骨髓源性细胞疗法治疗长骨不连:系统回顾和荟萃分析——哪一种是最好的治疗方法?

摘要

undunions代表了基于干细胞的疗法的临床环境的主要适应症之一。该研究的目的是系统地评估骨髓衍生的细胞的疗效的目前的证据，这些方法与骨支架治疗非骨头的骨支架。我们搜索了Medline（Pubmed）和2019年7月，临床研究专注于使用细胞疗法和骨髓衍生物治疗骨不源性的临床研究。三家调查员独立提取数据并评估偏见的风险。我们分析了27项研究，包括暴露于四种干预措施的347名参与者的总数：骨髓浓缩物（BMAC），BMAC与支架（BMAC /支架）相结合，骨髓衍生的间充质基质细胞（BMSCs）和BMSC与支架组合（BMSC /脚手架）。两个受控研究表明，骨愈合的正趋势，有利于BMAC /支架或BMSC /支架处理对骨自体移植物，但差异没有统计学意义（RR 0.11,95％CI -0.05; 0.28）。单一队列研究中，据报道了BMAC（77％; 95％CI 63％-89％; 107例，据报道了愈合率的最高均值比例 ）BMAC/支架治疗(71%;95%可信区间50% - -89%;117例, ）在6个月的后续行动。在12个月的随访中，在所有治疗组中观察到骨愈合的增加，范围为81％至100％。这些结果表明，BMAC或BMAC /脚手架可能被认为是治疗非愈合率在中期随访时具有成功愈合率的主要选择。此外，这种荟萃分析突出显示脚手架的存在积极地影响愈合率在长期随访中。仍然需要更多案例对照研究以支持对自体移植的基于细胞的疗法的临床改善，现在被认为是治疗不unonions的金标准。

1.介绍

骨不连和延迟愈合是骨折愈合中常见的情况，仅在美国，其发生率超过骨折总数量的5-10% [1］．根据定义，如果骨折在4个月内没有愈合，可以认为是延迟愈合。长骨骨折(主要是股骨、胫骨和肱骨)定义为损伤后6个月无任何影像学进展持续至少3个月的骨不连[2，3.］．骨折愈合不良是由多种因素造成的，包括与骨折部位相关的患者独立因素、损伤的严重程度(间隙大)、血管化受损、手术成骨、感染、骨折稳定性和生物力学，以及患者依赖的因素，如年龄、营养、药物治疗、合并症或先天性骨病[4，5］．骨不连的诊断主要基于临床评价和影像学检查。体格检查评估骨折部位的活动、畸形、软组织内插和感染迹象[6，7］．x光片用于确定骨折愈合的进展(即持续骨折线、骨桥接缺失和组织硬化)和是否存在畸形[6］．放射学上，骨不连可区分为肥厚性和萎缩性。肥厚性骨不连的特点是骨折间隙处有大而宽的骨痂，骨桥接处有透光区。另一方面，在大多数情况下，萎缩性骨不连是骨愈合生物支持受损的表现，这可能依赖于受损的血管供应，以及骨膜和内膜的破坏。随后，由于缺乏重要的生物介质和/或适当的血液供应，愈合过程受损。机械原因也可能涉及其中。例如，过度刚性的固定、压缩力不足和不允许骨桥的宽骨折间隙是发生萎缩性骨不连的主要决定因素。影像学上，萎缩性骨不连表现为骨痂组织缺失，骨端狭窄，骨折间隙有大片透光区[3.］．由于所有这些原因，萎缩性骨不连是最具挑战性的病例。事实上，萎缩性骨不连往往需要外科手术来减少异常的机械因素，并通过植骨来修复骨折间隙，这是治疗的金标准[8］．

由于自体移植物和同种异体移植物都有内在的局限性，例如可收集自体骨的体积和患者发病率，或免疫排斥反应和疾病传播的风险，骨修复转化医学中orthobiologics的使用正在上升[8］．事实上，骨愈合的正生物制剂实现了结合骨传导、骨诱导和成骨的“钻石概念”，因此，作为治疗非愈合骨折，特别是萎缩性骨不连的一种有前途的策略[9］．在骨愈合的骨生物学方法中，基于细胞的治疗和骨髓衍生物与骨移植物和生物材料联合或不联合的研究近年来得到了广泛的研究[10］．

在骨科中，骨髓是成人间充质基质细胞最常用的来源，髂骨抽吸是一种标准的方法，且发病率有限。骨髓既可直接作为骨髓浓缩物(BMAC)，也可作为骨髓源性间充质基质细胞(BMSCs)在体外加工。BMAC的优点是使用Ce标记试剂盒和离心机的术中制剂，并遵守一步手术，其成本有限[3.］．尽管有这些益处，但与具有明确定义特征的纯细胞群的膨胀BMSC相比，BMAC仅针对小祖细胞（0.001％至0.01％）的小群体账户。然而，在临床环境中，BMSC的可通平性仍然受到一些缺点的限制，例如需要使用柔顺的生长因子和试剂以及所需的广泛时间框架在体外与BMAC相比，这意味着更高的操作复杂性和更高的成本。

本文系统综述了有关使用骨髓衍生物治疗骨不连的临床研究。特别地，我们的目的是评估关于自体骨移植的细胞为基础的治疗效果。此外，我们分析了BMAC、BMSC单独或联合支架治疗后6个月和12个月的愈合比例。本荟萃分析的目的是增加对促进骨愈合可用选项的认识，并为临床医生提供一种工具，他们计划使用基于细胞的策略来改善骨不愈合患者的临床结果。

2.材料和方法

2．1.搜索策略

文献检索集中在临床使用骨髓来源的细胞治疗骨不连。查阅MEDLINE (PubMed)和Cochrane Central Register of Controlled Trials-CENTRAL数据库进行了文献搜索，分析了截至2019年7月发表的英文文章。我们还检查了所有系统综述的参考列表，并纳入了搜索过程中确定的研究。完整的搜索策略报告在附录中S1在补充材料中。

２.２.meta分析的资格标准

本荟萃分析定义了纳入标准。具体来说，我们纳入了观察性研究，如病例报告/研究和前瞻性和回顾性临床研究，有或没有对照组(自体骨移植)。从这些研究中，我们推断出单独使用BMAC或BMSC或联合支架治疗的长骨不愈合患者的相关数据，这些患者超过18年且没有相关的合并症(如先天性骨疾病、肿瘤、糖尿病和骨感染)。与满足纳入标准并在应用细胞治疗前成功治疗的感染性骨不连患者相关的数据被纳入本荟萃分析。

2.3。学习选择

三位研究者(SL, SP, ABL)分别对文献进行了独立的综述，并根据标题和摘要对文献进行了分类。通过现有全文进一步筛选符合条件的文章，并选择符合纳入标准的研究。当检索已发布数据的副本时，我们只考虑报告完整数据集的数据集。任何分歧都通过讨论解决。如果一项临床研究既包括满足资格标准的患者，又包括不满足一项或多项纳入标准的患者，则与后者相关的结果数据将被排除在分析之外。研究报告的结果数据与合并结果的合格和不合格患者完全被排除。例如，包括延迟愈合患者和骨不愈合患者的研究没有报告每个具体患者的愈合率/时间，因为仅确定骨不愈合患者的愈合率是不可能的。

２.４.数据提取

数据提取由三名研究人员完成。任何分歧都通过讨论解决。提取了以下数据:类型的治疗,包括病人,病人的时代,网站和骨折类型,类型和骨不愈合,时间频率的影像学随访,愈合速度6和12个月,在最后随访失败率(也就是说,变量时间点根据研究设计)和原因,类型的研究中,质量评估,和参考。治疗分为BMAC、BMAC联合支架(BMAC/ scaffold)、BMSC、BMSC联合支架(BMSC/ scaffold)四类。对同一篇文章中纳入的不同治疗方法的结果数据，按照相应的治疗类别分别进行考虑和分析。同样的方法也适用于报告合格和不合格患者数据的研究。例如，如果一项研究包含了与有无共病患者相关的数据，则只有与后者相关的数据被纳入meta分析。

2．5．结果(s)

（1)主要结果是研究细胞基础治疗(BMAC/Scaffold, BMSC/Scaffold)与自体骨移植的骨愈合率，以及评估4种不同类型的细胞基础治疗(BMAC, BMAC/Scaffold, BMSC，和BMSC/Scaffold)在6个月和12个月的随访中与骨愈合率相关的骨愈合率(2）次要结果是骨不连的类型和部位与上述治疗的疗效之间的相关性

2.6。质量评估

As a measure of study quality, we selected and evaluated the following biases: (1) retrospective or prospective analysis and source of data (record bias), (2) relevance and definition of nonunion (i.e., lack of data regarding the duration, type, and site of nonunion) (reporting bias), (3) presence in the study of relevant confounding variables that could affect the clinical outcome (i.e., different types of nonunion, different sites of nonunion, different types of fixation, and different number of treatments) (relevant confounding factors bias), and (4) any missing outcome data (outcome reporting bias). Three investigators performed the quality assessment. Disagreements were resolved by consensus.

2.7。统计分析

对于对照研究，我们根据6个月和12个月的愈合率作为二分类结果，使用95%置信区间(95% CIs)表示的风险差异(RD)来评估治疗效果。正如DerSimonian和Laird所描述的那样，在单个研究中报告的结果度量通过使用随机效应模型的荟萃分析相结合[11]，因为在干预措施之间将预期一定程度的人群和治疗的异质性。

由于大多数已确定的研究没有包括任何对照组，我们使用了比例meta分析来间接比较不同的治疗沿着他们的CIs。效应大小(Effect Size, ES)代表6个月和12个月时的愈合率与每个治疗组(BMAC、BMAC/Scaffold、BMSC和BMSC/Scaffold)纳入每个研究的患者总数的百分比。森林图显示了每个研究的95%精确CIs的具体比例，95% Wald CIs的亚组和总体汇总估计，以及统计量，描述由于研究间异质性而引起的总变异百分比。

使用统计数据和假定有影响时大于50% 作为统计意义上的计算异质性。

所有分析均使用RevMan 5.3进行[12和STATA软件版本15使用metaprop命令[13作为对Harris等人开发的metan程序的改编。[14］．

3.结果

3.1。学习选择

基于文献搜索策略，发现了340项研究（Pubmed和Cochrane中的33次）。其中，排除了15篇文章，因为它们在文献搜索中倍增。剩下的325条记录中，33条记录被排除在外，因为它们是非英语文章。其他文章也被排除出于不同的原因：4不可用的全文，41条审查文章，1个重叠研究，191条不满足纳入标准的文章。在剩下的55篇文章中，在阅读全文后，29篇被排除在原因如下：10篇论文描述了在骨折的情况下，12篇关于骨折的预防治疗，12篇与学习领域没有相关，7篇，因为只有一部分患者满足所有纳入标准，并无法推断单身患者的愈合率。从审查文章的书目中检索一项研究。总体而言，我们终于包括27项研究，符合随后的荟萃分析的资格标准（图1）.

3.2。研究的特征和质量评估

纳入meta分析的研究见表1．约70％的分析文章（19/27）相关的BMAC类治疗;其余文章（8/27）研究了基于BMSC的疗法的功效。大约一半的研究（13/27）将BMAC或BMSC与支架组合。骨衍生（即，脱细胞骨和骨屑）和陶瓷支架是最常用的支架。共有分析的研究包括347例治疗骨不源性的患者。考虑到不同的干预措施，163名患者用BMAC /支架，22例用BMSC和BMSC /支架进行92例。患者的年龄在18至92岁之间。几乎一半的经过治疗的非疾病涉及治疗胫骨/腓骨（52.9％），其次是股骨（32.3％），肱骨/ ulna（11.1％）和半径（3.7％）。只有一项研究，包括50名患者，省略了指定治疗的股骨或胫骨壬氏的数量。 For this reason, this study was not included in the calculation of the above described percentages. The type of fracture was described in 16 out of 27 studies (59.3%), with 76.6% of patients treated for closed fractures. Among the studies describing the treatment of open fractures, 3 reported the AO-OTA classification and the remaining reported the Gustilo and Anderson classification. None of the studies reported the defect size. The type of treated nonunion, i.e., atrophic or hypertrophic, was indicated in 14 articles (51.9%) and showed that most of the patients were treated for an atrophic nonunion (86.3%). The duration of nonunion ranged between 6 months and 9 years. Timing and frequency of radiographic follow-ups were very variable among studies. In 4 out of 27 studies, the latest follow-up was 6 months after treatment. Healing rate at 6 and 12 months was reported in 21 and 18 studies, respectively. Among the 15 articles reporting treatment failures at the last analysed follow-up (55.6%), only 6 provided a possible explanation, such as alcoholism, improper osteosynthesis, or bone loss. Adverse events were evaluated in most of the articles, but no side effects directly linked to the delivery of BMAC or BMSC were reported, suggesting that these treatments can be considered safe also in elders. Almost half of the studies were prospective (14/27). The remaining articles included 9 retrospective studies, 3 case studies, and 1 case report. Only 2 studies were controlled and included bone autograft as the control group. However, none of these studies was randomized.

回顾性和病例研究/报告认为记录的偏倚为阳性。几乎一半的文章呈现出这种偏见(15/27)。这一偏倚也归因于两项前瞻性研究，因为它们似乎聚集了一系列患者，而不是追求系统和合理的患者登记。我们将报道偏倚定义为对治疗的骨不连特征的相关信息的遗漏，如骨不连的类型和部位。27篇文章中有14篇(51.9%)存在这种偏差。考虑到即使在同一项研究中，骨不连持续时间的高变异性，以及其他影响因素，如骨不连的类型、部位和固定类型，几乎所有的研究都被相关混杂因素归类为偏倚。在分析的研究中，27个研究中有2个(7.4%)没有报告在研究“材料和方法”中定义的时间点的愈合率。因此，这些被归类为受结果报告偏差的影响。11篇文献(40.7%)对影像学随访频率未作明确界定。由于缺乏明确的后续计划，无法通过结果报告来确定这些记录是否有偏见。

3.3。后续6个月的骨愈合率

调查基于细胞的疗法（BMAC /支架或BMSC /支架干预）的两项受控研究没有显示出骨愈合速率的任何显着差异与控制干预（骨自体移植物）（2项研究，100名患者，RD 0.11 95％CI -0.05到0.28， ； ，数字2）.

在缺乏对照组的队列研究中，有5项研究在“材料和方法”部分没有按照计划报告结果数据(18.5%)。其余患者中，BMAC组的骨愈合率平均合并比例为77% (95% CI 63%-89%， 107例， 研究），其次是BMAC /支架，71％（95％CI 50％-89％，117例， )，BMSC 59％（95％CI 10％-99％，19例， )，bmscs /支架4% (95% CI 0%-50%， 6例， ）.合并重叠的95% ci表明，除了bmmsc /Scaffold组，其他干预均有相似的效果，但不具有代表性。数据报告见图3.．

3．4．随访12个月的骨愈合率

研究BMAC/Scaffold或BMSC/Scaffold干预的两项对照研究与对照干预(自体骨移植)相比，没有显示骨愈合率的任何显著差异(2项研究，100例患者，RD 0.12 95% CI -0.03至0.28， ； ，数字4）.

在缺乏对照组的队列研究中，有2项研究未按计划报告结果数据(4.7%)。其余的骨髓间充质干细胞/支架治疗组的平均合并骨愈合比例为100% (95% CI 81%-100%， 9例， ）其次为BMAC/Scaffold, 95% (95% CI 87%-100%， 117例 )，单独骨髓间充质干细胞有87% (95% CI 58%-100%， 22例， )，和BMAC单独含有81％（95％CI 65％-93％，117例， ）.合并重叠的95% ci表明四种干预措施的效果相似。数据报告见图5．

4。讨论

undunions的标准管理基于可能或可能不涉及更换固定植入物和自体移植物的使用的手术。undunions代表了临床应用基于细胞的疗法的主要指示。事实上，如日益增长的文献所示，BMSC和骨髓衍生物对治疗这种疾病的兴趣提高了兴趣。在这种系统审查中，我们注意到与骨自体移植相比，骨骼愈合的积极趋势有利于干细胞的疗法。然而，必须强调，这种差异不是统计学上的重要，并且通过缺乏研究弱来支持数据。事实上，最代表性的研究设计是单一队列研究。其中，我们发现单独的BMAC或与支架结合的骨愈合分别在77％和71％的患者的6个月内产生骨愈合。相反，与BMSC和BMSC /支架的干预率在治疗后6个月（分别为59％和4％）显示出较差的愈合速率。BMAC /支架组在12个月后的BMAC /支架组（95％）的骨愈合速率显着增加，而仅使用BMAC（81％）时略微增加。在此时间点，与基于BMSC的处理相关的愈合率甚至比相应的BMAC的处理所产生的治疗甚至更好（BMSC：87％; BMSC /脚手架：100％）。 However, no definitive conclusion can be derived about the use of BMSC combined with a scaffold due to the retrieval of only 3 studies for a total number of 9 patients. Even in the absence of strong evidences coming from controlled studies, these preliminary results suggest that the use of bone scaffolds (demineralised bone, bioceramics, bone chips, etc.) in combination with cell-based therapies can be considered of great importance to locally deliver and engraft progenitor cells, while providing a structural support to the bone healing process.

一般来说，失败主要是由于骨折不稳，严重的骨质流失，或酒精/药物成瘾。我们还推测，以细胞为基础的治疗失败的主要原因之一可能是肥大性骨不连而不是萎缩性骨不连，而萎缩性骨不连通常不推荐用于这类骨科手术。事实上，与萎缩性骨不连相比，在这些病例中，以细胞为基础的治疗效果可能非常有限[42.］．此外，用于限制残肢微活动的固定技术对肥厚性骨不连的影响很大，这可能使情况更加复杂。我们认为这些前提与评估细胞基础治疗与骨不连类型的疗效特别相关。然而，只有一半的分析文章报道了骨不连的类型和相对失败率，这阻碍了我们适当地调查这两个参数之间可能的相关性。在治疗长骨不愈合时，同样重要的是要记住损伤骨的类型。事实上，即使是在同一个肢体上，腿骨和臂骨所承受的重量也大不相同，这可能会显著影响临床结果。尽管几乎所有的论文都报道了治疗失败的解剖部位，但病例数量仍然太少，无法明确定义失败率和骨折部位之间的关系。同样，也不可能调查每种治疗的临床结果与骨折类型之间的相关性。事实上，只有大约50%的研究表明骨折是闭合的还是开放的，并且/或者在开放性骨折的情况下提供评分。此外，在一些提供骨折评分的研究中，没有报道每个特定患者的临床结果，因此阻碍了这些参数之间的相关性。

尽管在分析的研究中对治疗患者的平均年龄相似，但年龄范围是非常异质和广泛分布的。虽然年龄较大的年龄不会直接影响骨折不谐振的愈合结果[43.，患者间充质基质细胞的质量已知在老年患者中降低[44.- - - - - -46.］．根据这一前提，基于细胞的方法的治疗效果应该对招生患者的年龄加权，类似于代谢和社会习惯，这些习惯已经表明了一些分析的研究中的治疗失败的决定因素。

在该荟萃分析中，我们发现关于失败率和原因的详细报告通常不一致。这意味着不可能明确识别已知或可能的混淆偏差和治疗失败之间的关联。

基于所有这些考虑，我们想强调关于患者队列和临床结果的有用数据的非常糟糕的报告，并随后强调需要按照国际报告标准进行研究，赤道网络倡议指出，并由STROBE观测研究指南实施(http://www.equator-network.org/）.在许多情况下，糟糕的报告也反映了这些研究的开展质量差，解释了在过去20年里花费的研究数量之间的不匹配在体外和在体内支持间充质基质细胞在骨再生中的应用的研究，以及在临床实践中缺乏对其治疗效果的证明。事实上，本综述仅检索了2个对照临床试验，比较了骨髓源性细胞治疗与自体骨移植的疗效，代表了治疗的金标准[31，41.］．不管怎样，这两项研究不是随机的。此外，我们注意到在分析研究中使用的程序有很大的可变性。例如，BMSC的分离和扩展协议以及获得BMAC的协议在不同的研究中存在显著差异。另一个变量，通常不明确的因素是作为BMAC或扩大的BMSCs交付的祖细胞数量。事实上，只有少数研究评估了BMAC中祖细胞的数量[21- - - - - -23，28］．关于扩大骨髓间充质干细胞的使用，我们发现一些研究提供了不同数量的骨髓间充质干细胞，但这些研究都没有分析细胞数量和治疗效果之间的相关性[34，36- - - - - -38］．在这种情况下，我们认为最近批准的欧盟-H2020-Orthnounion项目将提供有趣的见解。该项目专注于测试不同剂量的疗效在体外将BMSC扩展到跨国多期，受控（自体移植）和随机临床试验中的生物材料上。由于这些特定特征，Eu-H2020-Orthounion代表了有望的尝试，以证明基于细胞的疗法在标准化设置中治疗非阳离的疗效（Eudract Number 2015-000431-32）[47.］．本研究将获得100多名患者，基于准确的功率分析实施样本量计算。考虑到在分析的研究中，7例报告描述了从1至3名患者获得的数据以及评估扩张BMSC的所有研究包括少于10名患者，Eu-H2020-Orthnounion项目将代表一个重要的一步向前和一个积极的例子欧洲临床医生中有效合作。

5.结论

总的来说，在解释meta分析中获得的数据时应该谨慎。事实上，研究的异质性、有限的报道和非系统的研究设计使我们很难就骨不连愈合的最佳方法得出明确和明确的建议。未来应进行临床试验，并进行更准确的规划和数据收集，以获得细胞为基础的治疗效果的可靠论证，使用骨支架促进植入祖细胞植入的重要性，以及BMAC相对于扩大的BMSCs的优越性。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

SL和SP对这项研究做出了同样的贡献。

致谢

该项目由意大利卫生部Ricerca Corrente, Progetto“修正体表科学研究，创伤学研究”资助。

补充材料

附录S1:搜索策略，包括用于文献搜索的MeSH术语。附录S2:表中包括了排除的合格研究，因为它们报告了合格和不合格患者的汇总数据。（补充材料）

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