中葡萄糖(美国Gibco), 10%胎牛血清(美国HyClone),和1%的青霉素和链霉素(美国Gibco)。经济增长中每3天了。当细胞融合达到70 - 80%,他们收集了0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA);美国Sigma-Aldrich)治疗和通道的稀释1:3。细胞从每个捐赠者的4通道被汇集在一起,和一个额外的混合细胞培养1 - 3通道为进一步在后续研究中使用。

人类骨髓样本获得从一个健康女性捐赠者脊柱侧凸患者(25岁)和三(一个女性捐赠者和两个男性捐赠者,年龄从15到18)知情同意。BM-MSCs分离根据我们之前描述(34]。简而言之,骨髓送气与PBS稀释、分层聚蔗糖溶液(TBD科学,中国),和离心机在500 g 30分钟收集单核细胞从梯度界面。然后,单核细胞在生长培养基培养,后改为移除不依从细胞72小时的文化。当细胞融合达到70 - 80%,他们通过的比率1:3。从每个供体细胞通道4被汇集在一起,和混合细胞亚文化额外的通道。细胞在第五届7通道被用于以下实验。

2.2。细胞特性

multilineage分化潜力的人类BM-MSCs PDB-MSCs据我们之前报道了(7,34]。简单地说,细胞被播种密度 。成骨分化,细胞培养的成骨的介质包含生长介质,50 mg / L L-ascorbic acid-2-phosphate(美国Sigma-Aldrich) 10⁷M地塞米松(美国Sigma-Aldrich)和10毫米β甘油磷酸酯(美国Sigma-Aldrich)。成骨的介质是改变每3天。诱导后21天,样品固定在75%乙醇和沾1%茜素红溶液(美国Sigma-Aldrich) 30分钟37°C。

脂肪形成的分化,细胞培养的脂肪形成的中包含生长介质,0.25μM地塞米松(美国Sigma-Aldrich) 10μ0.5 M胰岛素(美国Sigma-Aldrich)μM isobutyl-methylxanthine(美国Sigma-Aldrich)和50μ吲哚美辛(美国Sigma-Aldrich)。脂肪形成的介质是改变每3天。感应15天后,样本与10%福尔马林固定和沾油红O解决方案(美国Sigma-Aldrich) 45分钟检测脂滴在细胞质中。

chondrogenic分化,细胞培养在chondrogenic中包含生长介质,100 mg / L丙酮酸钠(美国Sigma-Aldrich) 10μg / L转化生长因子-β1(研发系统、美国)、100 mg / L ascorbate-2-phosphate(美国Sigma-Aldrich), 1% insulin-transferrin-selenium(美国Gibco)和0.1μM地塞米松(美国Sigma-Aldrich)。每3天chondrogenic介质被改变。感应14天后,样本与阿尔新蓝染色8 gx (Cyagen生物科学,中国)30分钟观察粘多糖沉积。组织学染色后,所有的样品都是由相差显微镜观察和拍摄(日本奥林巴斯公司)。

2.3。细胞增殖

BM -和PDB-MSCs生长介质或生长培养基中培养与不同浓度的SrCl补充₂h·6₂分别为O (Kelong,中国)。生长培养基中培养的细胞作为对照组。短暂,细胞被播种的密度在96 - 3000细胞/板。细胞增殖是不断地监控使用alamarBlue®细胞生存能力试剂(美国表达载体)1天,3和7。在每个计算,这些细胞被冲洗与PBS然后孵化100μL工作解决方案按照制造商的指示准备4 h 37°C。最后,使用板吸光度是记录读者(570纳米分子器件、美国),使用600 nm波长作为参考。

2.4。生活/死染色

人类BM-MSCs被播种密度的5000细胞/厘米²12-well盘子和培养的生长介质或锶的生长培养基补充剂量的0.1毫米,1毫米,分别和10毫米。1天3和7,生活/死®细胞生存能力分析工具包(美国英杰公司)是用于监测细胞的可行性。样品( 为每个组)和PBS轻轻洗了两次,然后在30分钟的工作解决方案孵化37°C。倒置荧光显微镜观察细胞生存能力的(日本奥林巴斯公司)。

2.5。细胞凋亡分析

人类BM-MSCs被播种密度的5000细胞/厘米²在25厘米²培养瓶和生长培养基中培养或不同剂量的生长培养基补充锶(0.1毫米,1毫米,10毫米)为3天,分别。生长培养基中培养的细胞作为对照组。细胞培养后,细胞收获细胞凋亡检测(膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备,Beyotime生物技术研究所、中国)根据制造商的指示,和样本分析使用流式细胞仪(美国BD生物科学FACSAria II)。

2.6。碱性磷酸酶(ALP)活性测定

人类BM -和PDB-MSCs被播种密度的5000细胞/厘米²在生长介质或成骨培养基培养和添加不同剂量的锶(0.1毫米,1毫米,10毫米),分别。细胞培养生长介质或成骨的媒介作为对照组,分别。经过7天的文化,高山活动的细胞( 为每个组)测量使用一个高山分析工具包(距建成生物工程研究所,中国)。简单地说,0.25%的细胞分离胰蛋白酶/ EDTA, resuspended在去离子的H₂O (100μ信用证样本),细胞溶解由三个冻融循环。然后,细胞溶解产物的高山活动决心根据制造商的指示。405纳米的吸光度是由一个盘子的读者阅读(美国分子设备)。高山活动结果归一化总蛋白的数量,这是量化使用BCA蛋白质分析工具包(美国Bio-Rad)。

2.7。高山染色

人类BM -和PDB-MSCs被播种密度的5000细胞/厘米²和培养不同剂量的锶(0.1毫米,1毫米,10毫米)补充生长介质或成骨的介质,分别。细胞培养生长介质或成骨的媒介作为对照组,分别。经过7天的文化,高山活动的细胞( 观察每组)使用一个高山染色工具包(美国Sigma-Aldrich)。短暂,细胞被固定在4%磷酸盐多聚甲醛在室温下30分钟,用自来水洗,沾一个高山染色设备根据制造商的指示,最后使用显微镜观察(日本奥林巴斯公司)。

2.8。实时聚合酶链反应(rt - pcr)

人类BM -和PDB-MSCs被播种密度的5000细胞/厘米²SrCl和培养不同剂量₂h·6₂O(0.1毫米,1毫米,10毫米)补充生长介质或成骨的介质,分别。细胞培养生长介质或成骨的媒介作为对照组,分别。文化后3、7、14天,总RNA ( 为每个组)提取使用RNAiso +试剂(豆类生物、日本)然后reverse-transcribed cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类生物、日本)。基因表达是量化使用SYBR预混料交货Taq II工具包(豆类生物、日本)iQ5实时系统(美国Bio-Rad)。成骨基因的引物和管家基因,包括runt-related转录因子2(Runx2),骨钙素(OC),osteoprotegerin(功能),骨桥蛋白(OPN),glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GADPH),列出如下:Runx 2:反向primer-GGGTAAGACTGGTCATAGGACC primer-CCCAGTATGAGAGTAGGTGTCC向前;OC:反向primer-TCCTGAAAGCCGATGTGGTC primer-GAGGGCAGCGAGGTAGTGAA向前;OPN:反向primer-CCTGACTATCAATCACATCGGAAT primer-TGACCAGAGTGCTGAAACCCA向前;功能:反向primer-CAGCAAACCTGAAGAATGCCTCC primer-GGTCTCCTGCTAACTCAGAAAGG向前;和GAPDH:反向primer-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT primer-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC向前。GADPH担任管家基因。2目标基因表达进行了分析^{- - - - - -△△Ct}方法。结果表示相对于对照组的基因表达水平。

2.9。矿化分析

人类BM -和PDB-MSCs被播种密度的5000细胞/厘米²6-well板块和培养的成骨的介质不同剂量的补充锶(0.1毫米,1毫米,10毫米)21天,分别。在成骨细胞培养介质作为对照组。感应后,样品( 为每个组)与茜素红染色如上所述,严重可视化。

2.10。统计分析

数据被表示为 (SD)。单向方差分析之后,丹尼特的多重比较检验进行统计测试使用GraphPad棱镜软件(GraphPad软件有限公司、美国),和 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。锶增强BM - PDB-MSCs扩散

人类的BM -和PDB-MSCs之前调查他们对锶的刺激的反应。类似于我们的先前的报道(7,34),这两种细胞显示fibroblastic-like形态,具有成骨的脂肪形成的,chondrogenic分化潜能在体外(图1)。chondrogenic感应后,有趣的是,BM -和PDB-MSCs阿尔新蓝染色阳性,但有一个明显的区别:在BM-MSCs一张多层细胞观察,而PDB-MSCs形成细胞结节。这个结果表明组织origin-dependent msc的chondrogenic潜力的变化,已由其他研究小组报道(35]。

确定适当的剂量的锶,细胞类型都是培养与不同浓度的锶(0.01毫米、0.1毫米、0.5毫米,1毫米,5毫米,10毫米,和20毫米)。细胞增殖是评估1天,3和7。如图2(一个)锶,剂量的0.01毫米,0.5毫米,1毫米,5毫米,10毫米,促进BM-MSCs的增长,而20毫米锶抑制了复制。PDB-MSCs,细胞治疗的增长率0.01毫米,0.1毫米,0.5毫米锶与通用汽车集团在所有时间点。1毫米,5毫米,10毫米锶提拔的扩散PDB-MSCs 7天,而20毫米锶表现出明显的抑制作用(图3天至7天2 (b))。

进一步证实了细胞毒性的影响对人类BM-MSCs锶,生活/死染色和细胞凋亡进行了分析。如图3(一个)细胞显示良好的可行性(绿色荧光)1天,3和7,很少死细胞(红色荧光)观察每组中。同样,细胞凋亡测定的结果显示类似的细胞生存能力在0.1毫米,1毫米,10毫米锶组当与通用汽车集团(图进行比较3 (b))。

考虑到绝经后妇女的平均血清中锶浓度口服2克/天ranelate锶是0.117毫米36),并将这些信息与上述结果,因此我们选择了0.1毫米,1毫米,10毫米锶在随后的实验调查的BM -锶和PDB-MSCs成骨的影响。

3.2。促进了BM的成骨分化,锶PDB-MSCs生长介质

确定是否促进了人类的成骨分化锶BM - PDB-MSCs没有任何其他可溶性成骨的因素,这两种细胞在生长培养基培养补充锶的不同剂量。然后,测量细胞的成骨分化,包括高山活动与成骨的基因表达。

如图4(一),只有少数细胞的高山染色阳性细胞经过7天的文化,也没有明显的所有组在每个细胞类型之间的差异。因此,锶的高山活动组(0.1毫米,1毫米,10毫米)相当的通用汽车集团( ,图4 (b))。然而,当与BM-MSCs的高山染色,弱很多的染色结果被发现后PDB-MSCs对待同一浓度锶(图4(一))。

成骨细胞的基因表达在3天,7和14个,包括的表达Runx2,OC,OPN,功能,如图4 (c)。BM-MSCs、0.1毫米和1毫米锶演示了一个类似的基因表达水平与通用组相比,虽然10毫米锶的表达显著增强OC,OPN,功能在3天,7日和14日的表达Runx2在第三天。PDB-MSCs、0.1毫米和1毫米锶的表达升高Runx2在3天的表达OC在7天。此外,10毫米锶增强的表现OPN和功能在14天。

总之,这些结果表明,即使没有任何其他可溶性成骨的因素,促进了锶成骨分化的细胞剂量依赖性的方式。

3.3。促进了BM的成骨分化,锶PDB-MSCs成骨的媒介

我们下决定是否提高了锶的BM - PDB-MSCs成骨分化成骨的微环境在体外。两个细胞培养的成骨的介质不同剂量的补充锶。细胞的成骨分化是由高山活动7天,成骨基因的表达3天,7和14,最后在21天的细胞外基质矿化。

如图5(一个),两个细胞阳性高山成骨诱导后染色,但是没有明显的所有组在每个细胞类型之间的差异。同样,锶的高山活动组(0.1毫米,1毫米,10毫米)相当的成骨的介质(OST)集团在7天( ,图5 (b))。当比较有趣的是,BM-MSCs显示更强的染色结果与PDB-MSCs与相同浓度的锶治疗后(图5(一个))。

如图5 (c)、锶促进成骨细胞类型的基因表达方式存在剂量依赖的相关性。BM-MSCs、0.1毫米和1毫米锶显示类似成骨的基因表达水平的OST集团在10毫米锶增强的表现Runx2在7天的表达OC天3、7和14日的表达OPN天3和7,的表达功能天7和14。

PDB-MSCs, 0.1毫米锶的表达升高OPN天7和14;1毫米锶增强的表现OC7天;,值得注意的是,10毫米锶增强成骨基因表达式超过0.1毫米和1毫米组织,促进的表达OC在天7和14日的表达OPN7天,的表达功能天3、7和14(图5 (c))。

观察细胞的矿化茜素红染色(图5 (d))。与OST组相比,0.1毫米和1毫米显示类似的锶矿化在这两种类型的细胞,而10毫米锶明显提高了矿化。

综上所述,上述结果清楚地表明,锶能有效促进成骨分化BM -和PDB-MSCs在传统成骨的归纳在体外。

4所示。讨论

PDB-MSCs多功能而且容易获得,因此存在一个潜在的骨修复的细胞来源。然而,msc的成骨潜能来源于胎盘组织已被证明是劣质的BM-MSCs [16- - - - - -18),这意味着需要有效的成骨的感应。作为自然人体骨组织,微量元素锶显着地提高骨再生,主要通过刺激成骨分化BM-MSCs而抑制破骨细胞的分化19]。在这项研究中,我们发现锶促进PDB-MSCs的增殖和成骨分化,共享一个相似BM-MSCs的反应。据我们所知,这是第一个研究调查的影响锶PDB-MSCs增殖和成骨分化的在体外。

根据我们的结果,锶对人类PDB-MSCs对扩散的影响,存在剂量依赖的相关性也是人类BM-MSCs中观察到。同样,在其他MSC文化,如鼠BM-MSCs [26)和人类脂肪tissue-derived msc (37),锶还产生剂量依赖性的扩散效应。在这项研究中,我们发现,20毫米锶抑制的复制PDB BM-MSCs,虽然1毫米,5毫米,10毫米锶宣传他们的扩散。已报告在文献中,不同的结果对锶的细胞毒性效应对人类BM-MSCs [29日- - - - - -31日和成骨细胞38,39]。例如,它发现锶浓度的1毫米以上大大减少人类BM-MSCs[的可行性30.]。然而,1毫米锶还报道来提高人类的扩散BM-MSCs由另一个研究小组(31日];此外,它是确定210.7μg / mL锶(即。,2。4 mM) did not inhibit the proliferation of human BM-MSCs [29日]。这些差异与锶细胞毒性可能部分由于以下原因:首先,人类BM-MSCs源自不同的捐赠者对锶的刺激的反应不同31日]。其次,实验条件,包括细胞培养基,细胞通道,和方法用于检测细胞毒性,研究[大大不同的29日- - - - - -31日]。考虑到这一点,很难直接进行比较;相反,上述差异突出实验细胞的需要确定合适的浓度。

与高浓度的锶的proproliferation效果(1毫米,5毫米,10毫米)在BM PDB-MSCs,他们以不同的方式回应一些低浓度的锶。例如,0.01毫米和0.5毫米锶增加人类的生长动力学BM-MSCs PDB-MSCs但不是。复制的细胞类型特异的效果这锶体细胞也观察到其他研究人员(40),然而,不同细胞反应机制在很大程度上仍是个未知数,需要进一步的研究。

关于锶对msc的成骨的影响,据报道,适当浓度的促进成骨分化的啮齿动物BM-MSCs[锶26- - - - - -28),以及msc来源于人体组织,如骨髓(29日- - - - - -31日),脐带(32,脂肪组织(41]。在这项研究中,我们调查了,第一次对人类PDB-MSCs锶的成骨的影响,并发现10毫米锶,但不是0.1毫米或1毫米锶,提升他们的成骨分化,这将提供一个简单的方法来刺激成骨的潜在的PDB-MSCs骨再生。

然而,我们应该承认这项工作有一定的局限性。首先,msc的来自四个捐助者,但不是从每个供体细胞复制,用于实验。尽管这使得msc来源于两个不同组织的比较简单和直接,它未能发现donor-dependent每个细胞类型的反应的变化,这对未来的临床应用是很重要的。第二,本研究中使用的中间段落。众所周知,MSC-based疗法需要大量的细胞,和msc在通道3 - 7通常用作移植细胞在诊所42];因此,我们使用两种类型的细胞5 - 7在这项研究中,通过相关的诊所。然而,应该指出的是,人类的分化潜能msc与增加通道(数量下降43),因此,提出进一步的研究来确定适当的细胞通过对锶的刺激。最后但并非最不重要,机制强调人类PDB-MSCs锶的成骨的影响仍然未知。据报道,增强成骨分化的msc锶通过不同的细胞信号通路,比如Ras / MAPK通路(28),Wnt /β连环蛋白通路(32),和MAPK / ERK通路(44]。然而,目前还不清楚是否这些信号通路参与PDB-MSCs锶治疗的成骨分化,因此还需要进一步的研究来理解目标的途径。

基于上述研究,显然表明10毫米锶,而不是0.1毫米和1毫米锶,明显促进增殖和成骨的血统人类PDB和BM-MSCs的承诺。考虑锶的剂量依赖性效应在人类msc的增殖和分化,值得注意的是确定适当的离子释放的strontium-containing骨支架在使用这些制造组织工程骨移植msc。

5。结论

总之,锶提升人类PDB的增殖和成骨分化,BM-MSCs剂量依赖性的方式。在低剂量的锶(0.1毫米和1毫米),成骨基因表达的PDB-MSCs BM-MSCs略有不同,但两个细胞的矿化类型没有增强。相比之下,它们共享一个伟大的相似反应相对高剂量的锶(10毫米),促进其增殖和成骨分化。这个剂量依赖性的影响锶时应考虑结合锶和人类msc对骨再生。

缩写

高山:	碱性磷酸酶
BM-MSCs:	骨骨髓来源间充质基质细胞
GADPH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
通用汽车:	生长培养基
OC:	骨钙素
OST:	成骨的媒介
功能:	Osteoprotegerin
OPN:	骨桥蛋白
PDB-MSCs:	胎盘蜕膜basalis-derived间充质基质细胞
Runx2:	Runt-related转录因子2。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金资助(批准号。31570970,31570970,81702171),天津研究项目的应用基础和先进的技术(批准号14 jcqnjc03100),深圳双链项目支持的创新和开发行业工业和信息化局深圳(批准号201806081018272960),卓越的1.3.5工程学科,四川大学华西医院(批准号ZYJC18002),科研基础开始医生来自井冈山大学(批准号JZB15013)。

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