本地应用程序的Semaphorin 3结合脂肪干细胞表和无机的牛骨颗粒增强2型糖尿病大鼠的骨再生

文摘

骨组织再生被认为是骨质流失的最优解。然而,糖尿病患者有更大的风险比刻意可怜的骨愈合或骨移植失败。本研究的目的是探讨影响复合物的脂肪干细胞表(ASC表)和Bio-Oss®骨颗粒在骨愈合2型糖尿病(T2DM)病人体内大鼠的semaphorin 3 (Sema3A)。老鼠比对ASC ASC表显示成骨的能力更强在体外,由细胞外基质矿化表示和osteogenesis-related基因的表达在mRNA水平。一个ASC表结合Bio-Oss®骨颗粒促进骨形成在2型糖尿病大鼠的microcomputed断层扫描(ct机)和组织学分析。此外,Sema3A促进了ASC的成骨分化在体外和地方注入Sema3A促进2型糖尿病老鼠的颅顶的骨再生根据ASC表和Bio-Oss®骨颗粒复杂的治疗。总之,当地注入Sema3A和ASC表的复合物和Bio-Oss®骨颗粒可以促进骨性愈合,可能有助于改善2型糖尿病患者骨愈合。

1。背景/介绍

骨再生骨缺陷是一个挑战患者2型糖尿病(T2DM)病人体内。糖尿病患者更有可怜的骨愈合或骨移植失败的风险比刻意(1- - - - - -3]。成千上万的人患有糖尿病,和中国有世界上最多的糖尿病患者(4];因此,有一个高需求改善牙槽骨缺损的治疗2型糖尿病患者。除了传统的像自体组织移植,移植、异种移植、干细胞组织工程骨已成为一个全新的和潜在治疗骨愈合。等多种msc、骨髓间充质干细胞(bmsc) [5(对asc)[],脂肪干细胞6),人类脐带间充质基质细胞(7),而人类牙周韧带干细胞(PDLSCs) [8)被用来改善糖尿病患者的骨愈合。有很好的自我更新能力也有multipotential能力,是十分充裕,不太可能导致donor-associated发病率(9- - - - - -11];因此,他们提供承诺用于骨组织工程的种子细胞。研究已经证明对asc的本地应用程序可以提高骨再生在2型糖尿病模型12,13]。然而,2型糖尿病会影响生物学特性和成骨细胞的分化msc的许多因素(14,15]。应采取措施提高成骨的能力对asc的2型糖尿病。细胞片工程是最有前途的方法之一,近年来组织工程。它可以完全保留培养细胞,细胞外基质(ECM),和和cell-ECM连接,避免了使用酶(16]。Semaphorin 3 (Sema3A)是Semaphorin家族的一员。研究表明,Sema3A可以促进成骨分化和抑制破骨细胞分化,除了神经系统发展的重要作用和治疗(17,18]。我们之前的研究表明,过度的Sema3A对asc显著增强对asc的成骨的能力(19]。Bio-Oss®骨颗粒是广泛用于无机的牛骨替代品诊所由于osteoconductivity和良好的生物相容性20.,21]。为了弥补他们的贫穷osteoinductivity, Bio-Oss®骨颗粒可以作为支架结合msc。本研究评估脂肪干细胞的成骨的能力表(ASC表)在体外。ASC床单和Bio-Oss®骨颗粒被用于制造组织工程骨和应用于2型糖尿病大鼠。我们发现ASC床单成骨的能力很强能促进骨愈合的2型糖尿病模型。此外,当地注入Sema3A可能进一步改善2型糖尿病模型的骨再生。我们的研究显示,组织工程骨成立于使用一个ASC, Bio-Oss®骨颗粒,以及骨再生Sema3A持有一种很有前途的方法。

2。材料和方法

2.1。动物

所有动物实验程序依法进行了实验动物保健和福利委员会委员会的指导方针,,口腔医学院第四军医大学,中国。前不久Sprague-Dawley老鼠对asc用于隔离。八周大的雄性SD大鼠被购买了诱导2型糖尿病模型,然后用于动物实验。动物是维持在特定的无菌条件下12 h光/暗周期提供高脂肪饮食,在26°C,湿度30 - 70%的整个研究。

2.2。隔离和表征的脂肪干细胞(对asc)

被执行的颈椎解剖后,老鼠淹没在70%乙醇为5分钟。腹股沟脂肪垫是在无菌条件下获得的。洗后用磷酸盐(PBS)(美国Gibco),新鲜的脂肪组织被剁碎成酱,消化在同等体积的0.1%胶原酶I型(美国Sigma-Aldrich) 37°C 40分钟,过滤和无菌不锈钢筛(75μ米网)。滤液在1200转离心5分钟,在10毫升PBS resuspended,再次离心。在完全培养基培养细胞组成的α最小重要媒体(αmem)(美国Gibco), 10%胎牛血清(四季青,中国),和1%的青霉素和链霉素(美国HyClone)和孵化在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂和95%的空气。细胞的3被用于后续实验。

确定对asc的multilineage分化能力,这些细胞被镀在six-well文化板块和培养基是改变成骨的或脂肪形成的媒介融合当细胞达到80%。论述中准备使用αmem(美国Gibco)补充10%的边后卫(四季青,中国),0.1毫米地塞米松(美国Sigma-Aldrich), 5毫米β甘油磷酸酯(美国Sigma-Aldrich), 50μg / mL L-ascorbic酸(美国Sigma-Aldrich),和1%的青霉素和链霉素(美国HyClone)。脂肪形成的介质组成的αmem(美国Gibco)包含10%的边后卫(四季青,中国),1%青霉素和链霉素(美国HyClone), 0.5毫米3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX、法国),1μM地塞米松(美国Sigma-Aldrich), 0.1毫米消炎痛(美国Sigma-Aldrich)和10μg / mL胰岛素(美国Sigma-Aldrich)。成骨的或脂肪形成的感应中每3天了。对asc的钙沉积被茜素红染色可视化(美国Sigma-Aldrich)成骨诱导后28天,而脂滴被油红O染色显示(美国Sigma-Aldrich)脂肪形成的诱导后14天。

2.3。对asc Immunophenotype的

一些 第三段对asc和4%多聚甲醛固定15分钟,然后用藻红蛋白孵化- (PE)或异硫氰酸荧光素(FITC)共轭对老鼠CD34单克隆抗体(研发系统、美国),CD44(美国圣克鲁斯生物技术)、CD45(美国eBioscience)和CD90(美国eBioscience)在室温下1 h,然后在黑暗中在4°C。对asc标记评估使用流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特)。单克隆抗体CD44-PE和CD90-FITC被用来识别间质表型,CD34-PE和CD45-PE应用排除造血和血管生成血统。

2.4。捏造ASC表

第三代对asc被播种 在6-well盘子。达到约90%融合后,细胞基底介质改为单感应介质,组成的αmem(美国Gibco), 10%牛胎儿血清(四季青,中国),1%青霉素和链霉素(美国HyClone)和50毫克/毫升维生素C (Kehao,中国)。培养了7到10天也和营养液是每2到3天更换一次。当卷曲边缘出现在板边缘,整个细胞表与刮刀或镊子剥落。ASC表总是脱皮过程中保持湿润。

2.5。骨生成的能力对ASC和ASC表

为在体外成骨变异分析,ASC组和ASC表组都开始用 播种在6-well盘子。ASC组osteoinducted一旦细胞融合达到90%,而ASC表组osteoinduced后7天细胞表归纳。论述中准备使用αmem(美国Gibco)补充10%的边后卫(四季青,中国),0.1毫米地塞米松(美国Sigma-Aldrich), 5毫米β甘油磷酸酯(美国Sigma-Aldrich), 50μg / mL L-ascorbic酸(美国Sigma-Aldrich),和1%的青霉素和链霉素(美国HyClone)。

2.5.1。骨染色

两组受到高山染色(Leagene,中国)7天的成骨诱导和茜素红染色(美国Sigma-Aldrich) 28日一天。结果观察和记录的数码相机(尼康、日本)。

2.5.2。实时RT-qPCR

在成骨分化的第七天,相对mRNA的表达碱性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白2 (BMP2)、骨钙素(OCN), runt-related转录因子2 (Runx-2)在ASC组和ASC组决定。提取的总RNA对ASC和ASC表使用试剂盒试剂(美国英杰公司)根据制造商的协议。量化后的光密度测量,1μg总RNA转化为互补使用PrimeScript™RT试剂盒(豆类、日本)。rt - PCR进行使用SYBR预混料交货Taq™II工具包(豆类、日本)在定量PCR系统(美国Bio-Rad)在下列情况下:3分钟95°C的变性40轮10年代95°C的退火和30年代的扩展60°C。本研究中使用的引物在表列出1;GAPDH是监控作为看家基因。评价结果CFX96™rt - pcr系统(美国Bio-Rad)。

2.6。体外成骨与Sema3A ASC床单

ASC隔离和ASC表制作的过程与上面提到的相同。一张7天细胞诱导后,ASC床单被处理论述媒介如上面所提到的有或没有1μg / mL Sema3A(美国PeproTech)。治疗组被命名为对照组和Sema3A组。高山染色茜素红染色,以及osteogenesis-related基因表达进行了测试如上所述。

2.7。诱导2型糖尿病大鼠模型

高脂肪饮食有69.5%基础饲料,10.0%蔗糖、10.0%蛋黄颗粒,0.5%胆固醇,10.0%猪油(第四军医大学实验动物中心)4周和一个低剂量(30毫克/公斤)的链脲霉素(STZ)通过腹腔内注射接种大鼠诱导2型DM模型如前所述[22]。7天注射STZ后,血液收集的尾巴切测试随机血糖水平(pgl)使用一个。老鼠PGL高于16.7 L更易被认为是糖尿病患者,但PGL低于此值被排除在实验。

2.8。植入物的特性和制备

2.8.1发布。ASC +骨颗粒复杂

生物膜(万灵药,中国)切成 方格。Bio-Oss®骨颗粒(0.02 g)(瑞士Geistlich)加载在生物膜上。 对asc是掉在骨骼颗粒和cocultured(图4小时1(一)- - - - - -1 (c))。

2.8.2。ASC表+骨颗粒复杂

对ASC被播种到60毫米培养皿和诱导ASC表如前所述7天。然后,0.02 g骨颗粒(瑞士Geistlich)均匀混合与每个ASC表1.5毫升EP管(数据1 (d)- - - - - -1 (f))。

2.8.3。扫描电子显微镜(SEM)观察两个复合物

两种复合物的表面形态观测到JEOL地产- 6700 f场发射扫描电镜(JEOL有限公司、日本)。

2.9。两个配合物在2型糖尿病大鼠的植入

总共20大鼠2型糖尿病患者随机分为两组( ):ASC +骨粒组和ASC表+骨粒组。动物麻醉的腹腔内注射2%戊巴比妥钠溶液(美国Sigma-Aldrich)(0.25毫升/ 100克体重)。剃须和灭菌后,5毫米批评-大小的颅顶的缺陷(CSD)仔细钻渗透通过颅顶的骨头而不损伤硬脑膜。csd随机充满了两组不同的复合物。复合物被放置在硬脑膜和覆盖 生物膜(万灵药,中国)。骨膜和皮肤与4 - 0分别缝合的针脚缝合。抗生素基于体重管理连续3天手术。愈合过程是4或8周,然后老鼠安乐死注射了过量的麻醉剂。颅顶的标本被收获,2天在4%多聚甲醛固定,由microcomputed断层扫描(ct机)和组织形态学分析。

2.10。ct机扫描

微CT扫描仪(Inveon CT、西门子、德国)是用来扫描样品的扫描分辨率56μm评价骨形成csd的2型糖尿病大鼠。三维模型重建ct机扫描数据集的骨形成的定量分析在csd(数字2(一个)和2 (d))。感兴趣的区域(ROI)被定义为一个圆柱体的半径5毫米和1毫米的高度(约颅顶的骨的厚度)的手术区域。Inveon研究职场软件包版本2.2.0(德国西门子医疗GmbH,埃朗根)是用于图像的三维重建和数据分析。组织CT值在700 - 2000年间Hounsfield单位(胡)被定义为新骨(图2 (b))。组织CT值高于2000胡锦涛被定义为Bio-Oss®骨颗粒(图2 (c))。骨体积/总量(BV /电视),小梁厚度(Tb.Th),小梁(Tb.N)数量,小梁间距(Tb.Sp)计算。

2.11。Histomorphologic分析

颅顶的标本在17% EDTA脱钙37°C孵化器20 - 30天,直到骨组织变得柔软,很容易混入了针头。EDTA是每周更换2次。在石蜡包埋后,代表日冕部分被苏木精和伊红染色(他)。使用立体显微镜观察的部分(奥林巴斯公司(日本东京)。

2.11.1。血管计数

从每个样本三个HE-stained部分被选中。三个字段被随机选中的每个部分和血管的数量统计在放大40倍。计算平均价值。

2.12。在2型糖尿病大鼠骨愈合Sema3A

总共20大鼠2型糖尿病患者随机分为两组( ):对照组和Sema3A组。csd是钻渗透通过颅顶的骨头和充满ASC表+骨颗粒复杂如上面所提到的所有的老鼠。老鼠接受了当地注入Sema3A (100μ20克/毫升无菌生理盐水,μ克/公斤)到手术网站Sema3A组或车辆(无菌生理盐水),对照组1日,4日,第七天。所有的动物安乐死4或8周后注射了过量的麻醉剂。样本收集并通过ct机和组织形态学检查。上述过程是一样的。

2.13。统计分析

所有实验至少重复三次,结果显示为 。比较被学生的表现 - - - - - -测试或单向方差分析LSD -紧随其后 - - - - - -测试或Games-Howell测试使用SPSS 19.0 (SPSS Inc .)、美国)。意义被视为值< 0.05。

3所示。结果

3.1。对asc的表征

主要对asc的文化成为殖民地与纺锤状形态(图3(一个))。细胞群似乎更均匀的第三段(P3,图3 (b))。成骨的文化中,钙结节茜素红染色(图3 (c))。在脂肪形成的文化中,细胞间脂质空泡是沾油红O(图3 (d))。对asc MSC标记CD44阳性( )和CD90 ( )但消极CD34造血和血管生成标记( )和CD45 ( )(图3 (e))。

3.2。对ASC的成骨分化和ASC表

高山染色结果表明,ASC表后成骨诱导对ASC更深的颜色超过7天(图4(一))。领域的矿化结节ECM的ASC床单成骨诱导后28天明显增大,对ASC密度比(图4(一))。

在成骨分化的第七天,高山的相对mRNA表达,BMP2, OCN、功能和Runx2 ASC表是高于ASC组(图4 (b))。两组数据的统计学意义( )。

3.3。体外成骨与Sema3A ASC床单

评估Sema3A在成骨分化的影响,ASC表与Sema3A处理论述媒介。高山活动和沉积钙化的细胞外基质增加,被高山染色和茜素红染色结果(图5(一个))。此外,成骨的标记的mRNA水平,包括高山,BMP2, OCN,功能,Runx2 Sema3A组明显高于后7天成骨的推论(图有用5 (b))。所有这些结果证实Sema3A显著增加ASC的成骨的能力表在体外。

3.4。扫描电镜观察两种复合物

对ASC的ASC +骨颗粒复杂,坚持严格的Bio-Oss®骨颗粒通过突出预测表面的骨颗粒(数字6(一)和6 (b))。在ASC表+骨颗粒复杂,对ASC许多人口稠密的ASC和丰富的细胞连接板之间的观察细胞(数字6 (c)和6 (d))。在同样的放大倍数下,ASC表+骨颗粒复杂的包含更多的细胞。

3.5。骨整合不同类型的组织工程骨在2型糖尿病大鼠

3.5.1。ASC表+骨粒组和ASC +骨粒组

(1)大鼠身体健康。所有的老鼠都成功地建模。2型糖尿病大鼠的平均血糖 ,和平均体重 手术前。血糖稳定在整个实验过程。所有的动物都活了下来,没有一个在实验感染的迹象。

(2)微ct分析。微ct三维图像显示巨大的两组(图新形成的骨7(一))。更多的新骨在ASC表+骨粒组比ASC +骨粒组。所有BV /电视,结核病。Sp,结核病。N,结核病。Th统计不同( )两组之间除了BV和结核病/电视8周。在4周(图7 (b))。结果表明,新骨形成是显著提高在ASC表+骨粒组。

(3)csd内新骨的组织学分析。进一步调查csd中的新形成的骨,组织学分析使用他在光学显微镜(图染色8(一个))。大量的活跃的成骨细胞和编织骨观察两组骨颗粒。观察新骨只有大约的csd ASC +骨粒组,而新骨开始成长为集合中央区域表+骨粒组4周。在8周,与骨重建更明显的差异。在ASC表+骨粒组,更成熟的新骨逐渐从边缘到中心的csd,和骨的岛屿和桥梁被观察到在csd的中心。此外,更多的血管观察ASC表+骨粒组比ASC +骨粒组(图8 (b))。

3.5.2。Sema3A组和对照组

(1)大鼠身体健康。所有的老鼠都成功地建模。2型糖尿病大鼠的平均血糖 ,和平均体重 手术前。血糖稳定在整个实验过程。所有的动物都活了下来,没有一个在实验感染的迹象。

(2)微ct分析。微ct三维图像显示巨大的两组(图新形成的骨9(一个))。更多的观察新骨Sema3A组比对照组。在8周,骨颗粒的形态是模糊和新骨几乎完全充满了Sema3A组骨缺损区。除此之外,更多的红色区域Sema3A组建议新骨矿化的程度也更高。BV /电视,结核病。N,结核病。高和结核病。Sp并不Sema3A组(图9 (b))。结果表明,Sema3A显著改善2型糖尿病模型的新骨形成。

(3)csd内新骨的组织学分析。在4周,骨的岛屿被观察到中心的csd Sema3A组,而观察新骨仅在csd的空白对照组。在8周,新骨Sema3A组厚和不断融合,几乎完全覆盖骨缺损区(图10 ())。少血管观察Sema3A组在4周时差异不显著(图8周10 (b))。

4所示。讨论

不少T2DM病人患有骨愈合受损(1)和骨移植失败(2),这通常是与成骨分化的抑制msc (14),从而成为一个至关重要的问题阻碍msc患者2型糖尿病的临床应用。在这项研究中,我们发现,ASC表保存更多的细胞,对ASC成骨的能力比在体外。重要的是,基于关键颅顶的缺陷修复的2型糖尿病模型,我们证明ASC表提高骨再生在活的有机体内。我们进一步证实Sema3A显著增加的成骨的能力ASC表在体外和在活的有机体内。综上所述,我们的研究强调了骨组织工程的有前途的影响根据ASC床单,Bio-Oss®骨颗粒,和Sema3A在骨愈合2型糖尿病模型。

在骨组织工程中,传统的播种方法msc支架上的细胞往往导致一个巨大的损失。为了解决这个问题,我们加载支架在播种时生物膜干细胞在一项研究13未能连接到支架),细胞可以遵循下面的生物膜,最大化利用干细胞在活的有机体内。然而,仍然是有限的,准备复合物的影响与特定的生物膜很难调整骨缺陷形状不规则的诊所。组织工程的细胞板技术是另一种方法,结合细胞紧密在一张通过鬼屋方面的文化形式23],电子束辐照[24)、机械方法(25),或维生素C [26)应用程序,以防止细胞损失,提供了一个理想的微环境,并获得一定程度的机械强度的种子细胞通过保护细胞表面蛋白质和ECM尽27]。因此,在本研究中我们使用电池片技术。

考虑到价格低廉,操作方便,满意film-inductive效果,我们构造的ASC表与维生素C在这项研究。在成骨的实验中,ASC表显示更好的成骨能力增强的高山活动,更多的钙沉积,osteogenesis-related基因的表达水平升高。这些研究结果声称的积极影响对asc的骨生成细胞表,就像已经证明许多其他msc包括bmsc和PDLSCs [16,28]。

干细胞的床单现在一般用作骨膜,包装支架修复骨缺损(29日- - - - - -34]。然而,细胞不能均匀地分布在支架用这种方法,这个方法osteoinductivity限制。在这项研究中,我们彻底混合ASC床单和Bio-Oss®骨颗粒在EP管以确保对ASC存在缺陷和完整的ASC表法的中心作为一个整体联系主人的骨组织。SEM结果表明,ASC表+骨颗粒复杂完美的保证对ASC的数量,细胞间连接,和cell-ECM连接。这可能会促进细胞信号,从而促进细胞分化和新骨形成。此外,复合物可以满足骨缺损不同的大小和形状在诊所只有通过调整骨骼颗粒和细胞的数量表中操作。我们的研究提供了一种新策略效率高和方便执行只有混合细胞表和骨组织工程支架颗粒在手术过程中,这是非常实用的,当应用于诊所。

许多在体外和在活的有机体内研究表明,Sema3A可以促进成骨分化和新骨形成35- - - - - -38]。Sema3A骨质疏松模型有很好的疗效,皮质骨缺损模型(17),河鼠骨质疏松性骨折模型(39),能促进骨再生,增加骨密度,减少受伤部位的骨质流失。机制可能是Sema3A绑定到neuropilin-1 (Nrp1)受体激活β通过Wnt /连环蛋白,促进骨生成β连环蛋白信号通路(17]。此外,哈亚希等人证实,Sema3A像功能,还与OPG-deficient老鼠对破骨细胞的形成有抑制作用;这可能是由于这一事实的绑定Sema3A通过干预ITAM Nrp1抑制破骨细胞分化和RhoA通路17]。与先前的研究一致,我们组显示Sema3A的刺激可以促进成骨的能力的ASC表7天感应所披露的改进的ECM矿化和更高的osteogenesis-related基因的表达。此外,在体外研究进一步证实Sema3A的成骨的作用在2型糖尿病模型。值得注意的是,Sema3A组相对较少的新血管手术后4周与对照组相比。这可能与这一事实有关受体NRP-1由Sema3A共享和血管内皮生长因子(VEGF)。许多肿瘤的研究表明Sema3A与VEGF受体NRP-1,竞争抑制VEGF-mediated血管生成,从而进一步抑制经济增长,入侵和转移的肿瘤(40]。然而,手术后8周,不同数量的两组之间没有明显的血管。可能的机制可能是Sema3A注入上本地天1,4,5月7日下降随着时间的流和自分泌或旁分泌VEGF对asc在后期可能会增加。

目前的研究表明,ASC床单和Bio-Oss®骨颗粒复杂结合当地注入Sema3A通络条件下可以极大地促进骨愈合。

5。结论

我们的研究发现,老鼠对ASC ASC床单成骨的能力进一步增强在体外。ASC表结合Bio-Oss®骨颗粒促进2型糖尿病大鼠的骨形成。此外,Sema3A促进了ASC的成骨分化在体外和地方注入Sema3A促进2型糖尿病老鼠的颅顶的骨再生根据ASC床单和Bio-Oss®骨颗粒复杂的治疗。我们的研究提供了一种新策略与效率高、方便进行骨组织工程只有与脚手架颗粒混合细胞表。此外,骨组织工程根据ASC表结合当地注入Sema3A提供了一个有前途的战略在T2DM病人修复骨缺损。

缩写

对asc:	脂肪干细胞
ASC表:	脂肪干细胞表
2型糖尿病:	2型糖尿病
伴着:	骨髓间充质干细胞
PDLSCs:	牙周韧带干细胞
PBS:	磷酸盐
αmem:	α最小至关重要的媒体
高山:	碱性磷酸酶
体育:	藻红蛋白
FITC:	异硫氰酸荧光素
功能:	Osteoprotegerin
BMP2:	骨形成蛋白2
OCN:	骨钙素
RUNX-2:	Runt-related转录因子2
STZ:	链脲霉素
CSD:	批评-大小的颅顶的缺陷
ECM:	细胞外基质
哈:	羟磷灰石
ct机:	Microcomputed断层扫描
投资回报:	感兴趣的区域
胡:	Hounsfield单位
BV:	骨体积
电视:	总体积
Tb.Th:	小梁厚度
Tb.N:	小梁的数量
Tb.Sp:	小梁间距
Sema3A:	Semaphorin 3
VEGF:	血管内皮生长因子。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们感谢组织工程研发中心,第四军医大学(西安,中国)技术援助。我们表达我们的感谢温博士歌的假牙修复术,第四军医大学口腔学院的批判阅读手稿。这项研究得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金委)(格兰特数字81771107,81771107,81170984,81271579,,81300918)。作者承认组织工程研发中心的同事,第四军医大学的帮助和支持。

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