增加神经元分化效率高细胞Density-Derived诱导多能干细胞

文摘

人类多能干细胞(hPSCs),包括诱导多能干细胞(万能),提供生理和疾病条件下难以获得的细胞研究。对神经退行性疾病的研究,尤其是零星的“病”可能被限制的情况下向neuroectodermal血统,获得影响神经元必须解开这个潜在的分子机制导致的疾病。虽然万能干细胞的分化神经血统允许收购感兴趣的细胞类型,技术患有低效率导致低收益率的神经元。在这里,我们研究了成年neuroprogenitor细胞的潜力(aNPCs) iPSC推导和可能的混杂因素如感染的细胞密度npc在其随后的神经分化潜力重新编程细胞同基因的条件下。hiPSCs特征定义细胞密度产生aNPCs受到神经元对乙烯-基质细胞分化。结果表明,hiPSC从播种密度低(iPSC-aNPC获得的克隆_低)分化效率更高的密度(iPSC-aNPC相比_高)。我们的发现可能有助于进一步提高神经元的产量和品质在体外神经退行性疾病的造型。

1。介绍

神经退行性疾病的细胞和分子属性的研究是有限的访问病变细胞的不足。从影响个人获得细胞或组织不仅是高度侵袭性,通常会导致死亡的神经元,而且由于这些特定病人的细胞在疾病的晚期,这进一步限制了对发病机制的理解。人类胚胎干细胞(为)已被证明有效功能分化成神经元和神经胶质的方式类似在活的有机体内开发(1- - - - - -4]。这些细胞已经被提议作为调查工具的神经系统疾病。人类诱导多能干细胞(hiPSCs) hESCs-like细胞,已成为一个替代来源,克服缺点的为其缺乏个人的疾病状况,从而允许直接检查病变细胞的病理研究和药物筛选(审核通过(5,6])。

人类最初来自皮肤成纤维细胞的细胞则通过一套核心多能转录因子(7]。从那时起,研究包括使用不同体细胞开始细胞来源,transgene-free方法,减少或更换的转录因子进行提高hiPSCs生成的质量(8- - - - - -13]。尽管其多能自然,出现的一些基本问题(1)hiPSCs是否能有效区分成目标细胞谱系,如神经细胞和(2)如果这些iPSCs-derived细胞功能。胡等人进行了这项研究,他们比较hiPSCs的神经分化潜力,为揭示hiPSCs经历相同的时间进程和转录网络为其在神经分化。此外,他们表明hiPSCs可以接受神经gliogenesis生成功能的神经元和神经胶质在体外(14]。本研究进一步表明hiPSCs为再生医学的价值本质。

尽管神经元来自hiPSCs的供应,包括针对疾病的神经元,是无限的,分化效率较低和更多的变量相比hESCs-derived神经元细胞14]。Loehle等人表明,神经元分化效率,在小鼠细胞重编程效率,减少当转录因子的数量减少9]。相反,我们最近在人类细胞显示减少重组因子不改变neuroectodermal分化效率(15]。尽管hiPSCs的逐步转换与同质性报道增加神经元(10,16),分化效率依赖于“适者生存”从万能干细胞分化。这表明技术除了改变转录因子的数量或培养条件对从hiPSCs提高神经元分化效率很重要。

在这里,我们表明,成人neuroprogenitor感染细胞的细胞密度(aNPC)扮演了一个角色在随后的神经分化的功效。排除细菌图层样式,我们比较同基因的hiPSC台词aNPCs相同的捐赠者以低(iPSC-aNPC播种_低)、高(iPSC-aNPC_高)细胞密度。我们的结果表明,神经元分化效率明显高于在万能获得高密度与低密度。这一发现可能有助于提高收益率的患者神经元,促进高通量/高含量研究的潜在机制和潜在的药物发现。

2。材料和方法

2.1。准备和组织从成年人类大脑获得的文化

皮质白质组织了从常规癫痫手术知情同意所有捐助者。所有程序都按照赫尔辛基公约和德累斯顿技术大学的伦理委员会的批准(EK 45022009号47032006)。ANPCs是派生如前所述15,17- - - - - -20.]。总之,同质化,组织被切碎的一次性解剖刀其次是孵化在2.5毫克/毫升胰蛋白酶溶液(Sigma-Aldrich) 37°C,持续15分钟。组织在230 g离心4分钟和孵化37°C的15分钟0.04毫克/毫升DNase我在同等体积(Sigma-Aldrich)解决方案示例。离心后,均质组织在它们被介质(resuspended DMEM-High葡萄糖和F12-Glutamax 1: 1, 2% N2补充(技术),5% FCS(生物色素),100 U /毫升青霉素和100年μg / ml链霉素(1% P / S;生命技术),35μg / ml垂体提取物(技术))。媒介是补充1:1000 mLIF(默克化工GmbH)和1:500 bFGF2: EGF混合物(1:1的比例;Sigma-Aldrich)。组织被滴定用1毫升提示之后,巴斯德吸管fire-polished玻璃分离和培养悬浮在3% O₂,37°C,和5%的公司₂。生长因子增加了每隔一天没有媒介的变化。三周后离解、悬架文化经过100年μm细胞的过滤器。通过分开是培养细胞收集过滤器,均在3% O₂,37°C,和5%的公司₂。

2.2。给料机细胞的制备

SIM硫鸟嘌呤/ ouabain-resistant MEF(或停止不久)细胞系是写明ATCC(目录没有购买的。crl - 1503)和解冻和培养提供的指令(参见补充细节)的方法。失活,细胞解冻或通道到150厘米²瓶涂以0.1% 明胶的解决方案。在confluency,媒介是新鲜培养基含有10所取代μg / ml丝裂霉素c (MMC;Tocris生物科学)和孵化为2 h 37°C, 5%的公司₂。灭活细胞使胰蛋白酶化和离心机125 g为4分钟。颗粒是resuspended在寒冷的生长介质和计算使用纽鲍尔室。灭活STO细胞(称为停止给料机在此)在DMEM-High resuspended葡萄糖,10%的边后卫(Sigma-Aldrich), 1% P / S, 10% DMSO (Sigma-Aldrich)最终密度 细胞/毫升和存储在-80°C的使用。

2.3。病毒的一代

慢病毒是描述(21在cotransfection HEK293T细胞的3.19μg的慢病毒载体(Axel Schambach博士教授获得实验血液学、汉诺威医学院、德国)和辅助质粒(7.66μ3.19 g pMDLg / pRRE,μ0.96 g pRSV-Rev,μg pMD2.G)在10厘米²培养皿使用45μ克的表面(Sigma-Aldrich)。媒介改变了4到6 h后新鲜它们介质和孵化进行进一步的24小时。0.45病毒上层的收获和过滤μm PVDF过滤器(微孔)和直接用于转导或整除和存储在-80°C。

2.4。iPSC的生成和维护

IPSC生成、传播、和特征主要表现为近日报道9,15,22- - - - - -25]。生成万能,neurospheres被分离单个细胞转导之前一天。,球被重力、颗粒状和温暖DPBS洗,resuspended 1毫升Accutase解决方案(Sigma-Aldrich)和孵化15分钟在37°C。从10分钟时间点,球被滴定使用fire-polished玻璃巴斯德吸管。单个细胞在它们被resuspended镀介质与生长因子和悬浮培养在6厘米菜一夜之间在3% O₂,37°C,和5%的公司₂。转导,单细胞aNPCs离心机在250 g为4分钟和5毫升resuspended病毒上清液混合物(1:1的病毒上清液和新鲜它们介质)补充5 ng / ml bFGF2和4μg / ml硫酸鱼精蛋白(Sigma-Aldrich)。细胞悬浮培养的孵化24小时在37°C, 5%的公司₂,21%的人啊₂。第二天,颗粒状细胞悬浮在新鲜它们介质和镀 和 细胞每10厘米盘停止给料机补充5 ng / ml bFGF2和1毫米丙戊酸(Sigma-Aldrich)。一半媒介改变了第二天通过替换iPSC介质(淘汰赛™DMEM 20%击倒™血清替代品,不必要的氨基酸(NEAA) 1%, 1%, P / S(所有生命技术),0.1毫米β巯基乙醇5毫克/毫升肝素(Sigma-Aldrich))补充5 ng / ml bFGF2丙戊酸和1毫米。从第二天开始,媒介完全取代每天与iPSC中补充5 ng / ml bFGF2丙戊酸和1毫米。丙戊酸被撤回后殖民地观察post转导)(大约4 - 6天。多能性的表征方法和转基因沉默补充提供了方法。

2.5。神经元分化

万能的段落10至25受到神经元分化(乙烯基质细胞如前所述[9,15,26]。短暂,乙烯-基质细胞被镀在4板块分化前24小时。媒介改变了格拉斯哥最低基本培养基(GMEM)补充10%击倒血清更换,2毫米谷酰胺、丙酮酸钠1毫米,1×NEAA(所有生命技术),0.1毫米β巯基乙醇,1%和10 P / SμM Y27632 (Tocris生物科学)万能的镀前两小时。电镀的万能,6-well板是孵化1毫克/毫升胶原酶IV型(技术)5分钟的殖民地。三个或四个殖民地为每个克隆被选到1.5毫升埃普多夫管包含iPSC中型和离心机在100 g 1分钟。殖民地从4然后resuspended pre-incubated介质板和镀完成4板。媒介改变了4天,之后每隔一天。从第14天开始,媒介改变了与DMEM补充1% N2, 2毫米谷酰胺、丙酮酸钠1毫米,0.1毫米NEAA(所有生命技术),0.1毫米2-mercaptoethanol, 1% P / S。殖民地被固定,通过免疫细胞化学分析28天。殖民地被评估是积极的,至少一个细胞内的殖民地显示阳性标记表达式。

2.6。采用免疫分析

疣状进行根据赫尔曼与修改等人15]。短暂,殖民地在井和4%多聚甲醛溶液固定与DPBS 12分钟后清洗一次。细胞或殖民地permeabilized使用0.02% Triton-X(费舍尔科学)DPBS 10分钟。井被洗2 - 3次DPBS和孵化阻塞(1%的解决方案 分数V牛血清白蛋白和5% 驴在DPBS血清含有0.3米 甘氨酸和0.02% ( )Triton-X 100, pH值7.4)在室温下1 h (RT)。主要抗体稀释屏蔽解决方案(补充表S1a在4°C)添加和孵化过夜。与DPBS四次洗涤后,殖民地孵化与二次抗体(补充表印地在RT)在黑暗的1 h。赫斯特33342年(7.5μ在DPBS g / ml;英杰公司)是用于核染色和盖玻片是安装在玻璃幻灯片Fluoromount-G®(南部研究)。显微镜分析使用一个倒置荧光显微镜(Observer.Z1;蔡司)。

2.7。统计分析

意味着团体之间的多重比较,单向方差分析(方差分析)与Bonferroni多重比较的测试。统计学意义是考虑 。使用GraphPad棱镜软件进行统计处理。实验重复四次,每组测量( )。

3所示。结果

3.1。从成人Neuroprogenitor细胞诱导多能干细胞

我们以前球体文化从白质和海马体和特征表明,这些细胞是多功能neuroprogenitor细胞(17- - - - - -20.,27]。生成万能,多顺反子山中因素慢病毒载体包含被用于生产的病毒上清液(21]。分离aNPC球体被转导镀24 h后细胞的密度 (低)或 (高)细胞每10厘米。重编程效率分别为0.017%和0.014%的低密度高,分别。主要的选择则是基于形态学随后确认沉默外生和内生转录因子的激活(图1(一)和S1A分别)。所有克隆显示剩余外生的低表达OCT4表达式。同时,内生OCT4,NANOG,LIN28A在水平表达类似于人类的ESCs (H9)(图印地)。扩张后,万能每个细胞密度对表面标记通过疣状多能性特征包括碱性磷酸酶(美联社),SSEA4, TRA-1-60和细胞标记LIN28A OCT4、SOX2, NANOG(图1 (b))。在体外胚层分化为星质显示阳性表达的标记——(TUJ-1) endo - (GATA4),中胚层(ɖ-smooth肌肉肌动蛋白(SMA))(图1 (c))。确认iPSC克隆获得低(iPSC-aNPC_低)和密度都很高(iPSC-aNPC_高)接受了神经元分化(乙烯基质细胞(参考材料和方法)。

3.2。神经元分化的诱导多能干细胞高密度文化表现出更高的效率

为了检查可能的差异neurectodermal分化能力,我们决定使用神经元分化的协议(乙烯基质细胞(9]。这个协议的优点是直接从iPSC没有分化的中间阶段,可能会影响分化效率的“适者生存”从万能干细胞分化10,16]。三个iPSC-aNPC_低和两个iPSC-aNPC_高同基因的克隆(来自同一个病人和相同的通道aNPCs)镀在乙烯-基质细胞诱导中脑多巴胺能神经元分化(9,15,26]。在分化,iPSC克隆群岛形成的殖民地,允许识别的单菌落。四个星期后分化诱导,殖民地固定和应用不成熟(TUJ-1)和成熟(MAP2)神经元标记(图2(一个))。量化的指标显示,TUJ-1表达式之间的显著差异组( , ,单向方差分析),但在iPSC-aNPC无显著差异_低克隆( , ,和 ;克隆# 1,# 2,# 3,分别 )和iPSC-aNPC_高克隆( 和 ;分别克隆# 1和# 2 )(图2 (b)和补充表S2a)。然而,当iPSC-aNPC之间的比较_低和iPSC-aNPC_高,观察到显著差异。IPSC-aNPC_低# 1显示iPSC-aNPC TUJ-1表达式相比明显降低_高# 1和# 2克隆( vs。 和 ; (图和0.0005,分别)2 (b))。同样,iPSC-aNPC_低# 2和# 3也明显比iPSC-aNPC效率较低_高# 1和# 2(图2 (b);请参考补充表S2a详细分析)。MAP2表达式,iPSC-aNPC_高iPSC-aNPC显示显著差异_低与前区分更有效(图2 (b);请参考补充表开通详细统计数据)。

接下来,表明这些神经元变得成熟和发展功能的先决条件,殖民地被染色synaptophysin (SYP),突触囊泡糖蛋白在神经元突触传递中发挥作用,也用作突触前终端和一个标记synaptodendritic函数(28,29日]。从所有克隆彩色SYP阳性神经元,如图所示,沿着(图神经突点的模式2(一个),白色箭头)。在量化时,组(之间的显著差异被发现 , )(图2 (b))。所有三个iPSC-aNPC_低克隆表达显著低于iPSC-aNPC SYP_高# 1 ( 所有的比较)和iPSC-aNPC_高# 2 ( )克隆(图2 (b);请参考补充表S2c详细统计数据)。

据报道使用的神经分化协议产生中脑多巴胺能神经元,这对帕金森病的研究是至关重要的,例如,(26]。因此,殖民地彩色酪氨酸羟化酶(TH)(图2)。虽然两高低密度呈阳性克隆,组存在统计学差异,由单向方差分析( , )(图2 (b))。再次,在iPSC-aNPC没有发现显著差异_低克隆( , ,和 ;克隆1、2和3,分别; 所有的比较)和iPSC-aNPC_高克隆( 和 ;克隆1和2,分别; 所有的比较)。相反,明显高表达TH +殖民地在iPSC-aNPC观察_高克隆iPSC-aNPC相比_低克隆( 对于所有的比较(图)2 (b);请参考补充表二维详细的统计分析)。没有积极的表达标记测试中观察到non-reprogrammed aNPCs受到乙烯基质细胞分化(补充图S2)。

段落之间的分化实验进行了10到25的万能。我们注意到在iPSC-aNPC分化效率没有区别_高克隆观察但不明显降低在iPSC-aNPC分化效率_低克隆在更高的段落(数据没有显示)。

4所示。讨论

进入病变细胞像神经元是神经系统疾病的研究的必要性13,30.]。零星的神经退行性疾病,占绝大多数,假设发生由于体细胞突变表明“病”可能被限制在neuroectodermal血统(31日,32]。然而,随着大脑样本病人几乎无法访问,了解这些疾病的潜在细胞和分子过程仍然是一个艰巨的任务。发射的方法生成万能,它拥有类似的ESCs效力,一直在人类疾病研究的一个突破和再生医学领域的7,33]。万能干细胞可以生成不同体细胞无论年龄和性别以及健康状况。后者是吸引从患病的个人获得的细胞则保留遗传或表观遗传信息导致的疾病,即使分化所需的细胞类型,使这些细胞不可缺少的来源研究疾病机制(23- - - - - -25]。尽管有许多优点,使用研究神经系统疾病的细胞则患有分化成神经元的变化(9,14,30.]。表观遗传的记忆力,例如,已被证明导致重新编程细胞区分优先向胚层的原始细胞类型(34,35]。类似的血统的偏见也被报道在不同的行为(36- - - - - -38]。通过转录组分析,太阳和他的同事们最近发现hESC线具有不同的基因表达谱与独特的浓缩在发育过程中,如外胚层、中胚层和内胚层的发展,这是符合各自的血统的偏见39]。此外,他们还表明,不同hESC行显然利用不同的机制来维护多能状态已经影响随后的分化能力。

神经元的异质性和相对较低的产量,尤其是特定亚型,进一步限制人员来执行各种化验需要了解疾病的分子和细胞的原因。使用neuroectodermal细胞作为起点iPSC派生可能会感兴趣的,尤其是在零星的神经退行性疾病,“病”可能被限制向neuroectodermal血统。然而,随着成人npc很难获得足够多数量,数据可能被感染的npc的细胞密度的影响后续神经元分化可能是有益的。

为了提高神经由万能干细胞分化的效率,实现了各种策略。其中包括使用相同的体细胞胚叶和/或文化环境介质和添加生长因子来支持细胞生存和成熟6,10,13,16,30.]。有趣的是,当使用因素都可以降低方法的推导万能,起源的组织显示影响小鼠的最后分化能力但不是人类万能干细胞(9,15]。在这里,我们报告感染npc的种子细胞密度成年人脑,回归前多能状态,影响神经元分化效率。殖民地的数量明显高于阳性神经元标记TUJ-1和MAP2从高密度相比获得的细胞则从低密度(图2)。此外,TH-positive多巴胺能神经元的数量在iPSC-aNPC显著增加_高克隆(图2 (b))。这些差异是通过独立的数量用于启动分化(段落10至25)。这是不同与先前的报道,后期通过万能干细胞已被证明(1)具有多能性的增加和(2)更有效地区别在神经元40,41]。因此,这种可变性是更为明显的分化成胚层不同于原始细胞来源和再次支撑的价值使用aNPC作为造型神经退行性疾病的起始物料。

我们注意到并不是所有的成熟神经元的多巴胺能神经元(图2(一个))。川崎等人也存在其他亚型的神经元获得包括gaba ergic,胆碱能和血清素激活的神经元(26]。是否iPSC-aNPC_低更有效地区分不同亚型的神经元还有待阐明。然而,总体数量的神经元明显减少低密度克隆。此外,分化的持续时间也可能是另一个因素影响iPSC-aNPC的分化效率_低克隆,这可能需要更长的时间来产生相似的神经元作为iPSC-aNPC水平_高。

Yap /河马已知通路调节信号网络的协调控制细胞增殖和细胞凋亡以及干细胞更新和分化42- - - - - -44]。丽安等人报道的控制多能性在哺乳动物的ESCs的河马通路YAP发现主要在细胞核转录调节。另一方面,磷酸化并通过激活胞质保留YAP河马导致分化的ESCs [45]。YAP过度也已被证明能够增加纤维母细胞的重编程效率。虽然河马信号级联本身是很好理解的,上游监管机构仍在瓦解和可能包括细胞连接蛋白如钙粘蛋白和带occludens蛋白(46]。

萧等人最近表明,当为其的密度和hiPSCs增加,YAP定位在细胞核中减少,随后,其转录活动(47]。研究进一步表明,高密度培养条件提高分化神经上皮的祖YAP-dependent的方式。在当前的研究中,细胞密度是前一个变量转换成万能。据报道,由细胞骨架密度可能会感觉到像f -肌动蛋白通过其稳定或中断48]。河马/ Yap级联,是否感觉到通过细胞密度,影响多能性和神经分化还有待进一步阐明。我们报告在这里转导细胞的细胞密度播种在降级之前在分化过程中发挥作用到神经元的细胞则血统的效率。neuroprogenitor细胞从成年人很难获得足够的量,细胞密度的影响上的数据对后续神经元分化的潜能是强制性的和有价值的。

数据可用性

作者声明,所有的数据都是包括在手稿和补充文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突的出版。

作者的贡献

Sumitra Srimasorn导致了设计、收集和汇编的数据,数据分析和解释,并起草和修改。马提亚樱桃白兰地,Susanne Hallmeyer-Ellgner和德克·林德曼导致提供的学习材料和工作空间。亚历山大·斯托奇的概念和设计,数据分析和解释,关键论文的修订和筹款。安德烈亚斯•赫尔曼导致概念和设计,数据分析和解释,提供学习材料,起草和关键论文的修改,和筹款。

确认

作者要感谢Katja Zoschke和妮可Stanke技术支持。我们感谢帮助和H9 hESC在田中教授实验室工作。这项工作是由美国联邦教育部和研究(BMBF FKZ: 01 gm1303) E-Rare-2的框架下,研究ERA-Net罕见疾病(EMINA2财团,A.H.) BMBF(研究项目“Gewinnung pluri -、多功能Stammzellen”;阿兹:01 gn1006),促销和A.H.,the Hermann und Lilly Schilling-Stiftung für medizinische Forschung im Stifterverband to A.H.

补充材料

表S1:抗体的列表。表S2:统计分析测试的标志作为Hoechst-positive殖民地的百分比。表S3:引物列表。补充图S1:万能的表征。补充图S2:消极控制神经元分化标记的调查。(补充材料)

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