制造GMP-Grade骨髓基质细胞与验证体内成骨潜力在巴西一个骨科临床中心

文摘

vitro-expanded骨髓基质细胞(bmsc)长期以来一直提出了复杂的骨损伤的治疗,因为其固有的潜在的分化成多个骨骼细胞,血管生成调节炎症反应,和支持。尽管各种各样的方法被用来扩大bmsc大规模利用良好生产规范(GMP),很少有人注意是否扩张过程确实允许维护关键细胞特点和效力,这对治疗效果是至关重要的。在这里,我们描述的标准程序采用我们的设施clinical-grade BMSC制造产品的保存能力生成骨体内符合巴西监管指南细胞用于人类。骨髓样本来自骨小梁。在标准的单层细胞隔离后的玻璃瓶,BMSC扩张随后两个周期进行,分别在2 -和个人细胞工厂。平均细胞产生细胞工厂的通道1 细胞,同时通道2, 细胞。所有最终的细胞产品无污染,好氧/厌氧病原体,支原体,木糖醇。扩大bmsc CD73表示,CD90、CD105和CD146能够分化成成骨,chondrogenic和体外脂肪形成的血统。的最重要的是,十有八九被移植体内后形成的骨细胞的产品。这些验证过程将作为内部BMSC的基础制造用于临床应用在我们的中心。

1。介绍

骨髓基质细胞(bmsc)已经广泛的被测试的临床前和临床治疗水平复杂骨受伤,骨折不愈合等(1- - - - - -4)、股骨头骨坏死(5,6],批评-大小的缺点[1,7- - - - - -12),和骨软骨病变13- - - - - -19)由于其固有的潜在的分化成多个骨骼细胞类型(20.- - - - - -22),调节炎症反应(23- - - - - -28),和支持血管生成(29日- - - - - -32]。

这些条件的治疗需要的正确结合生物(细胞和支架)和机械因素33- - - - - -35]。取代骨autografts-the当前黄金标准的生物组件,bmsc必须扩大体外大规模利用良好生产规范(GMP) [36- - - - - -45]。虽然已报告各种各样的方法来制造GMP-grade BMSC,仍然主要挑战一代的BMSC产品是扩大的过程,同时保持关键的细胞表型和功能特征25,26]。直到现在,没有共识,试剂,应该使用细胞培养基,培养系统和哪些测试应该执行,以确保最终产品的安全性和有效性27- - - - - -29日]。

因此,BMSC潜在的成功翻译的诊所,当务之急是为细胞生产、开发标准程序,除了基于证据,证据充分的,有效的,临床实用,结合GMP,也保证BMSC的保护效力(46,47]。作为一个主要整形中心在巴西,我们建立了一个内部设施功能的隔离和大规模扩张认证clinical-grade bmsc。在这里,我们报告我们的一般程序,同时遵守GMP标准和巴西监管规则细胞制造用于治疗目的。这些程序将作为企业综合生产的基础为未来的应用在我们的中心,针对骨修复。

2。材料和方法

2.1。试剂和材料

所有试剂和材料用于BMSC隔离,扩张,和低温贮藏的临床级认证。这些试剂整除。保证可追溯性,很多和/或序列号的所有试剂和材料用于每个试验注册。试剂用于体外分化化验和immunophenotyping,不是临床评分,认证时是按照良好实验室规范生产,化学纯度的标准定义。使用的所有试剂的完整列表和所有相关信息可在补充材料(补充表1)。所述技术程序是适应遵守规则的巴西卫生监管机构(机构指出,大学董事会Resolution-RDC Nos。09/2011和214/2018)发展的细胞产品用于人类。

2.2。样品捐献者合格标准

研究设计、程序用于执行,和样品收集机构伦理委员会批准的(没有41660415.3.0000.5273)。对象的男女年龄超过18岁的迹象全髋关节置换术被邀请捐献丢弃臼骨/骨髓。提供书面知情同意捐出样品后,一个简短的问卷是用来评估血源性感染的风险。捐赠者也被问及之前诊断并发症,如类风湿性关节炎、糖尿病、骨髓发育不良,和恶性肿瘤,免疫抑制剂药物的使用,和任何药物或酒精滥用的历史。如果这些被披露,捐赠者被排除在研究之外。这些选择,进一步的入选标准是应用:一个 ,一个 女性和男性12.5 g / dL(血液donation-ANVISA,引用值RDC号153/2004),和消极的怀孕测试。捐赠者的血液样本还测试了HIV-1/2,乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒核心抗原、丙型肝炎病毒(htlv 1, HTLV-2,巨细胞病毒,结核分枝杆菌,梅毒螺旋体,鲁兹锥体感染。在积极的测试中,供体被排除在研究之外。最终选定的捐助者的数据总结表1。

2.3。总骨髓细胞悬浮液的制备

髋臼的骨头碎片处理后立即收获或最多12 h后存储在2 - 8°Cα最小基本介质(αmem、LGC生物技术、圣保罗、SP,胸罩)补充20%胎牛血清(美国的边后卫,Gibco-Thermo费舍尔,沃尔瑟姆,MA) (37,48- - - - - -50]。样本添加到50毫升管,以及磷酸盐(PBS、Amresco梭伦,哦,美国增加了在1:4 ( )比率。剧烈的机械均化后10毫升吸管(手手按移液器的速度必须设置为高),骨骨针被允许定居,和细胞悬液收集和转移到一个新的50毫升管。新鲜的PBS添加到包含针状体管,在同一比例,第二轮均化。短暂的针状物沉积后,上层的收集和转移到新管。这一步是至少重复三次,直到骨髓的骨头视觉干净。收集骨髓悬浮液的离心分离机 5分钟。离心后,5毫升样品收集上层清液的细菌污染测试。颗粒状细胞resuspendedαmem补充20%的边后卫。确定总有核细胞的数量,一个整除的骨髓悬挂在适当稀释2%冰醋酸为红细胞溶解,随后装载在修改纽鲍尔室细胞计数。

2.4。克隆形成试验(CFE)

估计菌落的数量(CFU-Fs)获得骨髓悬浮液,镀有核细胞密度一式三份 (美国康宁公司合并,纽约,纽约)在2毫升αmem补充20%的边后卫。经过3天的孵化有限公司37°C的5%₂不依从造血细胞被移除,媒介是改变。在第14天,殖民地和4%多聚甲醛固定(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),沾1%结晶紫(Sigma-Aldrich)。殖民地与50多个细胞数(48]。集落形成的效率表示为平均菌落数相对于100000镀骨髓有核细胞。

2.5。BMSC隔离

确定最佳的细胞播种密度对BMSC隔离,有核细胞样本04 resuspended在01 , ,和 在10毫升的αmem补充20%的边后卫和镀一式三份的t - 75厘米²水瓶(康宁合并)。电镀后,细胞被允许坚持3天在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37°C。然后,不依从细胞被移除,PBS的贴壁细胞被洗了三次,和媒介改变了。此后,贴壁细胞被允许增殖额外11天。每3天完成执行交换媒介。在第14天,5毫升整除的培养基收集细菌污染测试。这些细胞被洗两次与PBS和收获重组胰蛋白酶(TrypLE®表达,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)。细胞数量是由手工计数纽鲍尔室。台盼蓝排斥的细胞生存能力评估方法。如果细胞生存能力< 70%,细胞被丢弃,停止了扩张。镀样品05年到14,有核细胞只在 ,和描述的进行隔离。

2.6。大规模的BMSC扩张

大规模的BMSC扩张进行多层细胞工厂,在一个两步的过程37,45]。在第一个扩展周期(通过1-P1),伴着被播种在双层细胞工厂(1264厘米²康宁公司合并)的密度 细胞/厘米²在500毫升的αmem补充20%的边后卫。这些细胞被孵化有限公司37°C的5%₂并允许扩散,直到融合层达到70%。每3天中被改变。估计的融合程度的细胞在细胞工厂,哨兵t - 75厘米²bmsc烧瓶同时播种,并不断地在相同培养条件(37]。在收获过程中,细胞被洗两次与PBS和孵化10分钟150毫升的TrypLE®表达诱导超然。离心后 5分钟,细胞在新鲜的扩张中,计入resuspended纽鲍尔室如上所述。扩张是细胞生存能力< 70%时停止。

第二周期扩张,伴着被播种在个人细胞工厂(6320厘米²康宁公司合并)的密度 细胞/厘米²1.5升的αmem补充20%的边后卫。当细胞融合达到了70%,5毫升整除的培养基收集细菌污染测试,并与PBS细胞被洗两次。10分钟后的孵化TrypLE®Express,收集细胞悬液,稀释1:2 ( )在乳酸林格氏溶液(费森尤斯公司Kabi,巴特洪堡伏尔der Hohe,蒙古包)补充5%白蛋白(Alburex®20日CSL贝林AGB,贝赫那,瑞典文),和离心机 5分钟。细胞球然后洗五次与乳酸林格氏溶液补充白蛋白移除的边后卫蛋白质(0.5%37]。最后,这些细胞被resuspended乳酸林格氏溶液中有5%白蛋白和计算纽鲍尔室。台盼蓝染色细胞生存能力评估。如果细胞生存能力是> 70%,细胞被用于后续的实验或低温贮藏加工。

2.7。人口增加一倍的分析

在每个周期扩张,人口的数量倍增(PD)计算使用公式 ,在这是最后的收获细胞数量和是初始种子细胞的数量。累计通过添加PD PD (cPD)计算₁和PD₂。倍增时间(dT)是由分总细胞扩张所需的时间在天累积PD ( )(51]。

2.8。低温贮藏和存储

总共 bmsc resuspended在1.0毫升的低温贮藏的解决方案组成的5%二甲亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich), 5%的人血清白蛋白,6%羟乙基淀粉溶液(Voluven®,费森尤斯公司Kabi)乳酸林格氏溶液中。cryotubes被放置在室温下的冷冻集装箱先生(耐尔根®,Sigma-Aldrich),并立即转移到-80°C冰箱。隔夜孵化后,瓶被转移到盒子里,储存在液氮罐的汽相。

2.9。冻存细胞的可行性

四、40周后低温贮藏在上述条件下,1瓶从5 BMSC产品(07-11)在水浴解冻37°C。细胞悬液立即被稀释1:10 ( )在αmem补充20%的边后卫和离心机 5分钟。上层清液被丢弃,细胞resuspended 4毫升αmem补充20%的边后卫。死细胞和活细胞的数量是由手工计数纽鲍尔室,用台盼蓝排斥法。

2.10。细菌、内毒素和支原体污染测试

评估最后的BMSC的不育性产品,有氧和厌氧细菌和支原体和内毒素的水平进行评估。有氧和厌氧细菌污染测试,1毫升细胞的培养基收集的骨髓细胞悬液准备和年底P0(隔离)和P2被接种到BD BACTEC™+有氧/ F和BD BACTEC™+厌氧/ F(美国新泽西州正迪金森)文化瓶和孵化了10天。

支原体污染和内毒素水平进行评估与P2培养基检测试剂盒MycoAlert™和LAL Pyrogent™-5000(瑞士巴塞尔Lonza,),分别。测量是按照制造商的协议执行。 支原体和5问题/毫升内毒素(引用值)被认为是负面的。

2.11。量化的牛转铁蛋白

在最后的边后卫蛋白的水平细胞产品是由牛转铁蛋白浓度的量化估计ELISA。洗后细胞的步骤与林格氏乳酸,2毫升样品细胞悬液的收集和测量进行根据制造商的指示(Abnova,台北,TWN)。 (分析的参考价值)被认为是负面的。

2.12。Immunophenotyping

immunophenotypic特征的细胞, bmsc /管是用流式细胞仪组成的缓冲PBS补充1%牛血清白蛋白(BSA,σ)。然后,细胞被孵化30分钟在黑暗中在室温下用以下fluorochrome-conjugated主要抗体:anti-CD90-Percp-Cy5.5, anti-CD73-APC, anti-CD105-FITC, anti-CD146-PE(美国圣地亚哥从BioLegend CA), anti-CD14-FITC (Immunostep、萨拉曼卡、SPA), anti-CD34-FITC, anti-CD45-Percp-Cy5.5(安捷伦DAKO,圣克拉拉、钙、美国),和anti-CD11b-PE(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)。同形像控制IgG2A-FITC, IgG1A-APC、IgG1A-Percp-Cy5.5 IgG1-PE, IgG1-FITC, IgG2A-PE从圣克鲁斯生物技术(所有)。接下来,细胞用流式细胞仪缓冲区和resuspended在300年μL缓冲收购与BD FACSCanto™血细胞计数器(BD生物科学)。数据分析与FlowJo软件(树明星,亚什兰,或者美国)。

2.13。体外成骨分化和冯Kossa染色

bmsc镀的密度 细胞/厘米²在一式三份αmem补充20%的边后卫,让它生长,直到100%汇合。成骨分化诱导了孵化αmem包含10毫米β甘油磷酸盐,5μ10 g / mL抗坏血酸2-phosphate,⁶M地塞米松(所有从σ)补充20%的边后卫21天,和中每3天了51]。评估矿化,单层膜与冯Kossa染色。这些细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟和孵化2%硝酸银(σ)水溶液受光照时40分钟。这些细胞被洗了三次蒸馏水和暴露于紫外线10分钟。井拍摄使用Eclipse TS100倒置显微镜(尼康、东京、日本)。

2.14。体外脂肪形成的分化和油红O染色

bmsc镀如上所述。达到100%的融合后,这些细胞被孵化α包含0.5毫米isobutylmethylxanthine mem, 200毫米吲哚美辛,10⁶地塞米松(σ),10毫米胰岛素(Humulin®,莉莉,圣保罗,SP,胸罩)补充20%的边后卫21天,和中每3天了51]。确认油脂的组成细胞的液泡,伴着固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟,用丙二醇PA (Vetec Quimica,里约热内卢RJ,胸罩),和0.5%油红O孵化解决方案(σ),丙二醇为20分钟。与85%丙二醇两个洗后,这些细胞被拍到使用尼康Eclipse TS100倒置显微镜。

2.15。体外Chondrogenic分化

bmsc resuspended在αmem补充的边后卫的密度为20% 细胞/毫升。一个10μL一滴细胞悬液是放置在每一个在一个u型的96孔板,在5%在37°C的环境有限公司₂30分钟。然后,100年μL (StemPro®chondrogenic介质(热Fischer)被添加到每个。媒介是改变每2天21天(50,52- - - - - -55]。形成micromasses固定在4%多聚甲醛3 h在室温下,嵌入在石蜡,切成5μm部分,沾)或马森的三色的染色(EasyPath,圣保罗,SP,胸罩)根据制造商的指示。使用尼康E600显微镜幻灯片拍摄。

2.16。II型胶原蛋白免疫荧光

确认chondrogenically诱导micromasses II型胶原沉积,5μm石蜡切片获得如上所述,孵化柠檬酸缓冲在96°C (pH值6.0)40分钟。阻止10% BSA 1 h后,一夜之间,部分被孵化在4°C的anti-collagen II型主要抗体(sc - 288887,圣克鲁斯生物技术)稀释1:50 Tris-buffered盐水和1% BSA (TBS)。随后,幻灯片和TBS洗了三次和孵化2 h Alexa萤石546 -共轭二次抗体(生活技术,热Fisher)在室温下在黑暗中。细胞核是沾染了1μg / mL DAPI解决方案(sc - 3598,圣克鲁斯生物技术)。荧光图像获得使用徕卡TCS SP5激光扫描共焦显微镜(徕卡微系统公司位于蒙古包)。

2.17。皮下异种移植试验

评估的体内成骨潜力扩大bmsc, 细胞与30毫克的羟基磷灰石/磷酸三钙粉混合(HA / TCP, Osteoset®T,赖特医疗、阿灵顿TN,美国)在1毫升αmem补充20%的边后卫在1.5毫升管。细胞/ HA / TCP混合是一夜之间在37°C的环境允许沉降和细胞对HA / TCP粒子。然后,上层清液小心翼翼地吸气,15μL(3.2毫克/毫升人体纤维蛋白原和100 U /毫升人类凝血酶(σ)被添加到形成一个纤维蛋白胶(55- - - - - -58]。3 h的孵化后,细胞/ HA / TCP植入收集和皮下移植到旁边的免疫力低下小鼠(米色BALB / cν/ν,金额,圣保罗,SP, BR)年龄在6到8周(50,55]。对于每个BMSC样本,每只老鼠:三个植入移植一个颗粒(负控制)和两个包含细胞;和两只老鼠。手术全身麻醉下进行80 - 100毫克/克与腹腔注射盐酸氯胺酮和甲苯噻嗪10毫克/公斤。12周后,小鼠安乐死的深麻醉,植入物是收获。所有动物程序依法进行指导机构的动物保健和使用委员会(002/2014)。

2.18。植入组织学和免疫组织化学

收获后,植入物在4%多聚甲醛固定24 h在PBS。对于常规组织学,植入物被孵化脱钙10%硝酸(Vetec) 3天,对石蜡包埋处理,切成6μ米部分,沾染了)。

免疫组织化学,植入物在10% EDTA脱钙(σ)8 - 12周和加工石蜡包埋和切片如前所述。一夜之间,部分被孵化与兔子anti-lamin 4°C / C抗体(M00438、博士德,而钙、美国)稀释1:100或用鼠标anti-collagen I型抗体(Abcam,剑桥,英国)稀释1:300。与想象™FLEX 2洗后清洗缓冲(美国DAKO安捷伦,圣克拉拉,CA),部分被孵化与想象FLEX 2 h (DAKO安捷伦)。信号是在设想开发Flex衬底缓冲区包含20μL /毫升DAB-EnVision Flex民建联+色原体(DAKO安捷伦)——3分钟。玻璃幻灯片的图像都是通过数字扫描Aperio CS2扫描仪和透视仪软件(从徕卡生物系统)。

2.19。评估的骨密度ct机

ct机扫描进行使用桌面SkyScan1172扫描仪(力量、布鲁塞尔、贝尔)。从每个样本放在一个植入定制管和裹着纱布抑制4%福尔马林避免收缩。扫描参数如下:4.0μ各向同性像素大小和x射线源与70 kV加速电压和141年μ目前的500μ米艾尔过滤器。样本旋转180°左右他们的纵轴旋转步骤0.4°,1770 ms的曝光时间和帧平均3。每个样本总扫描时间是大约1.2 h。图像重建与NRecon v.1.7.1.0软件使用过滤后的投影算法(力量)。使用CTVox呈现3 d图像软件(力量)。歧视骨从HA / TCP,灰度图像的关键。二值化的阈值选择基于视觉比较原始灰度图像的每个组织切片和二进制图像。二进制样本量化CTAn软件(力量)。

2.20。统计分析

单独和/或表达的价值观/中值,均值。高斯分布是由Shapiro-Wilk和Kolmogorov-Smirnov测试评估。对比组评估通过单向方差分析与图基的多个比较测试或通过Kruskal沃利斯和邓恩的多个比较测试。值≤0.05被认为是重要的。分析与GraphPad棱镜软件(GraphPad软件8.0版本,拉霍亚,CA,美国)。

3所示。结果

3.1。病人和样本特征

骨小梁包含骨髓收集从九个女性和五个男性年龄48岁和75岁之间(表1)。单独使用细胞样本的频率估计的克隆形成试验(CFE)。殖民地从每个样本的平均数是异构的,范围从7.66到48.0 CFU-Fs每100000人(意思是有核细胞 殖民地)。殖民地的大小也不同,平均直径从1.8毫米到9.1毫米(均值 )(表1)。

3.2。优化细胞播种密度对BMSC隔离

确定最优条件改善BMSC隔绝骨髓有核细胞总分数,BMSC样本01-04被播种在三个细胞密度: ,这是使用的密度CFE化验, ,和 (图1(一))。的密度 细胞/厘米²产生更高的bmsc相比,克隆的密度 (图1 (b)),因此是用作BMSC隔离在后续的标准样品。

3.3。伴着制造业

BMSC制造了三个步骤:隔离在t - 75烧瓶(P0),紧随其后的是两轮扩张(图2 -和个人细胞工厂2)。平均BMSC收获t - 75瓶P0年底 细胞(表2)。启动所需的最小的BMSC数量扩张远离所有10骨髓细胞工厂获得样本。平均生存能力的 。

在P1,细胞融合达到70% 天。平均每远离火源的BMSC产量细胞工厂 细胞,平均生存能力 (表2)。再次,所有样品达到所需的最小细胞数量的亚文化。在P2,细胞达到融合 天,平均 细胞每个人收获细胞工厂。生存能力的 。考虑这两个周期的扩张,获得最终的细胞产品所需的总时间 天(表2)。

3.4。分析人口翻倍

采用程序BMSC制造、细胞平均增加了一倍 次P0, 次P1 在P2(表3)。人口翻倍的时间在P0 1.18天,2.37天在P1, P2期间达到了3.10天,在P0相比显著增加(表3)。

3.5。不育伴着产品的分析

证明不育的骨骼样本和bmsc和最终的质量技术过程和整个设施环境,测试有氧和厌氧病原体进行在细胞上清液P0和P2。也没有发现细菌生长(表4)。测试支原体和发热物质也都负(表4)。

3.6。评估动物蛋白含量最终BMSC的产品

的扩张,bmsc与乳酸林格氏溶液洗五次包含0.5%的白蛋白。然后,在最后剩余动物蛋白的水平细胞产品是由牛转铁蛋白的量化评估。所有样品都显示水平高于10 ng / mL的极限值(表4),表明BMSC产品符合GMP条件。

3.7。Immunophenotypic特性和体外分化bmsc的扩大化

描述电池产品,我们首先评估通过流式细胞仪BMSC-related细胞表面标记物的表达。扩大bmsc同质表示CD73, CD90 CD105, CD146和CD34造血谱系标记为负,CD45, CD14、CD11b(表5和补充图1)。接下来,我们评估他们在体外分化潜能。诱导bmsc能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞(图3和补充图2),如图所示的沉积矿化结节与积极的冯Kossa染色(图3 (b)),细胞内脂质积累积极的油红O染色(图3 (c)),胶原蛋白类型II-rich软骨基质马森的三色的染色(显示的数字3 (e)和3 (f))和免疫荧光分析(数据3 (g)- - - - - -3(我))。

3.8。评估体内成骨潜力

来验证是否bmsc最后细胞产品确实保留了能够区分和形成骨体内,细胞皮下移植到免疫缺陷小鼠。植入物的组织学检查发现鼓膜的形成(表9的BMSC产品6)。

骨基质沉积结束了HA / TCP粒子的表面和骨小梁架构(数据4 (b),4 (d),4 (f))。骨细胞被嵌入到新合成矩阵(图4 (b)、箭头)和重组骨髓基质充满了造血细胞(图4 (b)星号)。鼓膜内的人类起源的细胞被证实通过人类核纤层蛋白A / C和I型胶原蛋白检测在编织骨(数字4 (d)和4 (f)和补充图3)。Micro-CT-based BMSC移植(补充图的三维重建4)表明,neoformed骨质密度范围从994年到1946年胡锦涛(Hounsfield单位),这是按照参考密度值描述人类松质与皮质骨(表6)。

3.9。分析低温贮藏条件

最后,为了评估低温贮藏过程的质量,五瓶BMSC很多被解冻后四和40周的存储。细胞生存能力是相似的在两个时间点和不显著不同于低温贮藏时(表可行性百分比7)。

4所示。讨论

因为他们的成骨、免疫调节和angiogenesis-promoting潜力,bmsc已经广泛研究的重点整形外科的临床应用(59]。然而,翻译到床边仍面临重要的瓶颈,一个是缺乏监管和技术共识决定整体条件,应该采用BMSC制造业和化验应该执行为了验证细胞力量(25,26]。从这个意义上说,中心在不同国家采取了自己的程序,导致BMSC的制造业产品独特的基因表达特征和功能的潜力。在巴西,卫生监管卫生机构(ANVISA)提供通用的监管规则建立细胞制造和/或加工设备用于治疗但留给设施的决定应该采用什么技术程序主要组织收集,处理,细胞隔离,扩张,和表征,根据制造细胞的特性。在这个报告中,我们描述了我们程序生成功能验证BMSC的产品符合GMP标准和国家监管政策。

为了有一个参数比较,我们的协议是基于以前的经验NIH BMSC银行(37]。但不同于他们的协议,在细胞的扩张过程中,三个周期(一个在远离火源,两个人细胞工厂),在我们的生产过程中,细胞扩张,只有两个后续轮2 -和个人细胞工厂,分别。另一个区别是骨髓的来源。而不是利用志愿捐献者的骨髓吸入物,我们使用骨小梁丢弃。这个选择的主要原因是在这个初始点我们的目标只是设置和评估程序BMSC制造业在我们内部设施。因为我们被安置在一个骨科医院、骨丢弃从初次全髋置换(那)总是可用,可以不让捐赠者获得任何额外的程序。从先前的研究我们的小组使用bmsc隔绝那模型,这些细胞增殖和分化的能力在体外和体内已经知道50),从而证明其有用性来验证我们的程序。

实际上,单独使用骨髓细胞的数量的样品,CFE的评估分析,在之前报道范围内的《以骨标本8健康成人(48),平均高出三倍比骨髓送气CFE的报道在美国国立卫生研究院BMSC银行手稿(37]。这并不令人惊讶,因为骨髓吸入物通常更污染的外周血,稀释骨髓,减少CFE计数。而且,bmsc被成功分离出所有14个样本。

虽然人口翻倍的时间逐渐增加在扩张可以反射捐助者的年岁总平均细胞产量获得使用只是一个细胞工厂每周期(我们的最小基础设施能力)表明,相当数量的细胞可以产生了与我们的协议,考虑到很多单位 bmsc作为国家卫生研究院提出的设备(37]。保持扩散限制在15 - 20人口倍增(包括隔离和两个扩张周期),细胞产量可以增加通过扩大- 75烧瓶和t细胞的数量工厂相应样品的可用性、细胞产生在每个通道,最大的基础设施能力的基金。显著地,我们没有使用整个那骨细胞隔离丢弃,我们没有目标产生最多的细胞,而是确定细胞在每一步的平均收益率。

因为国际监管组织机构指出,如美国食品和药物管理局(FDA),从动物来源建议试剂时应避免制造细胞为人类使用,因为人畜共患病的风险和异种的免疫反应,已经在这个领域努力确定胎牛血清替代品,如化学定义媒体(60- - - - - -63年],人类血清[64年,激活血小板溶解产物(65年- - - - - -68年]。虽然血小板溶解产物显示诱导BMSC扩散一样有效的边后卫(43,66年),强有力的证据表明,这些BMSC的产品也有类似的功能潜力作为FBS-expanded BMSC迄今为止尚未提供。的确,任正非和他的同事们(65年]表明,替换的边后卫与血小板溶解产物BMSC隔离和扩张导致BMSC具有不同基因和微rna表达谱。虽然FBS-cultured bmsc MAPK表达基因,TGF -β、粘附和细胞外基质通路,bmsc培养与血小板溶解产物表达基因与代谢有关,增殖,细胞周期和免疫反应途径。功能分析与综合这两种产品没有执行(65年]。因此,符合美国国立卫生研究院细胞库所使用的标准协议(37),包括我们的边后卫BMSC隔离和扩张媒体但洗涤步骤最终的细胞产品减少动物蛋白质含量。伴着许多被证明有动物蛋白浓度低于阈值限制美国食品药品监督管理局规定,表明细胞产品没有感染的风险增加,阻碍他们的病人使用。

最后,因为目前没有已知的表型和遗传特性允许潜在的分化能力的确定一个给定的bmsc移植体内一旦人口(69年,70年),在体外实验中被认为有一个高概率的artifactual [49,71年- - - - - -73年),我们建立了体内分化试验作为关键的测试以确定BMSC效力。虽然体内试验需要花几个月的时间来完成并获得结果,它早已被科学家的最有效的方法来评估给定的内在分化潜能的细胞群,因为它允许细胞固有的表达能力没有任何外源化学诱导物(21,49,58,74年,75年]。通过使用这个功能质量控制方法,我们的显示,十有八九的BMSC产品形成骨体内组织学和矩阵微体系结构。此外,骨形成的9个样品,4个开发了一个支持造血基质,这是一个指示器multipotential骨骼干细胞的存在的BMSC人口(20.,49,70年,76年]。因此,我们认为该协议建立了大规模的BMSC制造保存细胞的潜力,从而形成骨体内,我们确认其是否适合未来一代的细胞骨修复策略。这个协议可以同样用于BMSC隔绝任何样本来源。只需要适应如果源样本是骨髓抽出物是调整的初始总有核细胞播种密度BMSC孤立,需要更高的CFE计数减少吸入等。对于这种适应,我们参考读者NIH BMSC银行的报告(37]。

虽然我们已经表明,BMSC隔绝那骨头丢弃可以形成骨体内,这表明这些样本可能是有用的为同种异体BMSC银行使用,我们强调,自体或同种异体细胞的选择应用程序,以及决定最好的骨髓源材料,需要仔细评估案例的基础。因为细胞应用程序本身是超出我们目前的目标,我们没有进行免疫原性和/或HLA兼容性测试,但无论他生的策略的情况下,应该进行这些测试,除了测试了。

5。结论

由于监管规则的实现建立巴西卫生机构设施细胞制造的,一个重要的一步bmsc在骨科的临床使用。然而,定义过程的大规模生产clinical-grade bmsc与验证体内成骨潜力仍然是必要的。在这项研究中,我们描述了协议的一代的BMSC产品认证的表型和容量,从而形成骨体内移植后,将作为内部BMSC的基础制造业未来的临床应用在我们的中心。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的结果中包括文章和文件的补充信息。

的利益冲突

作者指出任何潜在的利益冲突。

确认

这项研究是由国家研究所的创伤学骨科和巴西卫生部。

补充材料

补充图1:immunophenotypic BMSC产品的特征。图一显示代表流式细胞术直方图用于获得细胞表达表面标志的比例问题。在b,它显示的控制策略,同时分析CD73, CD90、CD105, CD146表面标记。补充图2:量化的矿化结节阳性冯Kossa污点,液泡的数量与细胞内脂质积聚油红O,阳性和软骨基质马森的三色的染色阳性。补充图3:消极控制老鼠的免疫组织化学分析显示没有识别胶原蛋白I型和核纤层蛋白A / C的主要旨在识别给定的人类蛋白质的抗体。补充图4:重建骨植入物的ct机。图像显示的对比中产生的微ct图像功能密度、厚度、和x射线的能量,这是用来区分新骨和HA / TCP脚手架。补充表1:列出的所有试剂和材料。(补充材料)

引用

1. a . s . Shekkeris p·k·贾斯瓦尔,w . s .汗“间充质干细胞的临床应用治疗骨折无工会和骨缺陷,”目前干细胞研究和治疗,7卷,不。2、127 - 133年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 傻瓜,s . Gallardo-Villares m维维斯et al .,“临床翻译一个间充质基质细胞的治疗开发的大型动物模型和两个案例研究治疗萎缩性故,“组织工程和再生医学杂志》上,12卷,不。1,pp. e532-e540, 2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. s . Giannotti诉Bottai m . Ghilardi et al .,“治疗上肢的故使用扩展的间充质干细胞:一个试点研究,“欧洲医学和药理科学审查,17卷,不。2、224 - 227年,2013页。视图:谷歌学术搜索
4. m·l·费雷拉·c·席尔瓦·l·h·阿尔瓦雷斯席尔瓦et al .,”不等的间充质干细胞治疗大鼠股骨假关节的成功,”转化医学杂志》,10卷,不。1,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. a . Lebouvier a . Poignard m . Cavet et al .,“开发一个简单的手术治疗股骨头骨坏死与intra-osseous注射骨髓间充质基质细胞:研究的早期biodistribution时间点注射后,“干细胞研究与治疗》第六卷,没有。1,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. y . g . Wang, t .太阳et al .,“peptide-functionalized BMSC亲和力β磷酸三钙支架促进修复股骨头骨坏死的,”矫形外科和研究杂志》上,14卷,不。1,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. i . h . Dilogo a·f·卡马尔谷纳温,和r . v . Rawung“自体间充质干细胞(msc)移植的批评-大小的广泛切除后骨缺损osteofibrous发育不良,”国际期刊的手术案例报告,17卷,第111 - 106页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 渡边n . Harada y, k佐藤et al .,“在大鼠股骨骨再生缺陷通过软骨内骨化实现chondrogenically分化msc可降解支架,”生物材料,35卷,不。27日,7800 - 7810年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. s . Agacayak b . Gulsun m . c .番干预e . Karaoz y Nergiz,“间充质干细胞的影响大小骨缺损严重,”欧洲医学和药理科学审查,16卷,不。5,679 - 686年,2012页。视图:谷歌学术搜索
10. m . Stiehler f p .赛博j . Rauh et al .,”松质骨同种异体移植物播种与人类间充质基质细胞:一个潜在的良好生产practice-grade工具骨再生的缺陷,“Cytotherapy,12卷,不。5,658 - 668年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. p·t·s·勋伯格,j·哈恩et al .,“异种的人类间充质干细胞在移植的关键尺寸缺陷的羊胫骨骨再生,”组织工程部分,16卷,不。1,33-43,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. b . g . Kurkalli o . Gurevitch a . Sosnik d·科恩和s·斯莱文,“修复骨缺损使用骨髓细胞和软化骨基质与高分子材料补充,“目前干细胞研究和治疗,5卷,不。1,49-56,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. l . a .问:a . Teo k . l . Wong沈et al .,“相当于10年期结果自体骨植入后骨髓来源间充质干细胞和自体软骨细胞移植软骨的缺陷的膝盖,“美国运动医学杂志》上卷,47号12日,第2887 - 2881页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. y桥本,y Nishida s高桥et al .,“自体骨移植的骨髓来源间充质干细胞与微裂缝和微裂缝在关节镜下手术仅膝盖关节软骨病变:多中心前瞻性随机对照临床试验,”再生疗法11卷,第113 - 106页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. t·d·出生,a, b . Adesida和n·m·Jomha“关节软骨修复与间充质干细胞后Chondrogenic启动:一个试点研究,“组织工程部分,24卷,不。9 - 10,761 - 774年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. 山崎裕,y桥本,j . Takigami et al .,”效应的直接在透明质酸注射骨髓间充质干细胞和骨髓刺激治疗犬模型,软骨的缺陷”再生疗法,卷2,42-48,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. 贾,t, z, w·潘,j . Liu和w .太阳,“面向体内评价小说scaffold-BMSC构造加强全层关节软骨修复兔模型,”《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。12日,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 山崎裕,h . Mera m . Itokazu y桥本,和s Wakitani“软骨修复自体骨髓间充质干细胞移植:回顾临床前和临床研究,“软骨,5卷,不。4、196 - 202年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. s . Wakitani t·冈s Horibe et al .,“安全的自体骨骨髓来源间充质干细胞移植在41 45患者关节软骨修复之后长达11年零5个月,“组织工程和再生医学杂志》上,5卷,不。2、146 - 150年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. a . j . Friedenstein r·k·Chailakhyan n . v . Latsinik a . f . Panasyuk i v . Keiliss-Borok,“基质细胞负责转移微环境的造血组织,”移植,17卷,不。4、331 - 340年,1974页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. p·比安科,m . Riminucci s Gronthos p·g·罗比,“骨髓基质干细胞:自然,生物,和潜在的应用,”干细胞,19卷,不。3、180 - 192年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. ·比安科·g·罗比Saggio,和m . Riminucci”“间充质”人类骨髓干细胞(骨骼干细胞):一个关键的讨论他们的本性,身份,和意义在无法治愈的骨骼疾病,”人类基因治疗,21卷,不。9日,第1066 - 1057页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. o . Ringden m . Uzunel i Rasmusson et al .,“间充质干细胞治疗therapy-resistant移植物抗宿主病,”移植,卷81,不。10日,1390 - 1397年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 穆勒,s . Kordowich c Holzwarth et al .,“多功能间充质基质细胞在儿科患者中的应用同种异体干细胞移植后,“血液细胞、分子和疾病,40卷,不。1,25-32,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. m . Duijvestein a·c·w·沃斯·h·鲁洛夫•et al .,“自体骨骨髓来源间充质基质细胞治疗难治性腔的克罗恩氏病:第一阶段的研究结果,“肠道卷,59号12日,第1669 - 1662页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. n . Perico f .锁定,大肠Gotti et al .,“间充质基质细胞和肾移植:移植前灌注保护移植物功能障碍,促进免疫调节,”移植国际,26卷,不。9日,第878 - 867页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. a . Skrahin r·k·艾哈迈德·g·费拉拉et al .,“自体间充质基质细胞注入作为辅助治疗耐多药和广泛耐药结核病患者:一个开放的第一阶段安全试验,”《柳叶刀》杂志上呼吸医学,卷2,不。2、108 - 122年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. b·a·汤普金斯·d·l·DiFede a汗et al .,“同种异体间充质干细胞改善老化脆弱:二期随机、双盲、安慰剂对照临床试验,”老年病学期刊:系列,卷72,不。11日,第1522 - 1513页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. p·k·古普塔,A . Chullikana r . Parakh et al .,“双盲随机安慰剂对照I / II期研究的安全性和有效性评估同种异体骨髓衍生的间充质干细胞在危重肢体缺血,”转化医学杂志》,11卷,不。1,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. s . k . Wang洛杉矶绿色:a .德鲁克r . l . Motaganahalli a法和m·p·墨菲”的原理和设计的临床和组织学分析间充质基质细胞在截肢(冠军)试验研究的治疗机制间充质基质细胞在治疗危重肢体缺血,”血管外科杂志》,卷68,不。1,页176 - 181。e1, 2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. j·g·j . Wijnand m . Teraa h . Gremmels et al .,“航行试验的基本原理和设计的肌内注射同种异体间充质基质细胞在危重肢体缺血别无选择,”血管外科杂志》,卷67,不。2、656 - 661年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. h·l·邓问:Peng王et al .,“鞘内注射外源的骨骨髓来源间充质基质细胞在治疗严重缺血性中风患者:随机对照盲法试验研究方案,“平移中风研究,10卷,不。2、170 - 177年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. p . v . Giannoudis、t·a·艾因霍恩和d·马什”骨折愈合:钻石概念”,受伤卷,38 S3-S6, 2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. y渡边:Harada k . Sato美国安倍,k .山中,t .松下,“干细胞疗法:有骨缺损的重建未来?”受伤卷,47 S47-S51, 2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. r·史y黄马c, c .吴和w·田,“目前的进步基于组织工程骨再生策略,”前沿的医学,13卷,不。2、160 - 188年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. n . Fekete m . t . Rojewski d·福斯特et al .,“GMP-compliant隔离和大规模扩张骨骨髓来源MSC,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。8,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. m·萨博迪诺j .问:任诉David-Ocampo et al .,“建立一个银行存储临床骨髓基质细胞产品,”转化医学杂志》,10卷,不。1,p。23日,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. b . Cunha t•阿吉亚尔,s . b .卡瓦略et al .,“人类间充质干细胞生物过程集成:从下游处理扩大细胞蛋白质组特征,“生物技术杂志卷,248年,第98 - 87页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. p . Nold c . Brendel a·纽鲍尔·g·拜因,和h . Hackstein“良好生产practice-compliant动物任意扩张的人类骨髓的间充质基质细胞在一个封闭的hollow-fiber-based生物反应器,”生物化学和生物物理研究通信,卷430,不。1,第330 - 325页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. m . t . Rojewski n . Fekete s Baila et al .,“GMP-compliant隔离和扩张骨骨髓来源msc的关闭,自动化设备系统量子细胞扩张,”细胞移植,22卷,不。11日,第2000 - 1981页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. m . Codinach m·布兰科,奥尔特加et al .,“设计和验证的一个一致的和可再生的制造过程的生产clinical-grade骨骨髓来源多能间充质基质细胞,”Cytotherapy,18卷,不。9日,第1208 - 1197页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. c . Lechanteur煤砖,o . Giet o . Delloye e . Baudoux和y Beguin”Clinical-scale间充质基质细胞的扩张:大型银行的经验,“转化医学杂志》,14卷,不。1,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. 诉Becherucci l . Piccini s . Casamassima et al .,“人类血小板溶解产物间充质基质细胞扩张根据GMP级协议:一个细胞工厂的经验,“干细胞研究与治疗,9卷,不。1,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. a·l·罗素,r . c . Lefavor和a . c . Zubair”特征和成本效益分析的自动化生物反应器扩大了临床应用间充质干细胞,”输血,卷。58岁的没有。10日,2374 - 2382年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. p·g·罗比,s . a .“库兹涅佐夫”j . Ren h . g . Klein m·萨博迪诺和d . f . Stroncek”一代的临床级人类骨髓基质细胞在骨再生,使用“骨卷,70年,第92 - 87页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. y周、t·l·蔡和w·j·李”策略保留骨骨髓来源间充质干细胞的特性体外”,纽约科学院上,卷1409,不。1,3 - 17,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. j .卡门·s·r .汉堡,m . McCaman和j·a·罗利”发展中分析解决身份,效力,纯度和安全性:细胞特征的细胞疗法过程开发,“再生医学,7卷,不。1,第100 - 85页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. s . a“库兹涅佐夫”m . h . Mankani·比安科和p·g·罗比,“枚举的群集型units-fibroblast老鼠和人类骨髓在正常和病理条件下,“干细胞研究,卷2,不。1,第94 - 83页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. p·g·罗比,s . a .“库兹涅佐夫”m . Riminucci p·比安科,“骨髓基质细胞化验:体外和体内,”骨骼发育和修复m·希尔顿,艾德,1130卷分子生物学方法胡玛纳出版社,页279 - 293年,风险中,新泽西,美国,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. v . f . Vianna特区Bonfim, a·s·卡瓦尔康蒂et al .,“晚附着人体骨髓基质细胞形成骨骼和恢复造血微环境在活的有机体内”,生物医学研究的国际ID 790842条,卷。2013年,11页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. d . c . Bonfim r·b·迪亚斯a Fortuna-Costa et al .,“PS1 / _γ_ -Secretase-Mediated钙粘着蛋白乳沟诱发_β_连环蛋白核易位和人类骨髓基质细胞的成骨分化,“干细胞国际ID 3865315条,卷。2016年,14页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. m·贾马尔s . l . Lewandowski m·l·劳顿·g·t·j·黄和l . Ikonomou”中推导和描述的颅面间叶细胞祖细胞被公认为人类诱导多能干细胞”干细胞研究33卷,第109 - 100页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. 洛杉矶Solchaga、k . j . Penick和j . f .翻滚”Chondrogenic骨骨髓来源间充质干细胞的分化:提示和技巧,“分子生物学方法卷,698年,第278 - 253页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. d . Nasrabadi s Rezaeiani m . b . Eslaminejad和a .大家“改进协议chondrogenic分化的骨髓间充质干细胞衍生效应的PTHrP TGF FGF-2β1 / BMP2-induced软骨细胞肥大,”干细胞的评论,14卷,不。5,755 - 766年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
55. f . c . Vallim j . a . m .吉马良斯r·b·迪亚斯et al .,“萎缩性骨不愈合基质细胞形式并重新创建体内骨髓环境,”骨科创伤国际,1卷,不。3,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
56. p . Janicki·卡斯滕k . Kleinschmidt r . Luginbuehl和w·里希特,”Chondrogenic pre-induction人类间充质干细胞βtcp:增强骨骼质量通过软骨内异位骨形成,”Acta Biomaterialia》第六卷,没有。8,3292 - 3301年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
57. j .织锦p . Janicki p·沃尔兹et al .,自己作些“劣质的间充质基质细胞异位骨形成脂肪组织相比骨髓:救援的chondrogenic pre-induction,”干细胞研究,11卷,不。3、1393 - 1406年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
58. m·h·Mankani s a“库兹涅佐夫”g .•马歇尔(george w . bush)和p·g·罗比,“创建新骨的经皮注射人类骨髓基质细胞和HA / TCP停赛,“组织工程部分,14卷,不。12日,第1958 - 1949页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
59. r . m . Samsonraj m .热心诉Nurcombe j . h .回族a . j . van Wijnen和s . m .酷,”简明点评:多方面的特征的人类间充质干细胞在再生医学中使用,“干细胞转化医学》第六卷,没有。12日,第2185 - 2173页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
60. l . g .追逐Lakshmipathy,洛杉矶Solchaga, m . s . Rao和m . c . Vemuri”小说无血清培养基在人类间充质干细胞的扩张,“干细胞研究与治疗,1卷,不。1,p。8日,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
61. l . Solmesky s Lefler j . Jacob-Hirsch s Bulvik g . Rechavi和m . Weil,“无血清培养的骨髓间充质干细胞作为一个平台来描述特定分子的影响,“《公共科学图书馆•综合》,5卷,不。9日,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
62. j . van der Valk d Brunner k·迪斯美特et al .,“优化化学定义在哺乳动物细胞培养媒体——替换胎牛血清_in vitro_方法,”毒理学体外,24卷,不。4、1053 - 1063年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
63. 美国Mimura:木村,m . Hirata et al .,“增长factor-defined培养基对人类间充质干细胞,”国际发育生物学杂志》上,55卷,不。2、181 - 187年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
64. m·西米诺r . m . Goncalves e·鲍曼et al .,”优化的使用一个制药级韩国帝王免费媒介的人类间充质干细胞的体外扩张/基质细胞,”组织工程和再生医学杂志》上,12卷,不。3,pp. e1785-e1795, 2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
65. j . Ren d·沃德,美国Chen等人“比较人类的骨髓基质细胞培养在人类血小板生长因子和胎牛血清,”转化医学杂志》,16卷,不。1,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
66. g·斯托·e·阿玛蒂,f .小鹿斑比et al .,“血小板溶解产物代替动物血清对间充质干细胞的体外扩张/基质细胞:现在和未来,“干细胞研究与治疗,7卷,不。1,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
67. m·t·Rojewski r . Lotfi c Gjerde et al .,“翻译的标准化生产协议间充质基质细胞:一个系统的比较,验证和制造业数据,”Cytotherapy,21卷,不。4、468 - 482年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
68. k . Bieback“血小板溶解产物替代胎牛血清在间充质基质细胞培养,“输血医学和血疗法,40卷,不。5,326 - 335年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
69. b . j .剑吉泽章,p . j . Mishra et al .,“分子克隆株的人类骨骼干细胞/祖细胞有不同的效力,”干细胞研究,14卷,不。3、297 - 306年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
70. p·比安科和p·g·罗比骨骼干细胞。”发展,卷142,不。6,1023 - 1027年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
71. p·g·罗比”、“间充质干细胞”:事实还是虚构,和影响治疗使用,“F1000Research》第六卷,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
72. d d Diascro Jr .) r·l·沃格尔t . e . Johnson et al .,“兔血清脂肪酸含量高是负责成骨细胞的分化成脂肪细胞的类细胞,”骨和矿物质研究杂志》上,13卷,不。1,第106 - 96页,1998。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
73. l . f . Bonewald s e·哈里斯,j .伐木工人et al .,”冯Kossa染色本身并不足以确认矿化在体外代表骨形成。”钙化组织国际,卷72,不。5,537 - 547年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
74. s . a“库兹涅佐夫”p h . Krebsbach k Satomura et al .,“Single-colony派生的人类骨髓间质成纤维细胞形成骨移植体内后,“骨和矿物质研究杂志》上,12卷,不。9日,第1347 - 1335页,1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
75. p h . Krebsbach s . a .“库兹涅佐夫”·比安科和p·g·罗比,“骨髓基质细胞:特性和临床应用,”口腔生物学和医学的关键评论,10卷,不。2、165 - 181年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
76. b . Sacchetti a . Funari s Michienzi et al .,“自我更新osteoprogenitors在骨髓血窦可以组织一个造血微环境,”细胞,卷131,不。2、324 - 336年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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