Chondrogenic和血液产品的影响脂肪间充质干细胞的成骨分化潜力来自三个不同的位置

文摘

背景。脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)从脂肪组织被认为是“外科废物”在再生医学联合手术可能会提供一个有效的来源。关节内的同源脂肪组织(霍法的脂肪垫,囊脂肪)可能具有卓越chondrogenic和成骨分化潜力相比,关节外,nonhomologous脂肪。血液制品可能会进一步加强这一潜力。方法。AD-MSCs从脂肪组织中分离的捐赠者从3位置,在全膝关节置换。孤立的细胞通过流式细胞术分析。细胞与血液制品补充:两种类型的富含血小板血浆(EPRP-PRP准备EDTA的存在;CPRP-PRP准备的柠檬酸),hyperacute血清(hypACT)和标准胎牛血清(FCS)是一个积极的控制。细胞是由XTT试验的可行性,并通过组织学染色差异化测试的进展和监测特定的基因表达。结果。血液制品增强体外细胞的新陈代谢。软骨形成由柠檬酸PRP增强EDTA-PRP和骨生成,而hyperacute血清分化相对提高。这一发现是一致的组织学分析以及基因表达。降低血液产品浓度和较短的分化时期导致软骨形成优越的组织学结果。PRP类型有不同的生物学效应取决于浓度,而hyperacute血清似乎更一致的效果,独立的使用浓度。结论。(i)血液产品的制备方法,(2)类型的抗凝剂,(3)分化时间,及(iv)血液产品浓度有显著影响干细胞生存和分化潜能,有利于没有使用抗凝,分化时间短,降低血液产品浓度。血液制品如hyperacute血清游离可能被视为一种补充在再生医学,尤其是对干细胞疗法。

1。介绍

关节软骨和骨软骨病变进展关节退行性变,导致骨关节炎,导致潜在的必要性TJR [1,2]。再生矫形手术的目的是进行联合保护和关节软骨再生,以延迟或完全避免TJR。

由于关节软骨的生理结构,没有血管或神经末梢,其内在的再生能力是有限的3,4]。这个临床需要导致透明软骨再生疗法的持续发展。

自体软骨细胞移植是一种深刻的研究治疗方法来满足这一需求(5- - - - - -7]。然而,其局限性如两步手术的必要性或前vivo-cultured软骨细胞的去分化潜能开车小说的发展,最好是一步程序(8]。

msc的焦点一直在研究在过去几年再生和联合防腐剂应用程序主要是由于他们的(i)分化潜力成chondrogenic tissue-amongst等脂肪和成骨的组成——和以及(2)调节检查参与组成分泌腺功能msc的包括生长因子、细胞因子、和细胞外囊泡(9,10]。

msc存在于各种组织如骨髓和脂肪组织(11,12]。BMA MSC传统的丰收网站是因为以及必要的最小细胞操纵的可能性“即时”应用程序(13]。AD-MSCs提供相同的优势而优雅地跳过BMA收获的相当大的发病率。这个附加价值引起了广泛的兴趣AD-MSCs的临床应用。

在关节镜或open-knee手术,各种脂肪来源可能产生AD-MSCs可(图1)。皮下脂肪是直接在皮肤下,是方便的,通常可在高数量(黄色)。prefemoral脂肪垫(supratrochlear袋)位于股骨的前方面,略高于滑车(红色)。此外,infrapatellar脂肪垫(也称为霍法的脂肪垫)坐落在膝关节和填充背后的空间之间髌骨髌腱,胫骨股骨髁部,高原(蓝色)。infrapatellar脂肪垫可以可视化和访问在关节镜手术。以这种方式利用脂肪组织超过需要抽脂,从而消除了相关并发症的风险(14,15]。

2011年第一个临床试验结合AD-MSCs与自体血液产品为了进一步增加治疗效果的可能性(16,17]。补充血液产品的理由是为了提高干细胞联合(增长18,19]。

血液制品最近成为一个广泛使用的再生医学治疗(20.]。底层的基本原理是通过离心分离血液成分,可能是治疗useful-platelets纤维蛋白,生长因子,etc.-from那些不是(如红细胞)[20.,21]。最著名的PRP和广泛使用。然而,PRP的异构生产协议使可比性困难。不同的成分可能瞄准特定生物学过程展示一个广泛的必要性的理解行动的潜在的生物机制。PRP也被报道含有促炎的组件(如白细胞或纤维蛋白(22,23]。hypACT血液是一个新开发的产品不包含细胞因子释放的细胞和纤维蛋白在血液凝结(24)可以作为一个替代PRP的产品。

监管障碍有关的使用等“nonhomologous组织”“移植”组件的皮下脂肪组织到关节让这些有前途的战略越来越有挑战性25]。

临床数据表明,血液产品支持细胞增殖的维护,以及干细胞体外设置属性和分化特点(26,27]。此外,血小板溶解产物和人血浆可以减少衰老AD-MSCs文化(27]。PRP-enriched中明确了加强chondrogenic分化AD-MSCs [28]。

此外,文学提供了数据显示更好的chondrogenic分化潜力的关节内的“同源”霍法等脂肪组织的脂肪垫与皮下组织相比AD-MSCs展示收获位置选择的重要性(29日- - - - - -31日]。尽管丰富的临床前数据调查血液制品的影响以及影响的位置在AD-MSCs的再生和分化潜能,缺乏研究调查的潜在协同效应的多功能组合这两个。这种差距在知识概念化这个研究中心。

临床数据处理脂肪中提取干细胞及其在软骨再生的影响并不关注比较从不同的位置,但只有AD-MSCs调查皮下组织来源(17,18]。同样地,血液product-supplemented AD-MSC应用程序不能很好地代表尽管研究表明这些建立也在联合的潜在优势17,18,32,33]。声音体外数据是必要的(我)证明的好处协同使用血液产品补充与与收获位置选择为了(ii)帮助设计优化的治疗方法临床试验考虑收获理想位置和血液产品补充。

本研究的基本原理是同源AD-MSCs在脂肪组织被认为是“外科废物”在关节镜或open-knee手术可能会提供一个自体来源再生使用。这种模式的应用程序将超过监管障碍,就可能使用同源组织的分化潜能,并可能进一步提高了血液产品补充。

本研究的目的是(我)比较chondrogenic和成骨分化AD-MSCs从3脂肪的位置(霍法的脂肪垫,远端股骨/袋脂肪和皮下脂肪)和(2)展示效果的三个血液制品(EPRP, CPRP hypACT)在体外分化潜力的设置(图2)。

2。材料和方法

2.1。细胞收获

脂肪组织是收获3捐助者(1男2女, )从3位置每个(2关节内的组织:霍法的脂肪垫,远端股骨/袋脂肪;在TJR 1包含组织:皮下脂肪),导致9组。组织存储在PBS溶液+ 8°。三分之一的捐助者收到膝盖关节内注射含糖皮质激素(Diprophos®(Betamethason) 稀释的 的Xyloneural®(利多卡因)),而其他两个捐助者收到内注射含有纯透明质酸(Hialurom®(透明质酸盐30毫克/ 2毫升))。书面知情同意了所有科目。本研究经伦理委员会批准的维也纳(积极投票:03.05.2018)福音的医院。

2.2。隔离和细胞培养

脂肪组织是切碎的手术刀,加权,在胶原酶消化(目录编号:C0130 Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国)解决方案(9000单位的胶原酶I / 15毫升DMEM / 10克脂肪)2小时37°C。消化之后,过滤(康宁®40μm细胞过滤器,目录编号:431750,达勒姆,美国)和中和与标准MSC增长媒体(DMEM、高葡萄糖,GlutaMAX™补充,丙酮酸,目录编号:31966047,Gibco生命技术欧洲Bv Bleiswijk,荷兰)2%的抗生素青霉素和链霉素(目录编号:P4333 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国)和1%的两性霉素B(目录编号:A2942 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国),10%胎牛血清(目录编号:11550356,Gibco™,合格,热灭活,Gibco生命技术欧洲Bv Bleiswijk,荷兰),1%非必需的氨基酸(MEM NEAA目录编号:11140050,Gibco生命技术欧洲Bv Bleiswijk,荷兰),和bFGF 1 ng / ml(人类,纤维母细胞生长Factor-Basic目录编号:F0291, Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国)。以下离心后(700 g×10分钟),上层清液被除去,剩下的细胞被播种密度10000细胞/厘米²在标准MSC日益增长的媒体。细胞培养confluency直到达到大约80 - 90%,不依从细胞丢弃的24小时后,然后每隔2 - 3天。细胞分离与Accutase(目录编号:SCR005 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国),离心机,稀释冻结媒体(10% DMSO(目录编号:D8418 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国)和90% FCS(目录编号:11550356,Gibco™))。100万细胞1毫升的冻结媒体收集cryovials并存储在不含酒精细胞冷冻集装箱在-80°C冰箱过夜。第二天样本转移到液氮罐,储存在氮气气相。

通过1-obtained从本地组织分裂后的细胞隔离后然后立即用于实验或液氮冻存。必然地,只有细胞从P1和P2被用于实验。

对于细胞解冻,样本立即从液态氮转移到37°C水浴< 1分钟。解冻样本稀释使用标准prewarmed MSC越来越多的媒体和离心机。如果解冻后的生存能力是> 70%,细胞被播种密度10000细胞/厘米²在标准MSC日益增长的媒体。

2.3。血液制品的制备

2.3.1。Hyperacute血清

hypACT制备所述kardo et al。34]。简单,全血从8健康献血者(25-45年)hypACT设备(OrthoSera目录编号:700194年,一个秀丽der多瑙河,奥地利)根据制造商的协议。样品立即被离心机在1710×g在室温下5分钟。离心后,顶部(富含血小板纤维蛋白凝块)和底部层形成。底层,主要含有红细胞,是删除。

2.3.2。富含血小板血浆

全血从相同的8个捐助者hypACT准备的情况下,是在VACUETTE 9毫升K3EDTA(目录编号:454217;他一一Bio-One、Kremsmunster、奥地利)和数控Trinatriumcitrat VACUETTE 9毫升9 3.2%血集合管(目录编号:455322;他一一Bio-One Kremsmunster、奥地利)和离心机在440×g在室温下10分钟。三层管的形成:(i)底层(红细胞),(2)一个中间层(淡黄色的外套),和(3)顶层(等离子体)。Leukocyte-poor PRP得到等离子层愿望没有中间层(淡黄色的外套)。吸入被转移到一个15毫升猎鹰管和离心机在1700 g×10分钟。形成血小板颗粒在50%的剩余platelet-poor-plasma resuspended上层清液。

血液制品是汇集和立即用于实验或储存在-80°C,供以后使用。

2.4。分化(成骨和Chondrogenic)

成骨分化表现在6-well文化板块是一个二维单层培养和颗粒chondrogenic文化系统分化。标准的生长介质的孵化时间2 - 4天(直到骨生成细胞confluency达到90 - 100%)。分化过程引起的特殊因素和不同血清:建立EPRP, CPRP(外加2 U /毫升肝素(目录编号:3909969,Gilvasan GmbH,维也纳,奥地利)),hyperacute血清和FCS。以下成骨的媒体使用:Gibco DMEM,高葡萄糖,GlutaMAX™补充,丙酮酸(目录编号:10569010),100 nM地塞米松(目录编号:D4902 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国),50μg / ml抗坏血酸(目录编号:A4403 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国),和10毫米β甘油磷酸(目录编号:G9422 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国)。

以下用于chondrogenic分化:Gibco DMEM,高葡萄糖,GlutaMAX™补充,丙酮酸(目录编号:10569010,LifeTech奥地利,维也纳,奥地利),其1%(液态媒体补充(100×),目录编号:I3146, Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国),100 nM地塞米松(目录编号:D4902 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国),50μg / ml抗坏血酸(目录编号:A4403 Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国),1%非必需的氨基酸(MEM NEAA目录编号:11140050,Gibco生命技术欧洲Bv Bleiswijk,荷兰),5 ng / ml TGFbeta-3(目录编号:af - 100 - 36 - e, PeproTech,纽约,美国),和4%甲基纤维素(Sigma-Aldrich化学GmbH, Steinheim,德国)的1%或5%不同的血液产品补充或FCS。250000脂肪中提取干细胞与chondrogenic混合媒体和放置在15毫升聚丙烯管。形成颗粒,样本离心机的最高速度4164 g×10分钟。

分化实验持续了3周,具体分化媒体改变了每周2次。

2.5。代谢活动试验(XTT试验)

AD-MSCs被播种在96 -孔板(热费希尔科学目录编号:260860年,沃尔瑟姆,美国)的密度6250厘米²(2000个细胞/)和增长在100年48 hμl标准生长介质。播种后48小时(0),标准介质取代100年增长μ包含10%的血液产品l (EPRP, CPRP hyperacute血清)或10% FCS为对照组。PRP的补充,2 U /毫升肝素(目录编号:3909969,Gilvasan GmbH,维也纳,奥地利)被添加到避免凝血。AD-MSCs的代谢活动的调查XTT化验(目录编号:11465015001,罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)根据制造商的协议。每治疗,3井是用来控制背景吸光度(血液中有/没有产品)和5井被用于测量吸光度为每个补充在一个特定的时间点。相对吸光度测量用一个盘子读者(协同作用2、BioTek仪器公司,Vermount,美国)。吸光度测量在492 nm,参考波长为690 nm。测量完成后在天0,1,3,6。吸光度测量后所获得的值除以吸光度值从0获得价值1天0和褶皱变化值天1天,3和6。

2.6。流式细胞仪

流式细胞术与人类MSC lineage-specific markers-positive CD73, CD105、CD34 CD90和消极,CD11b, CD19、CD45、HLA-DR-was证明干细胞特异性分化实验之前除了附件的塑料(35]。AD-MSCs是培养confluency的90%标准越来越多的媒体。媒体改变了每3天。细胞分离与Accutase(目录编号:A6964 Sigma-Aldrich化学GmbH, Schnelldorf,德国),离心机在流式细胞仪缓冲区(1% (/FCS在磷酸盐(PBS)),并与抗体染色,如表所示1(目录编号:562245,BD树干茎流hMSC分析工具包,BD生物科学,圣路易斯,美国)。样本孵化与抗体在室温下30分钟的黑暗。

流式细胞术分析使用FC500流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。流进行活细胞和消极盖茨同形像控制。

2.7。RNA提取和定量实时聚合酶链反应(存在)

2.7.1。RNA提取

分化后,细胞被收集和汇聚集团200年智慧μl PBS。细胞均质通过添加陶瓷珠子(MagNA赖氨酸绿珠目录编号:03358941001,罗氏诊断,巴塞尔瑞士)在麦格纳溶解设备(罗氏™麦格纳赖氨酸台式Homoginizaton系统)。均质化(6500 rpm, 20岁)是重复两次,中间有一个2分钟冷却阶段(8 - 12°C)。使用高纯RNA RNA被隔离隔离设备(目录编号:11828665001,罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)根据制造商的协议。RNA被筛选了,储存在-80°C到互补脱氧核糖核酸的合成。

2.7.2。基因表达分析

互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用Transcriptor合成第一链cDNA工具包(目录编号:04379012001,罗氏、巴塞尔、瑞士)。RT-qPCR使用由于“快速上手”项目进行必要的DNA探针主设备(目录编号:06402682001,罗氏、巴塞尔、瑞士)在一式三份使用LightCycler从罗氏®96。1μl的互补产品,由于“快速上手”项目调查掌握2 x,水解探测器(最终浓度250海里),底漆(900海里)的最终浓度用于PCR扩增。每个基因引物设计跨越内含子排除PCR基因污染的产品和设计使用通用ProbeLibrary系统分析设计。总共八个基因进行了分析:2型(COL2AB)胶原蛋白,胶原蛋白1型(COL1) SOX9、矩阵metalloproteinase-3 (MMP3)、碱性磷酸酶(ALPL) runt-related转录因子2 (RUNX2)和骨钙素(OCN)。提出了用引物的序列表2。GAPDH是用作看家基因。PCR条件优化退火温度和有限周期数(40)以确保产品形成的响应范围。

2.8。组织学

Chondrogenic与阿尔新蓝染色进行(目录编号:A3157 Sigma-Aldrich化学GmbH, Schnelldorf,德国),苏木精(迈耶的苏木精,目录编号:S3309 DakoCytomation, Carpinteria,美国),和伊红(目录编号:230251,Sigma-Aldrich化学GmbH, Schnelldorf,德国)。

颗粒干燥,放置在底座上模具(Fisherbrand™一次性基本模具,目录编号:22-363-554,费舍尔科学、汉普顿,美国),充满冰冻组织矩阵(Tissue-Tek®O.C.T.樱花Finetek™目录编号:4583年,阿尔文,长荷兰),转移到-80°C至少24小时。冻丸被削减(6μ米厚度)在低温恒温器设备(Cryostar NX70,热费希尔科学、沃尔瑟姆,美国),放在胶玻璃幻灯片(热科学™SuperFrost加上™,目录编号:10149870,热费希尔科学、沃尔瑟姆,美国)。幻灯片干和固定在冷丙酮(-20°C) 10分钟。

在阿尔新蓝染色(目录编号:A3157 Sigma-Aldrich化学GmbH, Schnelldorf,德国)解决方案持续30分钟。部分在运行自来水清洗1分钟和脱水95%乙醇和2的变化绝对乙醇,每3分钟。幻灯片和二甲苯清除,用二甲苯安装,覆盖着玻璃。软骨粘多糖出现蓝色。

苏木精(迈耶的苏木精、目录编号:S3309, DakoCytomation, Carpinteria,美国)和伊红(目录编号:230251,Sigma-Aldrich化学GmbH, Schnelldorf,德国)染色进行根据制造商的协议(DakoCytomation)。

照片是用光学显微镜(dm - 1000显微镜,徕卡微系统)和加工使用徕卡管理器软件(徕卡微系统公司位于德国)。

2.9。成骨与茜素红染色

细胞被固定用福尔马林(目录编号:HT501128 Sigma-Aldrich化学GmbH, Schnelldorf,德国)解决方案的10%,在室温下培养时间为30分钟。固定剂的解决方案是移除,样本用PBS。细胞染色茜素红染色2%解决方案(茜素红S,目录编号:A5533 Sigma-Aldrich化学GmbH, Schnelldorf,德国)。2 g茜素红在100毫升蒸馏水溶解,过滤,pH值调整值为4.3。细胞被覆盖的染料溶液在室温下30分钟。删除解决方案后,细胞在显微镜下用水洗和分析。矿化领域出现红色。照片是用光学显微镜(dm - 1000显微镜,徕卡微系统)。图像处理使用徕卡管理器软件(徕卡微系统公司位于德国)。之后,染色细胞被孵化以10%醋酸30分钟和收集细胞刮刀和漩涡。 Samples were then heated at 85°C for 10 minutes, cooled down, and centrifuged at 20,000 × g for 15 minutes. The supernatant was neutralized with 10% ammonium hydroxide. The absorbance was measured at 405 nm wavelength with a plate reader (Synergy 2, BioTek Instruments, Inc., Vermount, USA).

2.10。统计数据

使用GraphPad棱镜5软件执行统计分析。PCR结果分析了使用方差分析测试结合Tukey-Kramer多重比较期末测验。代谢活动数据分析应用双向方差分析和Bonferroni期末测验。方差分析的假设被证实。 被认为是显著的。数据了 。

3所示。结果

3.1。血液制品的制备

EPRP Hyperacute血清,CPRP是准备从全血从同一8捐赠者;然而,这些显示不同的血细胞(表内容1)。血液制品都低得多的红细胞和白细胞浓度比正常外周血细胞计数的值(36]。因此,EPRP和CPRP leukocyte-poor prp。hyperacute血清血小板浓度很低,而在EPRP PLT浓度大约是3 - 4倍,大约2倍CPRP与全血。

3.2。FACS-Stem细胞分离从所有三个地方表达积极的MSC标记

大部分的孤立的细胞从所有三个地方表达了积极的间充质干细胞表面标记(CD73, CD90、CD105) [37),没有表达典型的造血干细胞的标记,单核巨噬细胞,白细胞和淋巴细胞(CD45, CD34, CD11b、CD19和HLA-DR)(图3、表3)[35]。因此,隔离方法足以获得脂肪干细胞的数量。

3.3。XTT-hypACT, CPRP加强AD-MSC体外代谢活动

最高的代谢活动增加对褶皱的变化在关节内的位置观察组霍法血液脂肪垫和囊脂肪的独立产品群。Subcutaneous-derived细胞显示最少的褶皱变化。每天活动的模式增加关于褶皱变化和组相似subcutaneous-derived相比细胞在关节内的结构。

至少overall-fold改变代谢活动始终EPRP子群中可观察到的所有位置。

霍法的脂肪垫干细胞表达明显高于代谢活动已经在第三天集团补充CPRP和hyperacute人口从皮下脂肪分离血清。在6天,CPRP hypACT子组显示,大大增强代谢活动与FCS和EPRP相比在所有三个位置( )。hypACT之间的差异和CPRP子组在6天不是任何重要的干细胞数量(图4)。

3.4。Histology-EPRP hypACT加强Chondrogenic分化而CPRP和hypACT增强成骨分化

3.4.1。Chondrogenic分化

chondrogenic分化后的组织学削减给出数据5(一个)和5 (b)。这些显微照片显示成功,chondrogenic分化。

在一个定性评估,颗粒大小不组织之间的不同。同样,在一个定性评估,组织之间的组织学外观不同。组织学切片来自霍法的脂肪垫球在ECM形态。Subcutaneous-derived样品分散和异构ECM成分。囊脂肪样本显示弥漫性但同质ECM形态。可以找到许多裂缝和瓦解组织群岛包含结构来自皮下脂肪。此外,在组血产品浓度为1%的组织学外观ECM是限制和同质。Subcutaneous-derived样本另外削减经过十天的分化。这个短的分化时期显示出限制和同质ECM形态组织学外观。

3.4.2。成骨分化

茜素红染色显示hypACT——最强烈的矿化和CPRP-supplemented组织独立于收获的网站。相比之下,FCS——以及EPRP-supplemented组显示,至少在所有干细胞的人群中染色强度。这一发现是一致的宏观和微观图像分析(数据6(一)和6 (b))。茜素红的量化积累与微观观察(图6 (b))。

3.5。PCR-EPRP hypACT加强Chondrogenic基因表达而CPRP和hypACT增强成骨的基因表达

3.5.1。Chondrogenic

基因表达的分析之前,引物设计和测试成功关于优化为引物退火温度的值。

COL2AB没有表达任何的三个位置0天,这就是为什么值显示在为期三周的分化期之后,在相对表达水平而不是在褶皱的变化。

差异基因表达水平(典型的chondrogenic-related基因:COL2AB SOX9和额外的基因:MMP3和COL1A1)分析了关于收获(i)的位置,(2)血液补充产品,(iii)血液产品浓度。

关于位置,一般观察细胞源自关节内的结构(霍法、袋)显示更高的典型chondrogenic基因表达水平(COL2AB、SOX9)相比,细胞来自皮下脂肪的关节外结构。Subcutaneous-derived细胞显示没有表达COL2AB血液产品组和低水平的SOX9相比,关节内的结构。

关于血液制品,EPRP子组显示的表达明显高于COL2AB Hoffa-derived细胞。此外,EPRP子组显示更高的SOX9折叠两关节内的细胞结构变化在霍法的重要细胞。CPRP显示至少chondrogenic基因的表达(SOX9、COL2AB)在所有3血液产品建立在所有位置。

关于血产物浓度,EPRP1%导致显著高于COL2AB表达相比EPRP5% Hoffa-derived细胞。SOX9表达,EPRP5%导致表达水平明显高于EPRP1%相比。CPRP5%,相反,显示重要滴SOX9表达式与CPRP1%相比。这一发现袋-和subcutaneous-derived细胞是相一致的。在表达SOX9 hypACT子组没有显著差异在所有三个地点分别为1%和5%。

分解代谢的基因MMP3,基本在胶原蛋白的分解,是表示在所有3天位置0和3周的分化后显著下降。唯一的豁免是子群中发现CPRP5% pouch-derived细胞MMP3显著调节。

COL1A1表达显著高于EPRP5%补充Hoffa-derived细胞相比,所有其他群体在这个位置。同样,hyperacute serum5%导致显著高于COL1A1表达subcutaneous-derived细胞(图7)。

3.5.2。成骨的

基因特定的成骨分化的不同阶段分析了一个21天的分化时期:OCN, ALPL, RUNX2, COL1A1(胶原蛋白1)。

OCN表情天0趋于零;因此,OCN数据显示在相对表达水平而不是在褶皱的变化。

总的来说,细胞来源于霍法的脂肪垫显示褶皱变化或相对表达水平最高,分别。

最高的观察OCN表达式hypACT和CPRP团体在所有三个位置。这两组内的表达水平明显高于21天第十天相比细胞来源于霍法和皮下组织。Pouch-derived细胞表现出最小的相对表达水平。

ALPL褶皱变化了的Hoffa-derived细胞从第十天到21天。这个下降是重要的在这个位置hypACT, EPRP和CPRP-supplemented细胞。另外两个位置显示一个总体不太突出褶皱变化没有显著差异。

RUNX2显示下降的褶皱变化CPRP 10天21之间,hypACT-supplemented来自霍法和皮下脂肪细胞。这个降幅显著CPRP补充霍法的细胞。

COL1A1褶皱变化最高的CPRP和hypACT Hoffa-derived细胞在21天。从10天增加21是重要的CPRP的情况。霍法的细胞补充hypACT几乎没有显示任何变化在10天21。褶皱的变化两个其他地点也相对低。然而,显著增加从10天21天观察皮下细胞补充CPRP(图8)。

4所示。讨论

本研究的目的是为了证明成骨和chondrogenic分化潜力的差异AD-MSCs源自关节和关节外的结构和潜在的有利影响的血液产品补充AD-MSC分化。

干细胞分离和培养的过程更容易相比主要软骨细胞和成骨细胞(38,39]。msc的成骨和chondrogenic分化潜能与软骨的嫁接的能力是至关重要的(17,40,41和体内骨再生42]。当前的文学描述的例子的有利影响血液产品补充脂肪形成的(43],chondrogenic [44- - - - - -46),成骨分化的msc (45,47]。因此,本研究旨在扩大知识的基本原理的优化脂肪干细胞的治疗方法结合自体血液制品的临床试验。干细胞可以管理病人遵守相应的组织缺陷的使用网站,关节和关节内的脂肪在这个例子当前应用nonhomologous使用(皮下脂肪)。这种方法可以提供矫形外科医生有机会使用“外科废物”以及跳过监管障碍nonhomologous细胞移植(25]。

在这项研究中,通过流式细胞术,隔离的干细胞研究关节内的脂肪组织sources-Hoffa脂肪垫和了袋以及皮下脂肪fat-resulted干细胞数量表达典型的干细胞表面标记。

作者决定包括CD34 -标记在别人的推荐ISCT[的意见书35]。陈述的理由CD34 - msc的标志是其已知的表达式,因此区分造血干细胞或祖细胞以及内皮细胞(35]。然而,最近的文献表明,CD34表达的也可能是msc、以及AD-MSCs [48- - - - - -51]。更具体地说,这些文件显示,CD34积极性逐渐失去了在培养和塑料依从性(49]。CD34积极性只能“tissue-resident”细胞功能(50]。在结论中,作者遵循ISCT建议用CD34在复合- MSC标记有两个原因:(我)在许多论文讨论CD34的角色,AD-MSCs所谓stromal-vascular-fractions隔绝,因此收获了抽脂或类似的方法48,49]。这些不同的收获和加工协议可能会使本文的结果比较有挑战性对immunophenotypic亚种(2)CD34的不同作用的组织形成能力和生物学仍不知道(49]

低温贮藏必须被考虑作为一个限制因素。P1细胞直接被隔离或冻存后解冻,再培养如前所述进一步的实验。低温贮藏可以影响msc的治疗价值对受损的免疫抑制活动,增加proapoptotic特性,和受损的再生潜力(52- - - - - -54]。最近的研究表明,msc做维护其分化能力和低温贮藏后还免疫调节功能,但这一段“复活”的至少24 h后解冻是有益的55]。P2细胞解冻后超过24小时实验开始前“激活”。

使也被考虑作为一个限制因素。然而,大多数的建议使临床使用msc P3-5 [56]。我们的实验进行细胞收获只有在P1和P2,因此完全说谎推荐文章的框架内对临床使用。

另一个限制因素可能是关节内的药品捐赠的膝盖。糖皮质激素可以降低msc的可行性和再生潜力剂量依赖性的方式(57,58]。透明质酸被证明有助于维持msc的具备干细胞和潜在的(合作)刺激软骨形成(59,60]。这些混杂因素需要考虑的解释结果。然而,上述描述的潜在影响可能不太突出是因为患者接受他们最后注入TJR前至少6个月。此外,在联合制药剂的浓度不能完全被评估但滑液可能被稀释。代谢活动通过XTT测量分析和补充血液制品被证明有刺激作用可能支持细胞的可行性。这个发现支持建议干细胞疗法的结合使用血液制品。这补充可能增加的百分比可行的细胞。干细胞的增殖在细胞疗法似乎是重要的。在开发过程中胚胎干细胞增殖率很高,而成人干细胞增殖在vivo(相当慢骑自行车61年]。在软骨组织的情况下,再生过程是基于刺激邻近的细胞的增殖和基质合成(62年]。软骨不包含血管,因此不能诱导治疗炎症和纤维蛋白凝块形成。因此,提高网站的msc的增殖受伤可能会加速再生(63年,64年]。这种考虑所需要的增强MSC增殖率,同时保持他们的特定的表型(65年]。在这项研究中,我们提出的刺激影响hyperacute血清和CPRP AD-MSCs的代谢活动。将这些结果与以前的观测,msc的特点是保留与hypACT和PRP补充之后,我们可以得出这样的结论:血液制品产生有益影响干细胞的可行性及其multipotency。

当前报告呈现发散富含血小板血浆对chondrogenic分化的影响(44,66年- - - - - -69年];因此,本研究旨在比较不同脂肪干细胞来源的chondrogenic潜力结合各种血液制品。干细胞软骨形成一个高密度的3 d环境模拟交互所观察到的类似胚胎发育在前软骨密集(70年];因此,建立了三维颗粒细胞培养模型评价分化潜能。

基于当前文学,软骨形成的不同阶段的三个特定的标记被选中。早期软骨形成阶段的基因相似的前体细胞,包括例如MMP3和COL1表达式。在后期,细胞显示逐步增加chondroprogenitors标记,包括SOX9,紧随其后的是成熟的软骨细胞表达COL2 [71年]。结果表明,细胞来自关节内的结构,主要是霍法的脂肪垫,更有chondrogenic分化潜力相比,关节外结构。考虑到SOX9的表达水平和COL2,干细胞从霍法分离软骨形成的脂肪垫达到后期相比,从袋和皮下脂肪干细胞。基于之间基因表达和粘多糖沉积在组织学sections-hypACT连同EPRP进一步促进软骨形成。令人惊讶的是,EPRP-hardly用于临床的设置对细胞生存能力(由于其已知的负面影响43,72年CPRP相比,则优势对软骨形成。潜在诱发生物机制可能是EDTA螯合功能,捕获自由钙离子已经描述了抑制软骨形成(73年]。同样,“未捕获“自由钙离子的CPRP或许可以解释下chondrogenic结果在组织学以及基因表达。同时,血小板内的积累chondrogenic丸补充CPRP可能改变形成组织质量。另一个可能的生物学机制报道之间的生长因子浓度差异CPRP EPRP以及hyperacute血清(24,43]。它是由不同的基因表达和反映粘多糖沉积有利于补充EPRP1%而不是5%导致高血小板颗粒结构和内部的积累低ECM质量。令人惊讶的是,hyperacute血清浓度似乎没有显著影响基因表达以及ECM内形成颗粒。根据文献,生长因子浓度超过临界水平可能有严重的副作用74年,75年]。Graziani等人表明,使用集中PRP对细胞增殖有抑制作用(75年]。Broderick等人Harten和Svach发现高水平的TGF -β1或VEGF、组织形成是抑制76年,77年]。

执行额外的测试关于chondrogenic分化时间利用皮下脂肪细胞克隆显示最少的组织学结果。缩短分化时期导致优越的组织学结果得到验证。为临床应用血液制品不可能留在联合在一段时间内,这一发现可能是一个支持的理由临床试验为低频率的应用程序的设计目标。

沈等人提出了不同的成骨潜能的干细胞从胎盘组织中分离(78年),证明干细胞来源的选择干细胞疗法是一个重要的一步。同时,文学处理促进血液制品对骨的影响极为有限。Arpornmaeklong等人指出,高浓度的PRP抑制成骨分化(79年]。另一项研究表明,PRP osteoblast-like细胞的增殖能力增加;然而,确切的血小板浓度未指定(80年]。另一方面,小林等人报道增加成骨细胞迁移和表达成骨的标记COL1 ALPL, RUNX2,但没有对成骨细胞增殖的影响(81年]。这些例子反映的问题很发散PRP治疗的结果。然而,处理再生骨科临床医生需要治疗骨缺损,例如,在软骨下骨薄板损伤的情况下,为了充分再生软骨或骨不愈合给管理两个例子。

成骨分化是一个复杂的过程,其特征是各种osteogenesis-related基因的表达,在以下级别与时间有关的骨生成阶段。RUNX2被认为是中央控制基因的激活程序osteoblastogenesis [82年]。研究证实高RUNX2表达成骨诱导的早期阶段,在分化为成熟成骨细胞显著下降;此外,RUNX2察觉在成骨细胞的分化为骨细胞(83年,84年]。大量研究表明,ALPL可以作为细胞活性和分化的早期指标85年]。研究小泽et al .,高山msc显示峰值水平的基因表达在12天,然后下降(86年]。Zernik等人也证明了高山活动是一个非常早期的标志的分化成骨的血统(87年]。矿化的发病之前OCN立即出现。OCN水平提高的进步在后期矿化成骨细胞的分化。因此,OC是矿化的具体特征和良好的成骨细胞的表型标记86年]。COL1骨细胞外基质的重要组成部分;然而,这种蛋白质不能被认为是骨特定的因为它可以确定在许多细胞类型无关。不过,COL1已被证明在成骨细胞表型的分化中发挥作用(85年]。

在这项研究中,矿化显示成骨分化的量化是最先进的CPRP和hypACT补充。osteogenesis-related基因的分析可以估算的进步成骨的区分不同的血液产品补充组。CPRP hypACT表达了优越的骨钙素水平相比EPRP和FCS。此外,特定的基因分化阶段,早些时候ALPL RUNX2,被证明表达下降从第十天到21天,尤其是CPRP和hypACT组,从而进一步证明血液制品在骨生成的促进作用。

这不同生物活性的EPRP和CPRP又可以解释的EDTA螯合的影响,因为众所周知,培养基中的钙离子含量可以显著提高成骨分化和矿化88年]。

本研究旨在扩大基本知识的分化潜能msc收获从关节和关节外脂肪组织在血液产品补充为了推动发展小说AD-MSC-related治疗治疗。限制因素相对化的呈现结果可能高年龄捐赠者,少数捐赠者和具有挑战性的翻译体内体外的发现对治疗或试验。然而,文献表明,病人年龄不太可能是一个限制因素的“再生潜力”收获干细胞(30.]。3位置/捐赠者导致9子组为声音提供微妙地统计分析支持的结果。同时,在体外研究的目的主要是扩大基础知识有助于设计更复杂的临床试验而不是直接临床翻译的目标。

5。结论

整个文化扩大脂肪中提取干细胞的分化所需的血统,表型特征的基础上和组织学分析。多个血统不在。

hyperacute血清中,“自然”凝血级联不是推迟或弯腰导致自体血液产品不含血小板伪劣的生长因子水平相比,富含血小板血浆(24]。生物机制,结合上述考虑hypACT生化成分可能的原因其相对well-promoting影响软骨形成和骨生成与EPRP或CPRP只表现出促进作用一个截然不同的差异化路线。

抗凝血剂的选择血液制品的重要性似乎MSC分化,从而改变再生过程。血液制品没有游离抗凝血剂可能是一个选择。此外,血液制品的浓度参考总量似乎软骨形成的重要性,往往对低浓度的偏好。这可能是临床应用的有关问题血液制品中常用的是很难调整浓度。此外,血液产品暴露的持续时间似乎影响软骨形成,有利于短时间。

提出发现调查关节内的的生物学AD-MSCs补充与自体血液制品临床设置。目的是扩大基础知识的身体周围AD-MSCs为了合作设计新颖的治疗方法治疗骨关节炎病理条件从软骨再生以及骨缺损。

缩写

3 d:	三维
AD-MSCs:	脂肪间充质干细胞
ALPL:	碱性磷酸酶
方差分析:	单向方差分析
BMA:	骨髓抽出物
COL1:	1型胶原蛋白
COL2AB:	胶原蛋白2型
CPRP:	PRP在柠檬酸的存在
ECM:	细胞外基质
EPRP:	PRP在EDTA的存在
FCS:	标准胎牛血清
GAPDH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
hypACT:	Hyperacute血清
ISCT:	国际社会的细胞治疗
MMP3:	矩阵metalloproteinase-3
商务:	平均血小板体积
msc:	间充质干细胞或祖细胞
OCN:	骨钙素
病人:	通道
PLT:	血小板
PRP:	富含血小板血浆
存在:	RNA提取和定量实时聚合酶链反应
加拿大皇家银行:	红细胞
RUNX2:	Runt-related转录因子2
SD:	标准偏差
SOX9:	转录因子SOX9
TJR:	全关节置换
TGF -β1:	转化生长因子
VEGF:	血管内皮生长因子
白细胞:	白细胞。

数据可用性

不适用(包括所有数据)。

伦理批准

伦理批准授予在03.05.2018福音的医院伦理委员会的维也纳。

同意

书面知情同意了所有科目。

的利益冲突

Z.L.拥有OrthoSera GmbH是一家创业公司,股票持有专利hyperacute血清。好和Z.L.部分受雇于OrthoSera GmbH是一家。S.N. OrthoSera GmbH是咨询委员会的一部分,创业和学术分拆公司开发hyperacute血清技术向临床应用。

作者的贡献

所有作者作出了实质性的贡献这个协议的概念和设计。马库斯·纽鲍尔和Olga Kuten同样做出了贡献。所有作者同意的最终版本提交的手稿。所有作者已经批准这个版本出版。

确认

本研究的科学基金支持的福音的维也纳医院以及多瑙河大学期。

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