文摘

克隆的发展(clonogenicity)是一种固有财产的一个子集产后骨髓(BM)附着基质间充质干细胞(msc)的多功能后代发展文化。我们的数据表明,clonogenicity BM-MSC扩张是两个截然不同的生物事件。这个假说是基于以下的观察:(1)克隆生长的开始是一个属性严格依赖血清和独立的社会背景下,(2)个人克隆的扩张受到事件源于社会环境在初始增长,(3)单独使用细胞生长在一个社会背景存在血清可以解放自己生成一个二次不同的后代,和(4)社会产生克隆形成能力的一个固有的进一步增长的潜力可能运行表明,群体感应BM-MSC文化和确定克隆菌株的潜在增长。

1。介绍

在生物学上,群体感应(QS)被定义为一个过程细胞能够检测到的累积释放信号,改变他们的行为当信号浓度超过阈值水平。QS在原核生物是基于细菌细胞之间的“交流”必要的组织和调节细胞内部的生物过程,但这取决于人口密度(1]。这种机制允许在许多细菌物种协调行为在整个人口2- - - - - -4]。这interbacterial通信系统利用小分子扩散(诱导)调节细菌基因表达根据人口密度。QS肽是一种重要的类的细菌肽有多个影响人类宿主细胞。殖民的肠出血性大肠在人类和牲畜大肠杆菌交流包括细菌病原体之间的生化信号系统和真核宿主细胞5- - - - - -9]。

最近,它已经发现,这种机制也能够影响哺乳动物宿主细胞促进肿瘤细胞入侵和血管生成在体外,这意味着QS工作通过表观遗传机制刺激癌症干细胞迁移和正常干细胞分化为血管内皮细胞的血管生成(10- - - - - -13]。先前的研究表明存在如此复杂的哺乳动物细胞间通讯通路调节QS免疫反应机制(14歧视),包括自我/异物T细胞(15]。这条赛道哺乳动物细胞的细胞间的沟通协调多细胞基因表达(16,17),和细胞因子是好候选人等抗病诱导剂的QS影响迁移,增殖,分化14,18]。在这个场景中,类比与细菌,我们想验证的存在任何QS行为首次克隆生长和随后的扩张的哺乳动物产后骨髓附着基质间充质干细胞(msc)的文化。

骨髓(BM)基质干细胞细胞位于髓腔的骨19]。也称为BM骨骼干细胞(BM-SSCs)或BM间充质干细胞(BM-MSCs),他们是专门定义和确认只有通过在活的有机体内移植化验(20.,21]。BM-MSCs否则闻名发起克隆的能力增长(集落形成)和生成一个扩张,多功能后代在文化20.- - - - - -22]。因此,骨髓基质细胞群包含前体细胞增殖的能力,更新和分化成几个表型(19]。即使扩展文化、骨髓基质可以形成骨骼间充质细胞,纤维组织,脂肪组织,hematopoiesis-supporting网状基质(19,23- - - - - -28当植入传统在活的有机体内分化化验。也知道,成纤维细胞克隆形成单位(CFU-Fs)源自BM成骨的潜力。实际上,人口的骨髓基质骨架CFU-Fs可以分化成成骨细胞功能和形式的骨头在活的有机体内(20.,21]。细胞疗法的策略使用msc往往基于共同,未经证实的假设,不考虑他们的特定的生物学性质,他们的承诺,或在体外生物的行为。这种信念背叛和反映了我们可怜的固有的理解细胞属性,角色,和身份,忽视所有的环境因素影响或决定的某个时候MSC行为,在他们在体外增长,随后一次移植在活的有机体内。

2。材料和方法

2.1。制备BM单个细胞悬液和文化

BM-MSCs取自髂骨骨髓送气的成年健康献血者(年龄20年)。人类被试为我们提供了口头的保证他们愿意参加研究。整体研究人类组织的研究伦理委员会批准史Superiore di Sanita罗马(2016年9月20日批准日期;普罗特。PRE-686/16)。BM吸入物(0.5 - 1厘米3)和5毫升的冰冷的α修改后的最低基本培养基(αmem、生活技术,纽约,美国)含100 U /毫升肝素钠(费舍尔科学,新泽西,美国)。在135 g细胞离心10分钟,和球团resuspended新鲜αmem。骨髓细胞准备从吸入连续通过16和20计针破坏细胞聚集。细胞悬浊液40-nylon细胞过滤器过滤(圣地亚哥,正欲、钙、美国)删除任何剩余的细胞聚集。细胞被镀在标准条件基础培养基αmem添加20%胎牛血清(美国的边后卫,表达载体,卡尔斯巴德,CA), 2毫米谷酰胺(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA), 100 U /毫升青霉素(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),和100年μg / ml链霉素(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)或serum-deprived介质(SDM)补充10 ng / ml血小板源生长因子(PDGF-BB、研发系统,明尼阿波利斯,美国),10 ng / ml表皮生长因子(EGF、研发系统,明尼阿波利斯,美国),和fibronectin-coated基质(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。克隆形成试验(CFE)

multiclonal文化,形成“社会环境”,从新鲜骨髓有核细胞吸入物被播种到100毫米菜(美国圣地亚哥生物科学正欲CA)克隆的密度 有核细胞/厘米2(21)为主要CFU-Fs化验。为二级CFU-Fs化验,信徒主要从BM-derived msc克隆文化被播种到100毫米菜肴的克隆密度1.6细胞/厘米2。下的单菌落形成“隔离条件”,细胞被播种在96 -孔板在极限密度。形成离散的殖民地的得分后14天。14天之后,《决心通过计算Giemsa-stained殖民地的数量: 。分析了至少一式三份。个别殖民地(克隆)分离和扩大multiclonal主要或次要CFU-F文化使用克隆气缸(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。此外,multiclonal文化是通过在14天。

2.3。细胞在文化的显微成像

人类克隆的样本有核细胞无序BM镀和培养在100毫米菜( cell /厘米2)。亲脂性的荧光carbocyanine细胞追踪染料DiI-Ac-LDL(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)是按照制造商的建议。共焦荧光images-stacks CFU-F从人类发展阶段的BM stromal-labelled克隆细胞殖民地文化得到使用徕卡TCS SP5共焦激光扫描显微镜系统(徕卡微系统,曼海姆,德国)使用HeNe 543海里和可视化的基于“增大化现实”技术的波长488纳米的激光线红色(DiI)或绿色(GFP)重要的荧光染料,分别。

时间流逝brightfield光学显微镜图像在人类个体发展的殖民地BM送气音文化得到使用蔡司Axiophot显微镜(德国卡尔蔡司)。相衬图像获得每1 - 3天。

2.4。分析细胞增殖

msc的增殖动力学,累积人口翻倍(PD)水平细胞计数的计算使用以下方程: ,在哪里 细胞最初播种和数量 细胞是收获。活细胞数进行了一式三份的血细胞计数器通过台盼蓝染料排斥(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.5。流式细胞术

fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪),细胞主要BM MSC-derived克隆文化是颗粒状,resuspended Ca2 +毫克2 +无PBS和表达的标记是由FACSCalibur流式细胞分析仪(生物科学,正欲圣地亚哥、钙、美国)。数据分析使用Cell-Quest Pro软件(版本6.1,正欲生物科学,圣地亚哥,美国)。

2.6。试剂

表列出了流式细胞术的抗体1。

表1
抗体用于流式细胞术。
2.7。慢病毒载体

在一些实验中,BM-MSCs来自multiclonal文化与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒转导向量。慢病毒载体GFP表达是生产和使用所述[29日]。

2.8。统计分析

统计分析是由单向方差分析,随后Bonferroni期末测验。结果表示为 (SD)。被认为具有统计显著性差异 。

3所示。结果

3.1。发展阶段从单一的BM CFU-F MSC的殖民地

探讨早期殖民地的发展,单一DiI-labelled基质BM-MSCs[1 - 15天;图1(a), a - c]从新鲜无序骨髓吸入物被播种和培养为100毫米 克隆密度(总有核骨髓细胞/厘米2延时显微)在标准条件和监控。这种分析记录的存在两个不同的发展阶段,BM-MSC特征在体外。在第一阶段,细胞分裂和迁移(天1 - 7;图1(b), a]定义的边界和规模形成的殖民地。第二阶段是由静止的扩散特征[7 - 15天;图1(b), H-J]主要先增加细胞密度在殖民地,然后填满空间,建立一个领土上的离散,但在内部连续的,单层[16天;图1(c)),就我们所知,最终形成一个殖民地,在培养皿中(图1(d)]。


图1
增长阶段从BM CFU-F BM-MSC殖民地。(一)发展阶段主要CFU-F从人类BM基质DiI-labelled克隆细胞殖民地文化(a - c)所观察到的荧光显微镜( )。(b)的发展在人类个体殖民地BM送气音文化通过光学显微镜观察( )。时间流逝显微镜分离克隆细胞(白色箭头)后从BM外植体:细胞分裂和迁移(1 - 7);定义形成的殖民地的领土和大小;和随后的扩散能力在殖民地(7 - 15天;(j)]。建立完整的殖民地了染色染色(c, d)。来自5个独立的实验结果,从5个不同的捐赠者。DiI: 1、1 - - - - - -dioctadecyl-3 3 3 ,3 - - - - - -tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐;CFU-F:成纤维细胞克隆形成单位;红细胞表面:红细胞。所有数据显示代表结果来自一个至少有三个独立的实验。规模酒吧代表40μ米、80μ米、200μ米,400μ米和1厘米。
3.2。最初的克隆生长取决于血清

研究克隆BM-MSC发展,我们准备从新鲜未排序的主要文化骨髓,播种有核细胞克隆的密度 细胞/厘米2在100毫米培养皿,在标准条件下或在长效磺胺。长效磺胺是媒介能够确保基质应变扩散nonclonal密度,可通过播种> 105总有核细胞/厘米2从新鲜骨髓吸入等。离散的殖民地> 50个细胞发达只在血清的存在[数字2(一)和2(b))。在无血清培养基,培养细胞仍然可行的14天,但未能生成殖民地(数字2(c)和2(d)]。


图2
克隆生长取决于血清。人类克隆的样本有核细胞无序BM镀和培养在100毫米菜( cell /厘米2, )。文化菜肴的照片显示主要扩散BM CFU-F,培养在标准CFU-F生长培养基补充20%的边后卫(a)或培养的长效磺胺和补充EGF / PDGF (10 ng / ml) (c),经过2周的文化发达的殖民地中观察到serum-supplemented文化(a, b)。相比之下,没有殖民地开发的长效磺胺;单个细胞仍然附有完整的核和一个完整的细胞质(箭头),至少2周,演示了染色染色,但没有增殖或产生任何克隆在无血清培养基(c, d)。来自5个独立的实验结果,从5个不同的捐赠者。的边后卫:胎牛血清;EGF:表皮生长因子;PDGF-BB:血小板源生长因子。规模酒吧代表50μ米、100μ米,200μm。
3.3。对CFU-F增长社会条件的影响

调查BM-MSC单独使用效率,我们准备从初级次级文化BM-MSC文化。我们镀100二级BM-MSCs 1.6细胞/厘米2在100毫米培养皿或限制在标准条件下密度在96 -孔板。相同的CFE(图3(一个)观察,a - c]当多个单独细胞被镀在单个物理空间舱在100毫米培养皿(“社会环境”)或当单单独细胞被播种在单个物理空间舱在96孔板(限制密度≤1单元1空间舱;“隔离条件”)。这表明启动克隆能力的增长是一个上下文无关属性定义BM-MSCs的子集。虽然没有区别在殖民地的数量在两种文化中,社会背景文化中产生的细胞总数超过2倍相比,在文化的细胞在克隆生成密度(数据未显示)。BM-MSC multicolonies从“社会环境”或“隔离条件”表现出典型的MSC表型[图3 (b)A和B),由国际社会细胞治疗(ISCT) [22),被强烈CD73阳性,CD90、CD105造血CD34、CD45标记和消极。几种标记流式细胞术分析证实了组成型表达的抗原,HLA-B, HLA-C抗原和缺乏HLA-DR[图3 (b),A和B]。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
社会条件CFU-F增长。(a)为二级CFU-Fs试验,样品的有核细胞主要BM-MSC镀、培养文化无论是在100毫米菜(细胞密度在1.6 /厘米2,身体细胞隔离在一个共同的环境:“社会环境”;在克隆)或96 -孔板稀释(单个细胞在单一威尔斯:生理和生化“隔离”;B) FBS-supplemented培养基。数字之间没有差异(C)观察BM-MSC殖民地在“隔离”(CFU-Fs)或在“社会”的条件下(CFU-Fs数量)。(b)流仪分析multiclonal应变通过组合多个主要的殖民地。之间无显著差异(NS)观察BM-MSCs通过组合多个主要殖民地从“社会环境”(A)或“隔离条件”(B)。注意的高/明亮的表达多个标记BM-derived CFU-Fs(间充质干细胞),CD73, CD90、CD105和HLA-ABC的低表达。内皮(CD34)和造血标记(CD45 HLA-DR)是负的。结果表示为 ( )。 。来自5个独立的实验结果,从三种不同的捐赠者。FL:荧光染料;FSC:向前散射。
3.4。克隆扩增MSC的生物属性的获得是在一个社会环境

调查的扩张能力BM MSC-initiated克隆,我们准备从初级次级文化BM-MSC文化。我们镀100二级BM-MSCs 1.6细胞/厘米2在100毫米培养皿或限制在标准条件下密度在96 -孔板。样本来自同一母公司文化形成了相同数量的殖民地在“社会”[图4(一)]和[图“隔离”条件4(一)C]。然而,当我们监控单个克隆生成的能力在“隔离”或“社会”的条件下成长和扩张,只有殖民地接触“社会环境”在初始阶段的克隆扩张潜力能够保持增长(图4(一)B和D]。连续使各殖民地显示显著差异之间的扩张功能克隆最初播种在“社会”或“隔离”条件下(图4(一),模拟]。特别是,殖民地形成“社会环境”下可以进一步扩大(22 - 24 PD;图4 (b)],而殖民地成立于96年井接受衰老后几个重复[22日至26日进行的PD;图4 (b)14 - 17]和[PD;数据4 (b)和4 (c)]。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
克隆扩张取决于血清。(a)的样本有核细胞主要BM-MSC镀、培养文化无论是在100毫米菜1.6细胞/厘米2密度96 -孔板或克隆FBS-supplemented培养基稀释。殖民地成立于100毫米菜(“社会”条件;A、B)可能会进一步扩大。相比之下,殖民地在克隆生长在96孔板稀释(“隔离”条件;C, D)无法进一步扩大。(b)增殖曲线BM-derived克隆细胞株生长在社会环境(黑图)或“隔离”条件(红色图)。五个人殖民地成立于96孔板和5为PD multicolony文化进行了测试。(c)殖民地种植在96孔板进行了低数量的PD, 16 (T75瓶血压得到较好的控制),之后变得衰老细胞形成菌落识别不同寻常,大而不规则的形状相比,生长在殖民地社会环境可进一步扩大到22 PD (T75瓶)血压得到较好的控制。图像代表中等细胞培养结果显示从殖民地扩大形成的社会背景或在克隆生长稀释。结果表示为 ( )。 。酒吧代表200μm表示。
3.5。滥交救援Growth-Impaired MSC克隆扩散

进一步调查初步社会剥夺的角色限制随后克隆扩张个人单独的细胞,我们评估是否扩张功能克隆最初生长在隔离可以通过暴露他们获救混杂的环境。为了解决这个问题,5个杨树无性系的生长在隔离(图5(一个)96年)——孔板subconfluency,使胰蛋白酶化,(图分成了两半5(一个),B)。从每一个克隆,一半是山肩6-well板作为一个克隆(图所示5(一个)C];另一半是汇集所有另一半克隆(图5(一个)D]。池分为5样品,每个都包含相同数量的细胞每一个纯粹的克隆株和山肩6-well盘子。这样,细胞克隆生长受损可以是暴露与否,影响细胞滥交。纯一半殖民地接受衰老后5 PD,而混合菌株的扩张,包括相同数量的细胞作为纯粹的殖民地,一半继续> 10 PD(图5(一个),eg]。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
克隆扩增MSC的生物属性的获得是在一个社会环境。(一)五个人殖民地( 细胞/殖民地)形成在FBS-supplemented克隆96 -孔板稀释培养基(A)使胰蛋白酶化和一分为二(B),每一半是山肩(C)单独或联合与所有其他克隆(D)的一半。个人池分为5个样品,每个都包含相同数量的细胞和山肩6-well盘子。纯一半殖民地接受衰老后5 PD,而扩张的混合菌株,包括相同数量的细胞作为纯粹的一半的殖民地,持续> 10 PD (E)。文化图像(F, G)所代表的结果。这些实验表明,混杂株恢复的能力有效的扩张,而纯克隆菌株仍增长受损( )。(b)测定BM-MSC菌株的二次CFE和增长潜力。100 BM-MSCs转导GFP-lentiviral向量被镀在克隆密度单独或连同100 nontransduced BM-MSCs (A, B)。在文化14天之后,《是相同的,但数量三倍高细胞是由流式细胞仪分析(C),和一个2倍的GFP-BM-MSCs PD观察在混合文化相比,“纯”GFP-BM-MSCs ( )。规模酒吧代表40μ60米,μ米、70μ米,100μm表示。

接下来,100细胞的样本主要BM-derived克隆文化稳定转导与GFP-lentiviral向量被镀在100毫米菜(1.6细胞/厘米2),单独或连同100未加标签的GFP BM-MSCs[“混合文化”;图5 (b),A和B]。相同数量的绿色荧光蛋白+殖民地形成在任何类型的文化生成14天后。虽然没有检查观察GFP的数量差异+殖民地在两种文化中,GFP的总数+细胞生成的混合文化超过2倍相比,仅在镀BM-MSC文化在克隆密度;这表明最初的个人单独细胞克隆生长的大小是影响细胞的总数最初出现在文化[图5 (b),C和D]。这些实验表明,混杂株恢复的能力有效的扩张,而纯克隆菌株仍增长受损。

4所示。讨论

“群体感应”一词来源于拉丁语法定人数;在政治上,这是选票的数量必须投给选举或公投是有效的。在生物学上,QS被定义为一个过程细胞检测的累积释放信号,然后改变他们的行为当信号浓度超过一个阈值水平。细胞之间的交流是通过化学信号分子。这些分子所提供的信息是至关重要的同步活动的大型组织的细胞(1]。这种化学物质交流允许细胞监控他们的环境,并相应地改变行为。这个网络交流和信息集成的细胞,加工,和转导来控制基因的表达。识别这些化学信号的受体,目标基因和信号转导机制参与了QS网络可能有助于阐明信息交流。这可以被视为一种化学词汇,和信号网络是复杂的,通常由多个电路组织在各种配置,仍然。所有这些因素调节哺乳动物细胞行为促进发展和分化,应该考虑在未来的应用16,17]。QS系统刺激/反应相关的人口密度。然而,QS也是由单个细胞激活播种时一个非常封闭的空间。的确,QS-regulated过程相关的大细胞殖民地和单个细胞在密闭空间。干细胞自我更新的机制是至关重要的干细胞生物学和再生医学。

历史上,第一个证据表明干细胞的存在产后祖细胞结缔组织起源于Friedenstein的开创性的工作和同事,那些能够证明固有成骨,脂肪形成的,和chondrogenic未分离BM的潜力,从早期的研究,可以归因于nonhematopoietic (a),基质分数和(b)单一细胞,能够启动克隆生长density-insensitive的方式(30.- - - - - -32]。这里提出的研究并不是旨在调查niche-dependent population-dependent MSC监管机制只有在发展中一系列的假设基于我们的观察。与这些前提,我们问如果有任何QS统治clonogenicity BM-derived基质msc和二次扩张。

使用延时显微、排列的文化条件,和标记方法,我们发现不同的播种设置可能会影响生物属性包括clonogenicity和二级BM-derived间充质基质细胞的扩张。事实上,我们观察到,克隆生长和随后的启蒙在体外扩大BM-MSC克隆基质细胞菌株在生理上不同的事件。两个发展阶段是公认的在每个菌落的生长。在第一阶段,持续在镀后的第一周,细胞增殖和迁移到基板的面积定义由单层(领土)的定义。在第二个阶段,细胞增殖在前面标记境内,生成一个典型的殖民地(填充阶段)。然而,clonogenicity子集的基质粘附细胞是严格依赖于血清和独立的社会背景。相比之下,clonogenicity不支持无血清培养基。进一步扩大受事件影响的个体克隆来自社会背景在初始增长。社会产生克隆的能力开发一个内在潜力进一步发展建议的影响法定人数BM-MSC文化可能运行规则和确定潜在增长的克隆株来自单一BM-CFU-F-MSCs。接受这种模式识别一般基质BM-MSC生物学可能是有用的调节BM-MSC扩张为骨骼再生疗法的临床应用。

5。结论

我们的观察让我们假设一些生物克隆msc的属性如代离散殖民地和扩张到更大的单身人口colony-derived不同监管。在血清的存在,单个克隆msc是能够产生离散殖民地独立的电镀条件。然而,能够产生更大的纯克隆细胞群似乎取决于不同基质细胞之间的相互影响。社会环境的影响是有效的在开发殖民地的早期阶段,在此期间克隆细胞承诺一个潜在的更大的扩张。因此,在类比与细菌生物被膜,MSC人口可以被认为是“多细胞社区”为单个细胞提供不同的生物学性质。本研究的目的是评估体外放大的潜力BM-derived msc使用培养条件定义为刺激增长。这些数据将是有益的设置标准,组织收集和MSC clinical-scale扩张,为手机银行和细胞治疗的设置。QS细胞间通信网络系统的研究体外BM基质MSC生物属性从功能性致力于增长能力应该进一步探讨,在角度提炼临床使用的新的治疗策略。

数据可用性

所有相关数据用于支持本研究的结果包括在纸上。

的利益冲突

所有作者状态,他们没有竞争的经济利益。

作者的贡献

Benedetto Sacchetti负责概念化,数据管理,调查,和监督。莫里吉奥Alimandi Luca Pierelli,斯特凡诺Gentileschi, Benedetto Sacchetti分配给验证。莫里吉奥Alimandi,卢卡Pierelli Benedetto Sacchetti负责写作和草稿。莫里吉奥Alimandi Luca Pierelli,瓦伦蒂娜皮诺,斯特凡诺Gentileschi, Benedetto Sacchetti负责写作,审查和编辑。莫里吉奥Alimandi和卢卡Pierelli贡献了同样的工作。

确认

这项工作已经被Genostem财政支持(lhsb - ct - 2003 - 503161) (P.B.)。我们承认的贡献教授保罗·比安科(Sapienza大学、罗马),最近去世,对他的见解和贡献在过去的几年里,这项研究提供了依据。我们感谢Desiree Bonci贡献人类的BM stromal-MSCs GFP-lentiviral转导。