从人类脱落乳牙干细胞改善糖尿病肾病体内和体外抑制晚期糖化结束Product-Activated Epithelial-Mesenchymal过渡

文摘

糖尿病肾病(DN)是一种慢性肾脏疾病的主要原因。已经证明间充质干细胞(msc)对肾脏疾病有治疗效果。干细胞从人类脱落乳牙(棚)是源自msc牙科纸浆脱落乳牙的年轻患者,因此具有较高的扩散率和一个简单的访问。因此,我们旨在探索流的影响在Goto-Kakizaki DN(门将)老鼠。通过尾静脉注射。血糖、血清甘油三酯和胆固醇、体重和尿白蛋白前后测量管理。8周后管理、实时PCR,免疫组织化学(包含IHC),和电子显微镜是用来检查阻力指标组织。也许可以在肾小球病变,肾脏重量和血清il - 1、il - 10, TNF -αTGF -β和HGF水平测定。摆脱肾脏移植是被使转染绿色荧光蛋白(GFP)。II型epithelial-mesenchymal过渡(EMT) tubule-interstitial和小动脉的地区已被报道的一个重要病理特征DN。本研究首次应用coculture transwell系统探讨msc的EMT的影响人类的近端小管上皮细胞(HK-2)。洒在先进的糖化的影响最终产品——(年龄)激活EMT HK-2细胞被实时聚合酶链反应和免疫印迹了。政府8周后,肾损伤,包括高血糖、高脂血症,尿白蛋白排泄增加,ECM积累,和部分系膜区,是大大减弱。血清il - 1、TNF -α,TGF -β明显下调,而血清il - 10水平和HGF被流调节。GFP表达证实在糖尿病肾脏的移植。此外,cocultured摆脱抑制AGE-induced EMT在HK-2细胞。总之,摆脱小说提供了一个潜在的有效的治疗方法来改善DN。

1。介绍

糖尿病(DM)据估计,到2030年成为全球第七大死因(1]。DM与并发症相关,影响患者的生活质量,比如心血管疾病(2),视网膜病变(3),糖尿病神经病变(4,糖尿病肾病(DN) (5]。DN患者影响超过40%的1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)病人体内(6]。DN仍然是慢性肾脏疾病的主要原因,约有50%的全世界所有例终末期肾病(ESRD) (7]。2型糖尿病患者有肾移植率为9%8]。DN被定义为增加尿白蛋白排泄(UAE)在缺乏其他肾脏疾病,分为以下阶段:微量白蛋白尿(UAE 20μg / min - 199μ克/分钟或30 - 299毫克/ 24 h)和macroalbuminuria ( / 24 h) [9]。DN的关键病理特征包括肾小球基底膜(GBM)的逐渐增厚,肾小球肥大伴随着系膜扩张矩阵与矩阵几个蛋白质的积累,我胶原蛋白、层粘连蛋白等β1,纤连蛋白,导致肾小球的过滤面(在逐步减少10]。

II型EMT tubule-interstitial和小动脉的地区已被报道的一个重要病理特征DN。当EMT发生时,HK-2失去上皮细胞表型和获得间充质,呈属性(11,12]。年龄,主要是转录后的改性蛋白质或脂质,绑定multiligands,称为晚期糖化终产物中的受体(愤怒),激活不同的激酶和NADPH氧化酶类主要增加活性氧的水平,进一步促进合成更多的年龄,从而引发破坏细胞机制(13- - - - - -15]。

DN发展可以通过严格的血糖控制,防止血压控制,肾素血管紧张素醛固酮系统(老城)封锁,戒烟,控制体重。虽然胰腺移植可以反向肾小球和肾小管基底膜的厚度5年后normoglycemia [16),这个过程与免疫抑制疗法的副作用(17和影响长期生存风险免疫18]。

值得注意的是,MSC-based治疗被认为是一个有前途的战略固化DM和相关并发症。msc与潜在人口self-renewable细胞分化成多种细胞类型(19]。据报道,人类牙髓干细胞移植(DPSC)通过IM路线重复剂量是更好的选择,作为长期治疗糖尿病神经病变(20.]。棚是源自msc牙科纸浆脱落乳牙从年轻患者,因此有更高的增殖率(21]。摆脱对临床应用非侵入性更容易检索和作为医疗垃圾被丢弃;因此,更少的道德问题存在。这些细胞也被证明可能导致nondental细胞谱系用于广泛的疾病的治疗,例如骨缺陷,创伤性脑损伤,T1DM [22- - - - - -24]。因此,我们假设可以对减轻DN的发展是有益的。在这项研究中,GK大鼠,nonobese和自发的(基因)2型糖尿病模型,首次用于检查msc在DN的效果。此外,msc的影响AGE-induced EMT HK-2细胞首次探索了transwell系统。

2。材料和方法

2.1。流和bmsc隔离、体外扩张和鉴定

小屋捐助者、6到8岁、来自儿科诊所,而骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)捐助者患者,年龄在16到20年,曾third-molar痛苦。

根据三浦等人提出的方法和实践在我们先前的研究[21,25),乳牙与磷酸盐反复洗3次(PBS, Solarbio,北京);果肉组织分离、压碎和消化3毫克/毫升I型胶原酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和4毫克/毫升dispase (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)的比率1:1;在37°C孵化1 h;在1000转/分钟和离心5分钟。上层清液被丢弃,细胞颗粒resuspended在一个适当的量αmem (HyClone,通用电气医疗集团生命科学、南洛根,UT,美国)补充20%的边后卫(HyClone,通用电气医疗集团生命科学、南洛根,UT,美国),1%的抗生素(青霉素100单位/毫升G和100 G / ml链霉素,Solarbio,北京,中国),透过70μm细胞的过滤器。25厘米的细胞悬液被播种²培养皿中包含αmem补充20%的边后卫和1%的抗生素,细胞培养在37°C公司5%₂3天。培养基是改变每3或4天。

智齿的提取的影响,牙齿周围的牙槽骨切除,骨髓是暴露26]。随后,吸入从骨髓获得网站使用一个18 g针连接到一个一次性注射器注射。然后,立即吸入涨跌互现α200单位/毫升mem补充与肝素(Solarbio,北京)。这些细胞被离心机在500克/分钟5分钟,resuspendedαmem,播种密度0.1毫升的送气音/ 35毫米组织培养皿中,并保持在2毫升αmem补充20%的边后卫和抗生素在37°C公司5%₂3天。此后,漂浮细胞被移除,连接细胞被喂以新鲜培养基,每3或4天了。

单层棚和观察bmsc融合时,这些细胞被通过的比率1:3和培养αmem补充10%的边后卫和1%的抗生素(间充质cell-conditioned介质(MCM))在37°C公司5%₂。

的表面标记资料流和bmsc第三通道被流式细胞术验证。细胞在第三段resuspended浓度 细胞在寒冷的PBS /毫升含有2%的边后卫前添加以下单克隆抗体:CD34-PE, CD45-PE, CD73-PE, CD90-FITC, CD105-FITC, CD146-PE(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。无污点的细胞作为消极的控制。最后,分析了彩色细胞使用贝克曼库尔特流式细胞仪系统(FC500、贝克曼库尔特、布雷亚、钙、美国)。

2.2。脂肪形成的和成骨分化

诱导脂肪形成的差异化,我们汇合的细胞转向与200年MCM补充μ胰岛素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),100年μ吲哚美辛(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),1μ地塞米松(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和100年μg / ml 3-isobutyl-1-methyxathine (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。我们更换了中等每2到3天。细胞的成熟和脂质囊泡的形成是通过执行评估油红O (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)染色21天在成骨的媒介。

诱导成骨分化,我们交换汇合的细胞与10毫米MCM补充β甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),50μg / ml抗坏血酸盐2-phosphate (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和0.1μ地塞米松。我们更换了中等每2到3天。细胞分化成hydroxyapatite-producing成骨细胞矿化矩阵结节经茜素红(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)染色21天在成骨的媒介。

2.3。对体内细胞标记跟踪

GFP作为细胞跟踪器跟踪实验来评估intrarenal棚和bmsc的位置。流和bmsc被慢病毒载体转导与GFP根据制造商的协议(GenePharma、上海、中国)。短暂,第三通过细胞培养在6-well板3 -的浓度 /好。当细胞达到30 - 50%融合,定期与增强的感染中取代了解决方案和补充的GFP慢病毒载体感染复数(MOI) 100。12 h后,转染介质改为普通介质,这些细胞被扩大,收集管理。

2.4。动物模型和组

SPF-grade 12个男性GK大鼠体重约300 - 350克从常州卡文购买实验动物有限公司,有限公司,常州、江苏、中国。SPF-grade 12个月大的雄性Wistar鼠体重约350 - 400克河从北京购买重要的实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)用作正常控制。老鼠维持在12 h: 12 h与自由进入黑暗周期啮齿动物食物和水。食用高脂肪饮食后2 - 4周的GK老鼠,老鼠nonfasting血糖 连续3天被归类为DN大鼠。

DN大鼠随机分为3组,6正常非糖尿病的大鼠分为正常对照组。DN大鼠喂养传统食物。4组大鼠收到以下治疗方法:(1)正常的非糖尿病的老鼠没有得到治疗(正常组);(2)DN大鼠获得了注资(棚组);(3)DN大鼠收到1毫升的PBS输液(PBS组);和(4)DN大鼠收到bmsc注入(bmsc组)。所有大鼠4组观察治疗8周后管理。此外,6个DN大鼠移植GFP-SHED或GFP-BMSCs跟踪的目的(见图1)。

2.5。MSC管理

总共 细胞,包括bmsc,摆脱,GFP-BMSCs和GFP-SHED resuspended 1毫升的PBS和通过尾静脉接种老鼠。老鼠在PBS组1毫升的PBS。

2.6。生理和生化评估

体重、空腹血糖和每周nonfasting葡萄糖测定。血糖水平与glucometer系统测量Accu-Check性能(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)。生化参数测定糖尿病感应(MSC)前和后8周后MSC。血清甘油三酯和胆固醇水平与建筑师c8000自动分析仪测定(美国方丈、湖泊虚张声势,IL)。无荚膜的肾脏,肾脏重量后立即测量老鼠被牺牲了。肾质量指数,由肾脏重量对身体重量的比值,也被计算。

2.7。肾脏功能的测量

代谢老鼠被关在笼子里的收集24小时尿液样本糖尿病感应(msc)前和后8周后msc。尿白蛋白水平与建筑师c8000自动分析仪测定。

2.8。样品收集

管理8周后,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(Solarbio,北京)。从retro-orbital静脉血样采集,老鼠牺牲和灌注和100毫升的冷PBS左心室,然后通过右心室前20毫升的冷PBS组织被解剖分离。肾脏很快被删除,无荚膜的体重,和切割成两部分;一部分是立即在液态氮冷冻和储存在−80°C分子生物学研究,另一部分是存储在4%多聚甲醛进行组织病理学分析。此外,肾皮质被切成1毫米³件和固定在1.2%戊二醛通过电子显微镜分析。

在2周、4周和8周后管理GFP-SHED或GFP-BMSCs,老鼠麻醉,牺牲,包括如上所述。肾脏是在10月无荚膜的和嵌入式(樱花、东京、日本)在-80°C。

2.9。肾基因表达分析

从肾脏匀浆提取的总RNA的试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和反向转录成cDNA PrimeScript RT试剂盒(豆类生物技术、大连、辽宁、中国)。RNA表达评估实时逆转录酶聚合酶链反应(PCR)使用SYBR绿色系统(7300实时系统,应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA,美国)根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸是由使用以下引物PCR扩增(正向引物,反向引物):GADPH-5 - - - - - -GACAACTTTGGCATCGTGGA-3 ,5 - - - - - -ATGCAGGGATGATGTTCTTG-3 ;α-SMA-5 - - - - - -GCTGACGGATGCAGAAGGAG-3 ,5 - - - - - -TGCTGGAAGGTGGAGAGAGAA-3 ;Col1-5 - - - - - -GACATGTTGAGCTTTGATTACCTC-3 ,5 - - - - - -GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA-3 ;FN-5 - - - - - -CTGAACCCAGTCCCGATGGTA-3 ,5 - - - - - -CACGTCCAACGGCATGAAG-3 ;层粘连蛋白β5 - - - - - -CGGAAAGGAAGACACGAAGAA-3 ,5 - - - - - -AGGACACCAAAGGCGAACA-3 ;nephrin-5 - - - - - -CTCCGTCTCCAGACCTTGGAAATA-3 ,5 - - - - - -TGGATGGCTTTGGACACATGA-3 ;和synaptopodin-5 - - - - - -CCAGGGCAGAGCAGAGAGTAAA-3 ,5 - - - - - -AGCCATCAATAAGCCCAGAAAA-3 。

2.10。肾组织学和免疫组织化学分析

肾组织嵌入石蜡。肾部分(4μm)沾不是试剂(Solarbio,北京)来评估肾小球和肾小管损伤。与光学显微镜切片分析,捕获图像的数码相机。

肾小球硬化症被定义为一个密集的存在,丰富沉积肾小球塔夫茨,PAS染色阳性的毛细循环和节段性闭塞的透明样变化;损害tubule-interstitial和小动脉的区域被定义为扩张的存在,蛋白质气缸和萎缩(11]。FN表达在肾组织中通过免疫组织化学方法检测(包含IHC)准备的部分。短暂,deparaffinized和水化后,部分治疗与pH值9.0 Tris-EDTA(中山金桥生物技术,北京)与微波抗原检索和处理3%过氧化氢(中山金桥生物技术,北京)阻断内源性过氧化物。部分是孵化主要抗体(美国Proteintech纤连蛋白,芝加哥,IL)一夜之间在4°C。与PBS冲洗,部分被添加以辣根过氧化物酶-(合)标记二次抗体(中山金桥生物技术,北京)在室温下30分钟。检测步骤后diaminoben (DAB)衬底(中山金桥生物技术,北京)和苏木精细胞核旨在遏制公款吃喝,切片观察和捕捉。

2.11。肾脏电子显微镜分析

肾皮质固定在2%戊二醛1 h。与PBS三洗后,样本后缀四氧化锇和1%甲次砷酸盐缓冲(pH值7.2)2 h。随后,样品在丙酮脱水和嵌入在812环氧树脂(美国宾夕法尼亚州SPI供应,West Chester)。(60 - 80海里)超薄部分被剪掉了,double-stained雷诺兹醋酸双氧铀及柠檬酸铅,用透射电子显微镜检查(日立,东京,日本)。

2.12。酶联免疫吸附试验(ELISA)测量

血清il - 1的含量β、il - 6、il - 10, TNF -αTGF -β,用ELISA检测HGF。1.5毫升的一部分外周血样本收集通过静脉途径和离心机在5000 r / min在4°C 10分钟。血清收集和储存在-80°C的测试。il - 1的含量的差异β、il - 6、il - 10, TNF -αTGF -β和HGF(北京Qisong生物科技、北京、中国)同时定量测量严格按照制造商的说明。实验都是一式三份。

2.13。MSC检测

cryosections (5μ米)与DAPI染色(Solarbio,北京)和安装。片被荧光显微镜观察。图像捕获和数码相机几乎合并。

2.14。HK-2细胞培养和Coculture msc

HK-2细胞从细胞库,上海生命科学研究院(中国科学院、上海、中国),在上皮细胞培养基培养(EpiCM、ScienCell Cedro、钙、美国),和维持在37°C的环境中含有5%的股份有限公司₂。用0.1%胰蛋白酶/ 0.1% EDTA消化了。当观察单层细胞融合,细胞受到通道的比率1:3。

生成coculture HK-2和msc、系统中建立了coculture,这样两个细胞类型可以在同一培养基培养条件。因此,1:1 MCM和EpiCM准备的混合物。

HK-2细胞第一次播种6-well板( /在EpiCM坚持)。第二天,HK-2包含100在coculture培养基培养细胞μg / ml BSA (Lablead生物技术,北京)或100μg / ml年龄(BioVision、旧金山、钙、美国)。此外,合适的transwells (0.4μ美国纽约m,康宁公司合并,康宁)插入和HK-2细胞,脱落或bmsc ( /)被播种的膜transwells,如图2。每天新鲜cocultured媒介改变了(见图2)。coculture 3天之后,从HK-2细胞RNA和蛋白质提取如下所述。

2.15。HK-2细胞RNA表达

细胞总RNA提取cocultured HK-2和反向转录成cDNA此前表示。互补脱氧核糖核酸被实时放大使用以下引物PCR(正向引物,反向引物):GADPH-5 - - - - - -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ,5 - - - - - -GAGATGGTGATGGGATTTC-3 ;E-cadherin-5 - - - - - -TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3 ,5 - - - - - -TGGACCAGTGTCCGGATTA-3 ;β-cadherin-5 - - - - - -GCTGAAGGTGCTATCTGTCTGCTC-3 ,5 - - - - - -TGAACAAGACGTTGACCTTGGATCTG-3 ;α-SMA-5 - - - - - -CTGGCCGAGATCTCACTGACTA-3 ,5 - - - - - -GCCCATCAGGCAACTCGTAA-3 ;FSP-1-5 - - - - - -CAGATAAGCAGGCCGAAAA-3 ;和Fn-5 - - - - - -TGCCTTGCACGATGATATGGA-3 ,5 - - - - - -CTTGTGGGTGTGACCTGAGTGAA-3 。

2.16。免疫印迹分析

蛋白质从cocultured HK-2细胞提取了里帕(Solarbio,北京)根据制造商的指示,和使用布拉德福德的蛋白质浓度是量化方法(Beyotime、上海、中国)。每个蛋白质溶解产物(30μg)是运行在10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶(Solarbio,北京)和转移到硝酸纤维素(微孔、上海、中国)。膜被封锁5%脱脂牛奶(Lablead生物技术,北京)Tris-buffered盐水(pH值7.4)包含0.1%渐变20 (TBST Solarbio,中国北京)1 h在室温和培养16 h在4°C主要抗体。蛋白质水平正常化β肌动蛋白的水平。本研究中使用的主要抗体如下:鼠标多克隆抗体β肌动蛋白(1:1000;Proteintech、芝加哥、纽约、美国)、波形蛋白兔多克隆抗体(1:1000;Abcam,剑桥,英国),兔多克隆抗体FN (1: 1000;美国Proteintech,芝加哥,IL),钙粘蛋白和鼠标单克隆抗体(1:500;美国芝加哥Proteintech)。广泛的洗后,膜与辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体2 h在5%脱脂牛奶/ TBST室温。发射极耦合逻辑(Solarbio,北京)是用于检测。

2.17。统计分析

所有的数据呈现的 偏差(SD)。用SPSS软件进行统计分析(版本17.0;美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。学生的 - - - - - -测试是用于比较变量之前和之后的管理。为多个比较,单向方差分析(方差分析)。统计学意义是 。

3所示。结果

3.1。msc文化和识别

流和bmsc表现出典型的呈形态。流的身份或证实了bmsc分化成成骨的脂肪形成的细胞(见图3)。此外,bmsc,摆脱被表面标记CD73 (+), CD90 (+), CD105 (+), CD146 (+), CD34 (-)、CD45通过流式细胞术(-)。

3.2。摆脱对生理和生化参数的影响

糖尿病诱导2至4周后,血糖水平的36 39 GK大鼠符合条件的DN。六个老鼠被随机选择细胞跟踪。此外,30 GK大鼠随机分为3组(棚组: ,PBS组: ;和bmsc集团: )。

治疗后管理、在治疗期间禁食血糖水平显著降低棚和bmsc组,而nonfasting血糖水平仅在两周后政府减少bmsc集团和显著减少在两周,3周,7周后政府在小屋群(见表1)。

此外,与正常组相比,GK大鼠血清血清胆固醇和甘油三酯水平增加。在政府后8周,PBS组血清甘油三酯增加但bmsc保持稳定和组织。此外,摆脱和综合治疗抑制24小时尿白蛋白水平和肾后体重指数管理(见表2)。

3.3。摆脱对肾的影响基因的表达

如图4、实时PCR分析表明,政府大幅下调diabetic-induced增加αsma,胶原蛋白、Fn和层粘连蛋白β表达在肾皮质。相比之下,摆脱政府显著调节diabetic-induced减少nephrin和synaptopodin表达在肾皮质。此外,在没有区别肾之间的基因表达组和bmsc组(见图4)。

3.4。摆脱对肾组织学改变的影响

PAS染色显示类似的PBS组的变化,不同于正常组肾小球及小管,显示肾小球硬化,系膜扩张,管状扩张,通过光学显微镜和蛋白质缸。然而,这些变化的程度提高了肾小球及小管棚和bmsc组。只有少量的肾小球硬化症和观察管扩张组和bmsc组。进一步改进结构或接近正常的肾小球结构和小管棚和bmsc组织观察。此外,疣状FN在PBS组显著增加,显著减少和综合治疗。

此外,“绿带运动”很明显增厚,足细胞足突的被压缩,丢失或混乱的PBS组相比正常控制。GBM msc两组的厚度之间的厚度正常组和PBS组。此外,脚的过程改进的异常组和bmsc组(见图5)。

3.5。摆脱对血清细胞因子水平的影响

PBS组il - 1和肿瘤坏死因子的水平α显著增加相比,那些在其他细胞移植后三组。il - 10的水平和TGF -βBMSC和剥离组之间在正常组和PBS组。在小屋和BMSC组,HGF水平大大增加与正常对照组相比,HGF水平在四组的PBS组最低(见图6)。

3.6。流跟踪

由慢病毒载体转导GFP的msc导致转导效率高,证实了近80%的bmsc,流表现出绿色荧光转导后3天。在2、4、8周后,GFP-BMSCs和GFP-SHED阻力指标地区也许可以被发现在肾小球和(见图7)。

3.7。摆脱对HK-2文雅和年龄的影响

实时PCR分析表明,HK-2细胞cocultured bmsc或显著逆转AGE-induced增加αsma、Fn和波形蛋白的表达。相比之下,MSC管理显著逆转diabetes-induced减少钙粘蛋白和β连环蛋白表达。

此外,细胞免疫印迹分析表明,HK-2 cocultured bmsc或流显著逆转AGE-induced Fn和波形蛋白的增加。相比之下,MSC管理显著逆转AGE-induced减少钙粘蛋白。此外,没有差异HK-2细胞培养与年龄之间的摆脱和BMSC组实时PCR或免疫印迹(见图8)。

4所示。讨论

DN是DM的最严重的并发症之一。然而,没有特定的或有效的药物治疗DN。作为一个潜在的战略,MSC治疗多年来已获得了高度的关注。先前的研究已经表明,bmsc, ADSCs UCB-MSCs减弱DN STZ-induced动物(27- - - - - -29日]。

在我们的研究中,目前的数据清楚地表明,摆脱政府改善糖尿病肾损伤,包括高血糖、高脂血症,增加蛋白尿,部分系膜区,ECM积聚,激活细胞因子的不平衡GK大鼠和EMT在HK-2细胞。此外,bmsc作为阳性对照,没有明显差异的影响和bmsc DN。

流式细胞术分析在这项研究表明,摆脱和bmsc似乎CD146的表达不同。CD146(也称为黑色素瘤细胞粘附分子)抗原表达在几乎所有类型的上皮细胞,激活T细胞,树突状细胞(30.,31日]。最近的报告表明,CD146的表达通过MSC对MSC字符(没有显著影响32]。尽管一些研究发现CD146 +间充质干细胞显示治疗潜力大于CD146——对于一些其他疾病,我们没有发现显著差异的影响和bmsc DN。并进一步研究是必要的。

临床研究表明,最优数量的msc管理DM及其相关并发症 /公斤,这不是小33- - - - - -35];因此,种子细胞的增殖潜力MSC-based治疗是极其重要的。以前,摆脱被发现的扩张率和增殖率明显高于bmsc的。bmsc需要更多时间两倍,意味着价值 h,而所需的时间的两倍了 h (36]。此外,流更容易为临床应用非侵入式检索和作为医疗废物丢弃。更少的道德问题存在。因此,摆脱DM和相关并发症的理想种子细胞。

在我们的研究中,空腹血糖水平显著降低棚和BMSC移植8周后,虽然nonfasting血糖水平显著降低只在2周,3周,7周后因政府,因此,不同于先前的研究表明nonfasting血糖水平显著降低在整个治疗。一个可能的解释是研究中使用的实验动物模型。在这项研究中使用的动物模型是GK大鼠2型糖尿病模型,虽然在以前的研究中,老鼠STZ-induced应用T1DM或2型糖尿病动物模型。T1DM的特点是有缺陷的β细胞分泌功能,2型糖尿病,最常见的类型的DM,特点是胰岛素抵抗和缺陷β细胞分泌功能(37]。、nonobese GK大鼠自发进行的实验模型,被广泛用于调查的进展和治疗2型糖尿病及其并发症,尤其是DN。GK大鼠是通过重复的选择育种获得glucose-intolerant Wistar鼠表现出的外周胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷功能(38,39]。然而,STZ-induced DM的机制是损伤胰岛的目标。另一个解释不一致的结果可能是个别GK大鼠之间不可忽视的差异,因此未来的研究与大样本大小是必要的。此外,msc的送货路线27),细胞的数量(29日,40),剂量的注入也可能导致MSC管理的结果。一个注入msc的有益作用在改善糖尿病大鼠的高血糖只维持一段不超过4周(41]。

血脂异常已被报道与肾病(学科中非常普遍42]。

此外,血脂异常加速肾损害。这一行动背后的机制尚未完全阐明,但认为脂质可能损害血管,血管系膜,提出了管状肾细胞(43]。我们发现了表达下调血清甘油三酯代替血清胆固醇,而流的影响低高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)浓度和小,密度,低密度脂蛋白(sdLDL)粒子需要进一步研究。

尽管摆脱在高血糖和高脂血症的影响仍有待进一步的探索,取得了renoprotective剥离的影响。我们观察到移植8周后政府减毒糖尿病肾损伤的进展就是明证生物化学,分子生物学,组织病理学结果和电子显微镜。我们的研究结果与以前的研究一致强调bmsc的肾保护作用从老鼠,老鼠,甚至人类。ADMSCs从老鼠和USB-SCs STZ-induced人类抑制蛋白尿和肾脏损害的糖尿病大鼠和小鼠44- - - - - -46]。

炎症因素促进巨噬细胞的聚集和激活并加速糖尿病肾损伤的进展。il - 1、il - 6和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)不仅改变趋化因子和粘附分子的表达,也改变intraglomerular血液动力学由前列腺素,导致血管内皮细胞通透性和透明质酸生产增加了肾小管上皮细胞,导致促进ECM积累和系膜扩张。相比之下,il - 10,主要的抗炎和免疫抑制细胞因子产生的几种类型的免疫细胞,免疫反应的调节中发挥着关键作用,抑制白细胞浸润和组织损伤的DN (44]。2型糖尿病是与各自的激活炎性细胞因子。我们认为政府通过尾静脉血清il - 1、TNF水平——表达下调α和调节这些DN大鼠il - 10的,不仅改善胰岛素抵抗,而且通过炎性细胞因子影响肾脏的免疫反应。此外,在这项研究中,摆脱表达下调的血清水平TGF -β同时增加血清HGF水平,从而防止肾小球硬化症和tubule-interstitial损伤在DN。TGF -β1已经被报道为细胞肥大和增加胶原蛋白的合成,最终导致肾小球硬化症tubule-interstitial DN发展期间的伤害,而HGF报道改善DN通过阻断TGF - profibrotic行动β1 (45]。

年龄(与胶原蛋白交联,导致微血管并发症)是一种新的风险因素导致的终末期肾病的发病机制DN (46]。持续暴露年龄据报道通常导致肾小管上皮细胞细胞发生EMT失去上皮表型和获得间充质,呈属性(47]。此外,hUSB-MSC-conditioned媒体抑制TGF -β1-activated EMT NRK-5RE细胞,扭转高胶原蛋白mRNA的表达我和Hsp47和扭转低钙粘蛋白的mRNA表达和BMP-7 [28]。因此,我们探索的影响棚AGE-activated EMT在HK-2细胞。在这项研究中,一个coculture系统是以0.4μm transwell细胞培养上室不可能通过聚碳酸酯膜下室。与此同时,这个系统使细胞从不同室自由交换物质。聚合酶链反应和免疫印迹显示显著减毒AGE-induced EMT HK-2细胞。

我们怀疑脱落的影响AGE-induced EMT可能与肾脏移植,不仅调节当地的炎性环境也衰减EMT的肾小管上皮细胞。在目前的研究中,GFP数据证实移植几尾vein-injected流阻力指标组织2个星期,也许可以进入肾小球和4周和8周后政府同意前者研究[28,29日]。尽管参与干细胞归巢损伤的确切机制仍然是难以捉摸的,缺氧、炎症、和高葡萄糖,所有这些都出现在糖尿病肾脏,可能诱导msc的迁移和扩散。尽管胚胎干细胞可以分化成管状细胞或中肾导管,人们普遍认为msc的旁分泌机制中扮演着重要的角色在他们的保护作用[48]。

5。结论

总之,摆脱防止肾脏损伤在DN包括高血糖、高脂血症,增加蛋白尿,ECM积累,部分系膜区和II型EMT可能通过旁分泌作用,表明了可能成为一种有效的治疗方法对改善DN,终末期肾病的主要原因。

缩写

msc:	间充质干细胞
DN:	糖尿病肾病
流:	乳牙干细胞从人类剥落了
GK大鼠:	Goto-Kakizaki老鼠
包含IHC:	免疫组织化学
绿色荧光蛋白:	绿色荧光蛋白
年龄:	高级糖化终端产品
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
HK-2细胞:	人近端肾小管上皮细胞
糖尿病:	糖尿病
T1DM:	1型糖尿病
2型糖尿病:	2型糖尿病
迹象:	终末期肾脏疾病
阿联酋:	尿白蛋白排泄
宝石:	肾小球基底膜
STZ:	链脲霉素
愤怒:	受体先进的糖化终端产品
老城:	肾素血管紧张素醛固酮系统
伴着:	骨骨髓来源间充质干细胞
PBS:	磷酸盐
αmem:	α修改鹰的媒介
的边后卫:	胎牛血清
罗马数字:	间充质cell-conditioned介质
我:	感染复数
GAPDH:	甘油醛3磷酸脱氢酶
我:上校	胶原蛋白我
PAS染色:	周期性acid-Schiff污点
FN:	纤连蛋白
ELISA:	酶联免疫吸附试验
il - 1:	Interleukin-1
il - 10:	白细胞介素- 10”
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
TGF -β:	转化生长因子-β
HGF:	肝细胞生长因子
EpiCM:	上皮细胞中
SDS:	十二烷基硫酸钠
高密度脂蛋白胆固醇:	高密度脂蛋白胆固醇
sdLDL:	小,密度,低密度脂蛋白
ADMSCs:	脂肪间充质干细胞
USB-SCs:	脐带血液间充质干细胞。

数据可用性

表和图的数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(303076129)和北京大学Taisheng口腔学发展基金(编号94000 - 6672 h78)。

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