评价壳聚糖水凝胶持续交付的VEGF牙原性的牙髓干细胞的分化

文摘

盖髓的牙髓切除术是旨在保持纸浆修复牙本质的形成至关重要。血管内皮生长因子(VEGF)在牙本质再生中起着至关重要的作用;然而,其在人体恒定的政府仍然是有问题的。壳聚糖被广泛研究了作为一个有效的载体在再生医学提供生物活性分子。在这项研究中,我们进行了壳聚糖/β甘油磷酸酯(CS /βgp)水凝胶作为VEGF-sustained释放系统,探讨其对牙髓干细胞(DPSCs)的影响。CS /βgp水凝胶是使用溶胶-凝胶方法制造。SEM分析表明,海绵和多孔冻干水凝胶的微观结构。在CS / DPSCs培养βgp水凝胶保持附着力和活力。CCK-8试验测试的促进增殖活动DPSCs水凝胶。除此之外,增加VEGF蛋白可以从VEGF / CS /不断释放βgp水凝胶。VEGF / CS /βgp水凝胶能促进DPSCs比VEGF治疗牙原性的分化没有水凝胶。我们的研究结果表明,CS /βgp水凝胶能不断释放VEGF和贡献DPSCs牙原性的分化,因此可能成为一个潜在的生物活性分子的载体在盖髓治疗。

1。介绍

牙科治疗的牙齿牙髓切除术是一种保留重要的纸浆造成牙髓暴露之意外创伤或龋齿切除。保留激进纸浆是价值的连续apexogenesis年轻恒牙与不成熟的根。在牙髓切除术,受感染的冠髓是截肢,剩下的表面重要的纸浆与密封胶处理,如氢氧化钙或三氧化矿物骨料(MTA) [1]。这些密封剂,叫做盖髓剂,可以促进招聘、迁移、增殖和分化的人类牙髓干细胞(DPSCs) [2]。然后,将发起一个保护机制。牙质矩阵由odontoblast-like分泌细胞表面放下截肢纸浆。结果,牙本质桥形成或osteodentin保存残余活力纸浆(2]。

然而,作为广泛使用的限制代理、氢氧化钙已经评估成功的长期研究,虽然MTA有牙齿变色等缺陷,高成本、高运营性需求,较长的固化时间(3]。考虑修复牙本质形成的机制,生物活性分子研究促进增殖和分化的潜力DPSCs在至关重要的果肉组织(4- - - - - -10]。

血管内皮生长因子(VEGF)中扮演着关键角色在牙本质形成和再生11]。研究评估,VEGF能促进培养DPSCs牙原性的分化和诱导修复形成的牙本质表面切除纸浆(12- - - - - -16]。然而,适用的VEGF重组蛋白半衰期较短的水溶液在37°C (17]。大多数重组蛋白易受高温或pH值,他们会很容易降解酶和效率损失。如今,一些生长因子已被批准为人类治疗重组做准备;然而,大多数人仍然携带警告在临床应用。重组蛋白的使用没有任何航空公司一般对人体的副作用。这些蛋白质是多向性的半衰期较短,有时功能冗余和重叠的副作用18- - - - - -20.]。许多研究和治疗需要频繁的蛋白质政府,最终病人的依从性差(21]。蛋白质的系统应用与一次大剂量或频繁的政府可能会诱发一系列的流感样症状,以及更严重的血液,自身免疫、感染和皮肤的不良事件(18,22]。

为了有效地延长停留时间和优化分子的浓度,研究了各种材料为运营商提供生物活性分子盖髓治疗(6,23,24]。运营商有不同的功能,如合成凝胶(水凝胶)、海绵、支架、膜(7,8,25- - - - - -27]。只有持续交付承运人可以创建一个微环境来维持一定的分子浓度和扩展应用程序。换句话说,运营商可以延长有效期内和减少副作用4,28]。

来自甲壳素壳聚糖是一种多糖,是一种天然的组成部分昆虫的外骨骼,硬皮的贝壳,和真菌的细胞壁。壳聚糖抑菌效果的特点,无毒性和生物相容性23]。在制药行业,壳聚糖被广泛用作药物输送系统在不同的形式,如平板电脑,微球,水凝胶,纳米颗粒20.]。在这些中,壳聚糖/β甘油磷酸酯(CS /βgp)水凝胶以其良好的化学和生物引起了人们的关注能力提供治疗药物、分子或细胞。它一直在研究软骨修复,骨再生,止血剂,甚至在牙髓学的治疗(19,29日- - - - - -32]。研究牙科学,壳聚糖良好的属性显示为载体对某些药物,如洗必泰、氢氧化钙和三重抗生素糊33]。热敏CS /β全科医生解决方案可以转变成半固体的水凝胶在人体生理温度。此外,水凝胶保护代理从生理退化和延长治疗时间,同时尽量减少副作用(20.]。

在这项研究中,我们CS /的形态特征βgp热敏的水凝胶和牙髓干细胞的生物活性水凝胶(DPSCs)。我们还比较了VEGF治疗CS /影响βgp水凝胶和没有水凝胶DPSCs的行为。我们假设热敏的壳聚糖水凝胶可以有效地交付VEGF蛋白在持续释放模式DPSCs刺激分化和矿化。

2。材料和方法

2.1。隔离和牙髓干细胞的文化

程序是中国西部的伦理委员会批准,口腔医学院四川大学,依法执行批准的指导方针。人牙髓干细胞(DPSCs)收获从正常影响第三臼齿提取捐助者(- 22岁)在中国西部医院口腔修复和培养如前所述34]。所有捐助者为本研究提供了知情同意。DPSCs培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)组成的10%胎牛血清(青霉素、链霉素的边后卫)和1% (PS)在37°C潮湿大气中5%的股份有限公司₂使用。通道3和4之间的细胞被用于这项研究。

描述的immunophenotype DPSCs流仪分析被用来测量间叶细胞的表达和nonmesenchymal茎细胞相关表面标记在章节3。DPSCs洗了PBS和解放酶消化2分钟37°C。然后,单个细胞悬液是由缓冲溶液洗两次(PBS包含5% BSA)。DPSCs immunolabeling resuspended在0.5毫升阻断缓冲区和孵化冰上30分钟。管包含 DPSCs的孵化与适当的抗体(CD45 CD29 CD90: 328109: 303003: 368507年,和CD34: 343603年,BioLegend)远离冰。对照组在缓冲溶液孵化没有抗体。30分钟后,细胞被洗两次通过缓冲溶液和分析Cytomics™FC 500(贝克曼库尔特有限公司)。

2.2。水凝胶的制备和VEGF加载

壳聚糖(CS,粘度:200 - 400 mPa·s)获得了从阿拉丁工业公司(中国)。乙酸和β甘油磷酸盐(βgp)购买的σ(圣路易斯,美国)。2% ( )壳聚糖溶液搅拌壳聚糖制备的0.5% ( )醋酸溶液在室温下至少3个小时,直到完全溶解。后来,壳聚糖溶液在4°C存储在一夜之间减少内部泡沫。56% ( )beta-sodium甘油磷酸盐(βgp)解决方案是由混合β医生用蒸馏水,然后通过0.22直径的过滤器过滤消毒。这两个解决方案是通过添加混合βgp一滴一滴地进入激动人心的壳聚糖溶液;CS的体积比:β全科医生是5/1 (31日]。冰浴下磁力搅拌10分钟后,最后的壳聚糖溶液的pH值为7.49。在那之后,VEGF / CS /βgp水凝胶是通过添加适量的重组体人VEGF蛋白(PeproTech,中国)到CS /βgp方案下磁力搅拌10分钟;最后的VEGF浓度是100 ng / ml。

在凝胶化,这些胶解决方案被转移到37°C洗澡10分钟。溶胶-凝胶法观察过渡的过程。

2.3。扫描电子显微镜(SEM)的水凝胶和DPSCs

在玻璃容器凝胶后,水凝胶被冻干。样本切成块,和微结构扫描电镜观察到(jeoljem - 1400、日本)的加速电压20.00 kV。DPSCs直接播种和表面培养CS /βgp水凝胶。24小时后,梗塞部位凝胶与磷酸盐缓冲盐水洗(PBS) 3倍和2.5%戊二醛固定在室温下为4小时。然后,水凝胶在一系列分级脱水乙醇(30%,50%,75%,85%,95%,和100%)15分钟在每个浓度和风干一夜之间由SEM分析(jeoljem - 1400、日本)。

2.4。用AO / EB染色细胞生存能力

CS /βgp凝胶的解决方案是为1毫升/ 6-well文化板块。凝胶后,培养基添加到井浸泡10分钟3倍的水凝胶。然后,DPSCs停牌和养殖水凝胶表面的密度为10⁶cell /。24小时的文化后,细胞表面的水凝胶被1染色μl / 0.1毫升AO / EB(吖啶橙/溴化乙锭)解决方案(Sabbiotech) 1分钟。捕获的图像是尼康Eclipse 300荧光显微镜(Compix Inc .)。

2.5。使用细胞毒性细胞计数Kit-8化验

CS /的细胞毒性βgp水凝胶是由细胞计数Kit-8 (CCK-8,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。DPSCs培养在水凝胶表面的渗滤液或播种水凝胶。水凝胶的渗滤液是获得使用国际标准程序(iso - 10993) [29日]。DPSCs被播种在96 -文化板块在2000细胞/密度。媒介取代一个新的培养基或水凝胶渗滤液每24小时。后1、3、5、7天,细胞被孤立和孵化10μl / 0.1毫升CCK-8测试解决方案,然后使用BioTek ELX800工具包(美国BioTek Winooski, VT)在450 nm的吸光度。

2.6。VEGF的释放行为

VEGF / CS /βgp水凝胶渗滤液得到使用国际标准程序(iso - 10993)。浸出溶液收集并立即冻结在-80°C。同样体积的PBS是补充。VEGF在浸出溶液的浓度测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(Dakewe生物技术有限公司,中国)。光密度测量在450 nm使用BioTek ELX800。标准曲线绘制,VEGF浓度的计算与标准曲线和ng / ml。

2.7。高山和茜素红染色

DPSCs培养在24-well盘子和处理四种不同浓度的VEGF蛋白(5、10、50和100 ng / ml)在牙原性的介质(OM、DMEM组成的10%的边后卫,1% ps, 10更易与l¹βgp, 50μ10 g / ml抗坏血酸2-phosphate,⁷mol / l地塞米松)。DPSCs基本培养基(DMEM组成的数控、10%的边后卫和1% PS)被培养为阴性对照组。在OM DPSCs VEGF作为另一个对照组。细胞染色使用碱性磷酸酶(ALP)染色工具包(Beyotime,中国)后0、4、7天,茜素红染色后(ARS) 7和14天。为定量分析,10% ( )氯化十六烷吡啶决议被用来洗提茜素红积极的口供。吸光度测量使用BioTek ELX800(美国BioTek Winooski, VT)在562纳米的光密度。

VEGF / CS /βgp水凝胶被放置在上部腔体,DPSCs培养在钱伯斯在transwell盘子。100 ng / mL VEGF组DPSCs培养在OM包含相同数量的VEGF (100 ng / mL)七天没有水凝胶。DPSCs数控和OM组培养没有水凝胶。DPSCs染色使用了高山染色装备4和7天后,和ARS 10到14天。在染色之前,细胞被洗PBS为3倍和固定在4%多聚甲醛在室温15分钟。染色细胞光学显微镜下观察。

2.8。RNA提取和存在

使用试剂盒提取总rna DPSCs试剂根据制造商的协议。反转录与执行PrimeScript®RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类)。实时定量PCR(存在)进行了使用标准SYBR绿色PCR试剂盒(豆类)CFX96 (Bio-Rad)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)是用于每一个基因的表达水平正常化。引物信息如表所示1。

2.9。免疫印迹分析

总蛋白提取DPSCs工具包(注册机,中国)协议。蛋白质变性后,蛋白质浓度是衡量bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验(Beyotime,中国)。相等数量的每个样本隔离通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)凝胶,然后转移到硝化纤维素膜。阻塞后,膜是孵化主要抗体:鼠标反β肌动蛋白(ab8226 Abcam 1: 1000)和鼠标anti-OSX (sc - 393325,圣克鲁斯生物技术,1:1000)。然后,膜与山羊孵化anti-mouse IgG-horseradish过氧化物酶(圣克鲁斯生物技术)和检测化学发光试剂盒(微孔)。的表达水平β肌动蛋白是标准化的。gs - 700成像密度计(Bio-Rad)是用于图像分析。

2.10。统计分析

结果显示 从实验至少3次独立并与SPSS 21.0分析了双向方差分析。当值< 0.05,数据被认为是具有统计学意义。 , ,和 。

3所示。结果

3.1。凝胶和水凝胶的微观结构

CS /βgp凝胶溶液制备过程前面描述的(22]。VEGF / CS /βgp凝胶形成的解决方案是将VEGF蛋白添加到CS /βgp的解决方案。凝胶溶液是透明的液体在4°C和转换为非透明的半固体的水凝胶在37°C 15分钟(孵化后的数字1(一)-1(d))。凝胶后,CS /βgp和VEGF / CS /βgp水凝胶是冻干和SEM观察到(数字1(e)和1(f))。这些冻干凝胶海绵和多孔微结构和平均孔隙直径范围从100年到200年μ(数据1(g) -1(j))。没有明显不同的水凝胶有或没有VEGF蛋白。

3.2。附着力DPSCs的水凝胶

的流式细胞术检测到阳性细菌培养DPSCs CD29 CD90、CD45和CD34和消极,间充质干细胞(图的标准2(一个))。DPSCs种植在CS /的表面βgp水凝胶为24小时。CS /的微观结构βgp与DPSCs水凝胶由SEM分析。DPSCs显示球面形状,细胞突触被嵌入多孔水凝胶(图2 (b)、我和ii)。

3.3。细胞毒性的CS /βgp水凝胶,DPSCs

AO / EB双荧光染色进行观察形态、分布和可行性DPSCs表面培养CS /βgp(图24小时后水凝胶3(a))。DPSCs培养没有水凝胶为对照组(图3(b))。在绿色或黄绿色活细胞染色(图3(我)),凋亡细胞被红色或橙色(图3(2))。没有显著的差异在CS /细胞群βgp水凝胶组细胞没有水凝胶相比,和大多数DPSCs水凝胶保持活力。

细胞计数Kit-8 (CCK-8)的细胞毒性进行了试验测试CS /βgp水凝胶。表面的扩散DPSCs培养水凝胶(图4(一)在水凝胶)和渗滤液(图4 (b)化验。细胞培养板作为对照组。的活动DPSCs显示1没有区别^圣和3^{理查德·道金斯}的一天。令人惊讶的是,DPSCs的促进增殖所示水凝胶和水凝胶渗滤液组与对照组相比后7天。这些结果表明,CS /βgp水凝胶是noncytotoxic;此外,它还具有促进DPSCs扩散特征。

3.4。在CS /发布的VEGFβgp水凝胶

VEGF蛋白添加到CS /βgp水凝胶形成100 ng / ml VEGF / CS /βgp水凝胶,VEGF的发布概要文件使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。因此,观察VEGF的线性增加释放在第一次5天。8天后,累积释放水平倾向于峰值和稳定下来。共有12%的VEGF蛋白被释放后水凝胶(图8天4 (c))。每天发布的VEGF蛋白表现出下降的趋势从第4天达到一个常数浓度(图4 (d))。结果表明,CS /βgp水凝胶可以作为载体不断释放VEGF蛋白。

3.5。持续释放水凝胶的VEGF促进DPSCs的牙原性的分化

DPSCs VEGF可以促进牙原性的分化,而最优的策略集中治疗仍不清楚。VEGF的影响治疗DPSCs检测使用不同浓度的5 ng / ml, 10 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml。高山染色的结果说明诱导ALPase活动DPSCs VEGF治疗相比,细胞VEGF(图5(一个))。7天之后,VEGF治疗显著增加形成矿化结节(图5 (b))。细胞培养与10 ng / ml VEGF表现出更高的矿化细胞5 ng / ml VEGF,和细胞10 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml没有显示一个明显的不同数量的矿化结节(图5 (c))。建议超过10 ng / ml VEGF可能不需要诱导DPSCs牙原性的分化,和这个结果与之前的研究是相一致的14]。

CS /βgp水凝胶是评估作为生物活性分子的价值交付系统持续释放。进一步研究水凝胶体系的优势相比once-add策略没有航母,我们评估细胞反应100 ng / ml VEGF蛋白有或没有一个CS /βgp输送系统。没有水凝胶细胞培养在数控和OM控制。高山染色的结果表明,增加VEGF蛋白在介质和水凝胶都增加ALPase活动后7天,两组之间并没有明显的差异(数字6(a1) -6(a4)和6(b1) -6(b4))。

ARS进一步进行检测的矿化活动DPSCs末分化阶段。10天后,增加VEGF蛋白形成矿化结节与对照组相比增加(数据6(c1) -6(c4))。此外,VEGF治疗持续升高的矿化活动DPSCs比VEGF的初始破裂释放没有运营商(数字6(d3)和6(d4))。水凝胶是一个持续的交付系统和创造了一个稳定的VEGF蛋白浓度,促进牙原性的分化的DPSCs长期分化时期。

牙原性的标记的表达式进一步发现使用中存在试验。碱性磷酸酶(高山)表达水平更高的VEGF / CS /βgp水凝胶组比其他组,在符合ALPase染色(图的结果7 (d))。骨钙素的表达水平(OCN),osterix (OSX),象牙质sialophosphoprotein (DSPP)都显著的高于VEGF / CS /βgp水凝胶组7天后相比100 ng / ml VEGF组(数字7 (b),7 (c),7 (e))。的表达runt-related转录因子2 (RUNX-27)增加^th在14天,减少^th天VEGF / CS /βgp组(图7(一))。它验证了VEGF / CS /βgp水凝胶交付系统诱导DPSCs的牙原性的分化。

与基因表达的结果一致,蛋白的表达osterix (OSX)也增加DPSCs cocultured VEGF / CS /β比100年细胞培养全科医生水凝胶ng / ml VEGF(数字7 (f)和7 (g))。

4所示。讨论

牙齿的牙髓切除术和直接盖髓最初建立无菌环境和维护牙髓的活力进一步完成复杂的治疗(24]。牙髓暴露的情况下,在牙髓干细胞提供纸浆自愈和叔牙本质形成的潜力。许多调查都担心DPSCs的生物学行为会受到影响和放大由细胞外环境35]。如今,越来越关注新材料出现的设计能够驾驶DPSC迁移和分化在牙科治疗36]。其中,CS /βgp水凝胶被广泛用于药物输送或组织工程系统对其生物降解性,生物相容性、抗菌财产(37]。

CS /βgp水凝胶具有热敏的性质。混合物在室温下保持液体状态和转换成凝胶后37°C孵化或被注射到身体22,38]。热敏的特点被报道有助于伤口愈合和骨组织再生(32,39]。液体初始阶段可以很容易地流和填补任何目标区域。此外,液态封装活细胞和药物是很有用的。溶胶-凝胶法在体内转换后,水凝胶促进了细胞的增殖。溶胶-凝胶转换在伤口是安全的和可操作的,因为它不需要外部触发申请凝胶。此外,CS /βgp水凝胶被高架兼容DPSCs在这和之前的研究39]。

冻干法导致损失的水凝胶;然后,观察干水凝胶的多孔结构。多孔和含水结构允许DPSC粘附与嵌入的水凝胶中细胞突触。大量调查表明,细胞外微环境会影响细胞行为。细胞的形态学播种在不同运营商显示在不同的形状。研究报道,odontoblastic细胞系在HA海绵球,而夷为平地与拉伸过程胶原蛋白海绵(25]。细胞形态学的差异在这些航空公司可能与粘附受体有关。之前证明odontoblastic细胞系KN-3坚持哈通过表面标记CD44和附加通过整合蛋白胶原蛋白和胶原蛋白相互作用40,41]。在目前的研究中,DPSCs CS /βgp水凝胶显示出球形。相关的粘附受体需要进一步调查确定DPSCs粘附活性的水凝胶(42,43]。

AO / EB染色表明没有水凝胶均匀分布在活细胞,而水凝胶的表面活细胞增长显示状态的聚集的增长可能是由水凝胶的优势促进DPSCs扩散。凋亡细胞被EB染色,少了水凝胶表面的两组,这是一个很好的证明水凝胶的生物相容性。DPSCs的好活动是类似于先前的研究人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3 t3)其他材料由壳聚糖(29日,44]。CCK-8试验的结果进一步表明,促进与水凝胶DPSCs扩散。水凝胶本身并不透明,可能会影响吸光度的检测。DPSCs在水凝胶培养渗滤液在CCK-8排除水凝胶的吸光度分析(29日]。这些证据都与之前的研究结果相一致,表明CS /的潜在应用βgp水凝胶的生物相容性(45]。

先前的研究表明,preencapsulating药物在航空公司允许持续释放药物46),和持续交付的CS /能力βgp水凝胶也评估在与先前的研究一致47,48]。ELISA结果显示,VEGF整合进CS /βgp水凝胶有一个初始破裂释放之后,持续释放VEGF在一段时间内,并释放累积达到一个稳定水平创造一个相对稳定的浓度对细胞培养。类似的也观察到在CS /释放状态β全科医生与其他生物活性水凝胶分子(19,22]。

当我们找到了VEGF / CS /βgp水凝胶能够不断释放VEGF,我们进一步对分化的影响相比DPSCs VEGF释放水凝胶和添加100 ng / ml VEGF治疗。一般来说,代理释放生物相容性材料与初始加载代理,代理溶解度,载体材料退化等等(49]。在我们的研究中,我们使用了CS /βgp水凝胶,100 ng / ml的VEGF。添加VEGF治疗相比,DPSCs VEGF / CS /βgp水凝胶显示更多的矿化结节形成后期分化阶段。表达水平较高的成骨的VEGF / CS / /牙原性的标记βgp水凝胶组进一步检测。因此,我们认为这个交付系统促进了DPSCs的增殖和牙原性的分化在一段时间内,比100 ng / ml VEGF治疗没有航母。先前的研究中描述(14),VEGF DPSCs影响牙原性的分化,而更高浓度的VEGF可能并不总是对DPSCs显示更好的影响。我们的研究产生了类似的细胞VEGF治疗与不同浓度的反应。基于水凝胶的VEGF释放行为,这是怀疑水凝胶组中VEGF浓度低于100 ng / ml的VEGF组。此外,β在CS / gpβgp水凝胶不仅诱导体温溶胶-凝胶转变,但也提供了有机磷酸酯类,因此,诱导更多的钙沉积(50]。所有这些数据表明,尽管水凝胶组创建一个环境中的VEGF浓度较低,持续释放和稳定的VEGF浓度可能更好地有助于促进活动和牙原性的分化DPSCs比初始破裂应用VEGF。这些影响与BMP-2 / CS /一致βgp水凝胶交付系统(22]。一方面,CS /βgp交付系统节省了成本和最大化的影响VEGF治疗(14,51,52]。另一方面,交付系统降低了快速造成的不良后果损失的物理稳定性和生物活性22,32,44- - - - - -46]。transwell技术帮助我们创造一个环境来模拟实际应用和允许VEGF释放水凝胶在DPSCs工作。

5。结论

在这项研究中,CS /的微观结构和生物相容性β医生确定了水凝胶。作为载体材料,持续释放VEGF是异形的特点,导致DPSCs的增殖和分化。此外,血管生成是牙髓治疗的另一个关键步骤。VEGF据报道是一个强有力的因素,促进血管生成,可能有利于形成pulpodentinal复杂。然而,壳聚糖的优点携带VEGF在血管生成仍然需要进一步的研究。同时,制药水凝胶的应用需要进一步探索在动物实验和临床试验53]。

数据可用性

使用的数据来支持这个研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

s . w . y和z设计研究;s W。,Y. Y., and Y. Z. conducted the study; S. W., Y. Z., X. Z., and M. W. collected the data; W. D., Y. F., and M. W. performed data analysis; Y. Z., L. Z., X. X., X. Z., X. Z., and Y. F. participated in data interpretation; S. W. and Y. Z. helped in drafting the manuscript; L. Z., X. X., X. Z., and Y. Z. contributed in revising the manuscript content; L. Z. and Y. Z. approved the final version of the manuscript. L. Z. takes responsibility for the integrity of the data analysis. Si Wu and Yachuan Zhou contributed equally to this work.

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金委)给予Yachuan 81800927周,身子郑国家自然科学基金委资助81771033,国家自然科学基金委资助81771099鑫徐。

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