促进人体脂肪中提取干细胞成骨分化通过改变Exosomal microrna的表达gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

人类脂肪干细胞(ADSCs)可以释放液;然而,他们的特定功能仍然是难以捉摸的。在这项研究中,我们证实液源自osteogenically分化ADSCs ADSCs可以促进成骨分化。此外,为了研究的重要性exosomal小分子核糖核酸(microrna)在ADSCs成骨分化,我们使用微阵列分析分析exosomal microrna的表达谱来源于未分化以及osteogenically分化ADSCs;201 microrna调节和33个microrna是两种类型的液囊之间的表达下调。此外,生物信息学分析,包括基因本体分析、路径分析、和miRNA-mRNA-network调查,进行。这些分析的结果表明,差异表达exosomal microrna参与多个生物过程,如基因表达,合成生物分子、细胞发育、分化、信号转导,等等。此外,我们发现,这些差异表达exosomal microrna连接成骨分化过程,如轴突引导,MAPK信号和Wnt信号。我们所知,这是第一个研究识别和描述exosomal microrna来自osteogenically分化ADSCs。本研究证实,改变exosomal microrna的表达可促进成骨分化ADSCs,也为进一步研究提供了基础的监管职能exosomal microrna的上下文中ADSC骨生成。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

有效重建craniomaxillofacial骨缺陷造成的创伤,肿瘤切除,或先天性畸形整形手术是一个主要的问题。在大多数情况下,骨头可以再生和治愈自己gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。然而,这种能力是失去当骨缺损的面积超过临界尺寸。在临床实践中,自体和同种异体的骨移植是骨缺损治疗的“金标准”,即使他们有一定的局限性,如慢性疼痛,可怜的它美化,骨折不愈合,感染(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。在过去的几十年,间充质干细胞(msc)吸引了广泛关注领域的骨再生(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

msc是人口nonhematopoietic成体干细胞自我更新的性质,可以分化成多个血统(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。他们最初是在骨髓中发现gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),但也可以找到在其他组织,如脂肪、骨膜,肌肉,胎盘,骨小梁gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。其中,脂肪干细胞(ADSCs)是一种间充质干细胞分离出脂肪组织,丰富的存储的优点gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba、容易采集,和扩张gydF4y2Ba13gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。最近,一些研究已经证实ADSCs拥有向脂肪细胞分化的能力,成骨细胞和软骨细胞gydF4y2Ba16gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),这表明一个更广泛的来源的干细胞可在组织工程中的应用。ADSCs已经被用于骨再生(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

与msc的深入研究,越来越多的研究表明,治疗效果的msc可以归结不仅其分化能力,而且他们的旁分泌作用[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。大多数的旁分泌分泌物包括可溶性因子和液,它调节损伤的修复和再生过程网站影响细胞增殖、迁移和分化gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。液是一种球面或盘状细胞外囊泡的直径是30至150海里。在endosome-derived液被发现有大量的组件,它们被认为扮演了一个重要的角色在细胞间通信由于其传输能力“货物”gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。通过运输等“货物”蛋白质,rna, dna和脂质gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),液调节受体细胞的最终命运。最近,一些研究已经表明,ADSC-derived液能产生相似的生物效应ADSCs,提高骨再生(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

然而,如何在成骨分化液功能ADSCs仍需要进一步探讨。随着外来体研究技术的发展,研究人员发现,液可以诱导表观遗传变化和调节受体细胞的命运的过程中促进骨组织修复和再生,包括促进增殖和抑制细胞凋亡。蛋白质和rna扮演至关重要的角色在这些过程gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。小分子核糖核酸(microrna)是内源性non-protein-coding rna的长度大约22元。他们可以作为典型的转录后的监管机构,可以调节靶基因的表达,主要是通过特定的绑定到3gydF4y2Ba未翻译区(utr)的目标基因(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。目标绑定的microrna mRNA导致招聘的有针对性的mRNA RNA-induced沉默复杂(RISC),从而导致翻译罢工和退化的信使rna (gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。通过这个过程,microrna能抑制蛋白质有针对性的mrna的表达。近年来,越来越多的研究已经证明,microrna扮演重要角色在骨形成gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。此外,人们已经发现,液含有microrna [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),它可以调节骨再生的过程,针对多个基因在受体细胞(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。然而,缺乏关于全球microrna的表达谱数据液来源于未分化和osteogenic-differentiated ADSCs。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们验证,只有液源自osteogenically分化ADSCs ADSCs可以促进成骨分化。此外,我们比较microrna的表达谱液源自未分化ADSCs与osteogenically分化ADSCs使用微阵列分析和执行的生物信息学分析,进一步探究这些差异表达microrna的生物功能,这将为进一步研究奠定基础关于ADSCs exosomal microrna的成骨的监管职能。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

伦理委员会批准的这项研究是中国医科大学第一医院,沈阳、中国。gydF4y2Ba

2.1。隔离、文化、以及ADSCs的表征gydF4y2Ba

2.1.1。隔离和ADSCs文化gydF4y2Ba

人类脂肪组织获得6岁的女性患者gydF4y2Ba 年接受吸脂,没有代谢病、肝炎、艾滋病、梅毒、和其他系统性疾病,这可能会影响到正在进行的研究的整形手术,在中国医科大学第一医院。gydF4y2Ba

ADSCs分离和扩展根据以前报道的方法gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。总之,获得的脂肪组织加入50毫升离心管和用无菌磷酸盐(PBS(美国Gibco)),然后在1200×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟去除红细胞(红血球)。上述过程重复3 - 4次酶消化0.2%胶原酶I型(美国σ)37°C。杜尔贝科修改鹰的中/营养F-12火腿(测距装置F12(美国HyClone)),含10%胎牛血清(的边后卫(美国Gibco)),添加到消化lipoaspirates 5分钟以中和酶活性;其次是离心1200×gydF4y2BaggydF4y2Ba为5分钟。颗粒resuspended,透过100gydF4y2BaμgydF4y2Bam筛网过滤器去除细胞碎片。最后,细胞被镀在75厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba培养瓶和孵化培养基(测距装置F12, 10%的边后卫,1% Penicillin-Streptomycin解决方案(美国Gibco))有限公司37°C的5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba与饱和湿度。文化烧瓶用PBS去除红细胞表面彻底清洗,媒介是改变每两天。ADSCs通道,直到他们汇合的90%;0.25%胰蛋白酶:0.2% EDTA的比率1:3是用于分离细胞。ADSCs通道三个用于后续实验。gydF4y2Ba

2.1.2。表征ADSCs流式细胞术gydF4y2Ba

细胞在第三段(P3)与胰蛋白酶消化形成单个细胞悬液的解决方案,这是孵化与抗体,包括anti-CD34-PE anti-CD31-APC, anti-CD45-PerCP-Cy5-5, anti-CD10-APC-Cy7(美国BioLegend) anti-CD13-PE, anti-CD49d-PE-Cy7(美国BD生物科学)。所有抗体进行了孵化项目37°C在黑暗中30分钟。分析的细胞流式细胞仪(美国BD生物科学LSR II)和Treestar FlowJo软件。gydF4y2Ba

2.1.3。Multilineage ADSCs的潜在化验gydF4y2Ba

第三段ADSCs被用来演示向脂肪细胞分化的能力,成骨细胞和软骨细胞。简单地说,细胞被播种在24-well板的密度gydF4y2Ba 细胞/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在标准的生长介质。根据制造商的指示,当细胞融合达到90 - 100%,基础培养基被完全取代OriCell™成骨分化培养基(美国Cyagen)和完成MesenCult™脂肪形成的分化培养基(干细胞技术、加拿大)协助骨生成和ADSCs脂肪形成。每3天中被改变为2 - 4周。脂肪形成的和成骨分化重组被油红O(美国Cyagen)和茜素红S (Solarbio,中国)染色,分别。gydF4y2Ba

验证ADSCs chondrogenic分化能力,MesenCult™chondrogenic分化培养基添加根据制造商的指示。简单地说,gydF4y2Ba 细胞resuspended在0.5毫升的完整MesenCult™Chondrogenic分化培养基,添加到15毫升聚丙烯管、离心300×紧随其后gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。管帽的孵化前放松在37°C下5%的股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba3天。然后,0.5毫升完成MesenCult™Chondrogenic分化培养基添加到最后一卷1毫升,和孵化公司继续在37°C下5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba3天。媒介改变了每三天到28天。随后,软骨的质量与福尔马林固定石蜡和嵌入。最后,阿尔新蓝(中国Solarbio)染色进行检测chondrogenic分化。gydF4y2Ba

2.2。提取和识别ADSC-Derived液gydF4y2Ba

当细胞达到80% -90%汇合,我们取代了标准的生长介质和无血清培养基收集条件培养液孵化后额外的24小时。同样,实验组的细胞被处理完成诱导OriCell™成骨分化培养基(美国Cyagen) 14天,和条件培养基收集后24小时连续文化用无血清培养基代替原来的媒介。液被离心收获,超速离心法包含未分化的条件培养基ADSCs (Exos_D0)和osteogenically分化ADSCs后14天(Exos_D14),分别。gydF4y2Ba

2.2.1。提取ADSC-Derived液gydF4y2Ba

离心机在300×条件培养基gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟4°C,上层的收集。接下来,上层清液离心机在2000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C为20分钟,得到的上层清液被转移到一个新的管和离心10000×gydF4y2BaggydF4y2Ba为30分钟45 ti转子(美国贝克曼)。最后,包含液和污染的蛋白质的沉淀离心后收集在130000×gydF4y2BaggydF4y2Ba70分钟,在50毫升resuspended PBS。相同条件下的再悬浮是recentrifuged前一步获得液,由过滤resuspended PBS和消毒使用0.45gydF4y2BaμgydF4y2Bam过滤器。gydF4y2Ba

2.2.2。识别ADSC-Derived液gydF4y2Ba

液的结构是由透射电子显微镜观察(TEM(日立、日本))。特性的表面标记液如TSG101 CD9、和calnexin被免疫印迹检测,如部分所述gydF4y2Ba2。6。gydF4y2Ba

2.2.3。ADSC-Derived液囊吸收试验gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba

识别由ADSCs吸收液,液被贴上迪勒(Beyotime生物技术、中国)的浓度10gydF4y2BaμgydF4y2Ba15分钟,根据制造商的指示。然后,液与ADSCs孵化6 h。原子核的ADSCs沾Hoechst33258 (Solarbio,中国)。外来体吸收是由荧光显微镜观察(奥林巴斯、日本)。gydF4y2Ba

2.3。成骨分化ADSCs液和茜素红S (ARS)测定gydF4y2Ba

ADSCs (P3)被播种在6-well板的密度gydF4y2Ba 细胞/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在标准生长介质,直到达到90%的细胞融合。随后,标准的生长介质改为完成OriCell™成骨分化培养基(美国Cyagen)中包含Exos_D0或Exos_D14的浓度是20gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升,而消极的控制仿真。媒介改变了每两天到21天。根据制造商的指示,这些细胞被用PBS和固定一次或两次30分钟的2毫升4%中性甲醛溶液在每个。甲醛溶液吸气后,井与PBS洗两次,1毫升的茜素红S解决方案增加了5分钟。板与PBS洗两次,其次是放置在光学显微镜下观察染色细胞。gydF4y2Ba

2.4。碱性磷酸酶(ALP)活性测定gydF4y2Ba

发现ADSCs细胞溶解,细胞裂解缓冲对西方和IP没有抑制剂(Beyotime生物技术,中国)。然后,离心收集的上层清液是高山的半定量的分析使用碱性磷酸酶测定工具包(Beyotime生物技术、中国)根据制造商的指示。常见的磷酸酶活性显色底物,对硝基酚(p-nitrophenol)产生一个黄色产品在碱性条件下。光密度值(OD)使用分光光度计测定(SpectraMax Plus384、分子器件、美国)在405海里。最后,我们规范化高山表达水平细胞总蛋白质含量得到吸光度的指数。gydF4y2Ba

2.5。隔离Exosomal RNAgydF4y2Ba

Exosomal RNA被SeraMir隔离外来体RNA净化设备(系统生物科学,美国),根据制造商的指示。外来体RNA隔离协议主要是分为三个部分:外来体隔离和裂解,exoRNA净化,exoRNA洗脱。隔离和溶解步骤,培养基结合ExoQuick-TC之前彻底混合反演的三倍。然后,混合物放置在4°C 6 h一夜之间和离心机11200×gydF4y2BaggydF4y2Ba为2分钟。之后,上层的删除和裂解缓冲是添加到外来体颗粒。涡流15秒后,混合物放置在室温(25°C) 5分钟允许完全溶解。exoRNA净化、100%乙醇添加之前涡流10年代。组装后的自旋列和收集管,混合物被转移到旋转列和离心机11200×gydF4y2BaggydF4y2Ba为1分钟。主要材料是丢弃,自旋列被回集合管。然后,洗缓冲离心11200×之前添加gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟,这一步是重复两次。最后,主要材料都被丢弃而混合物离心机11200×gydF4y2BaggydF4y2Ba2分钟干。洗脱,收集管被丢弃,自旋列组装了一个清新,RNase-free 1.5毫升洗脱管。洗脱缓冲是直接添加到列膜和离心机旋转300×gydF4y2BaggydF4y2Ba了2分钟,然后11200×gydF4y2BaggydF4y2Ba为1分钟洗提exoRNAs。在那之后,外来体RNA被找回。gydF4y2Ba

2.6。实时定量PCR (qPCR)gydF4y2Ba

提取细胞总rna和互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用试剂盒™试剂(美国表达载体)和PrimeScript™RT大师混合(豆类、日本),分别根据制造商的指示。定量荧光检测是使用结核病执行绿色™预混料交货Taq™II(豆类、日本)根据制造商的指示,PCR predenaturation在95°C条件下30年代,变性5 s在95°C,和扩展60°C 30年代,40周期。计算的相对表达2gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2BaΔΔgydF4y2BaCTgydF4y2Ba}方法,每个实验重复3次。PCR引物的序列Runt-related转录因子2 (gydF4y2BaRUNX2gydF4y2Ba)、碱性磷酸酶(gydF4y2Ba高山gydF4y2Ba),glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba),差异表达microrna (mir - 130 - a - 3 - p, miR-30b-5p, miR-34a-5p, mir - 324 - 5 - p, mir - 378 f,和mir - 513 b - 5 - p),和gydF4y2BaU6gydF4y2Ba给出了在表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba是用于mRNA正常化。gydF4y2BaU6gydF4y2Ba是用于microrna的正常化。我们根据定义的重要结果gydF4y2Ba值阈值(< 0.05)和FC(褶皱变化)阈值(≥2)。gydF4y2Ba

2.7。西方墨点法gydF4y2Ba

蛋白质在11% sds - page凝胶电泳分离和转移到PVDF膜(美国微孔)和沾染了朱红色年代染色溶液(Beyotime生物技术、中国)5 - 10分钟。膜被孵化与每个主要抗体,包括anti-ALP anti-RUNX2, anti-TSG101, anti-CD9,和anti-calnexin(美国Abcam 1: 1000稀释)16 h,和相应的二次抗体(细胞信号技术,美国,1:5000稀释)膜后被蒸发了5%脱脂奶。每次孵化后,膜与TBST洗了三次。目标乐队是使用一个增强化学发光(ECL)工具包(Solarbio,中国)根据制造商的指示。量化的结果,西方的屁股,我们计算意味着Intden(集成密度)值使用ImageJ 1.8.0软件。相对强度是衡量使用GAPDH正常化。gydF4y2Ba

2.8。微阵列分析gydF4y2Ba

Exos_D0和Exos_D14总rna提取液用试剂盒™试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示。的数量和质量RNA被NanoDrop 2000和安捷伦生物分析仪2100检查。microrna的表达谱进行了测试GeneChip 4.0(美国Affymetrix)和验证使用三个并行复制。gydF4y2Ba

2.9。生物信息学分析gydF4y2Ba

识别差异表达基因进行使用的limma包R程序(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)的阈值gydF4y2Ba值< 0.05和日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba差异表达基因在两个数据集选择进行进一步分析。为了避免偏置的结果从不同的分析平台,我们使用大卫生物信息学资源6.8 (gydF4y2Bahttps://david.ncifcrf.gov/gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]途径分析和基因本体论(去)分析、路径分析,包括京都百科全书的基因和基因组(KEGG)途径分析和Biocarta途径分析。去分析包括生物过程(BP)、蜂窝组件(CC)和分子功能(MF)类别。的分析结果,我们认为gydF4y2Ba值< 0.05为显著。此外,我们选择10 microrna最明显的使用三个在线预测下游靶基因的差异表达分析平台:TargetScan (gydF4y2Bahttp://www.targetscan.orggydF4y2Ba),microRNA。ORG (gydF4y2Bahttp://www.microrna.org/microrna/gydF4y2Ba)和miRDB (gydF4y2Bahttp://mirdb.org/gydF4y2Ba)。我们认为这三个平台的十字路口是终极目标基因。为了描述通路和分析结果直观,我们构造的富集分析地图使用r . miRNA-Gene-Network视觉通过Cytoscape 3.60。gydF4y2Ba

2.10。统计分析gydF4y2Ba

在这项研究中,每三个并行复制实验检查,以确保实验的可重复性。使用SPSS 17.0软件进行统计分析和GraphPad Prism 7.0。对所有数据,gydF4y2Ba值< 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。人体ADSCs鉴定gydF4y2Ba

ADSCs,我们获得的用于本研究涉及胶原酶消化和贴壁细胞培养的方法。我们检测到特征ADSC表面标记使用流式细胞仪和获得以下结果:CD10, CD13、和CD49d表达是积极的,而CD34的表达CD31、CD45是负的,如图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba。重要的是,ADSCs可以分化成脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞(数字gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba),确认multilineage潜力,符合认可标准的识别ADSCs [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

3.2。液只来自Osteogenically分化ADSCs可以促进成骨分化gydF4y2Ba

3.2.1之上。识别ADSC-Derived液gydF4y2Ba

ADSC-derived液被离心分离,从条件培养液超速离心法。如图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba,TEM显示囊泡粒径30和150 nm之间表现出球形形态,证明液的存在。此外,免疫印迹结果表明exosome-associated TSG101和CD9的表达蛋白质在内质网蛋白calnexin几乎表现在液(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。上述结果表明,我们成功地提取ADSC-derived液。gydF4y2Ba

3.2.2。由ADSCs外来体吸收gydF4y2Ba

探索ADSCs能否吸收液,我们孵化Dil-labeled液与ADSCs 6 h。如图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba液贴上迪勒(红点)被ADSCs逐渐内化。许多液中观察到的细胞质同型的cells-ADSCs仅6 h postincubation通过荧光显微镜。gydF4y2Ba

3.2.3。液源自Osteogenically分化和未分化ADSCs促进ADSCs成骨分化gydF4y2Ba

调查不同的外来体功能、液源自未分化ADSCs (Exos_D0)和osteogenically分化ADSCs 14天(Exos_D14)提取。Exos_D0和Exos_D14作为刺激治疗第三通道ADSCs没有其他成骨的干扰因素。为了建立更精确的结果,我们设置4组:比较消极的控制(数控)集团,积极控制(PC)组,Exos_D0集团和Exos_D14组。ADSCs PC组与成骨诱导分化培养基,而数控组仍未经处理的。gydF4y2Ba

qPCR和高山活性测定进行治疗后7天。与NC和Exos_D0相比,osteogenesis-related基因的表达等gydF4y2Ba高山gydF4y2Ba和gydF4y2BaRUNX2gydF4y2Ba显著增加(gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba )gydF4y2BaExos_D14和PC组。有趣的是,有数控和Exos_D0组之间没有显著差异,但Exos_D0和Exos_D14团体之间的差异明显(图gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba)。高山qPCR的半定量的分析也显示了类似的结果。高山活动显著高于Exos_D14和PC组。在对比数控和Exos_D0 Exos_D0和Exos_D14组,结果没有显著差异,表现出明显的差异(图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。此外,免疫印迹分析证实了qPCR导致蛋白表达的高山,和RUNX2 Exos_D14和PC组显著升高,与NC和Exos_D0相比,如图gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 (d)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

21天治疗后,茜素红染色显示,有更多的钙结节形成Exos_D14和PC组(图gydF4y2Ba4 (e)gydF4y2Ba)。这些结果证实,Exos_D14而不是Exos_D0能有效促进ADSCs成骨分化。gydF4y2Ba

3.3。独特的microrna的表达水平液源自Osteogenically分化ADSCs和未分化ADSCsgydF4y2Ba

为了理解底层机制如何ADSCs液促进成骨分化,液由未分化的microrna的表达谱和osteogenically分化ADSCs被微阵列分析。我们总共发现2170成熟microrna和1868年pre-miRNAs表达ADSC-derived液的分层聚类显示microrna的表达谱在同一组是一致的,尽管两组之间的表达谱是不同的。如图gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba横坐标代表样本聚类(前三个列表示液由未分化的ADSCs,最后三列代表液源自osteogenically分化ADSCs),纵坐标代表基因聚类。深红色,更明显的upregulation基因,和更深的绿色,更明显的差别,对这些基因的基因。gydF4y2Ba

与液来自未分化ADSCs相比,201个microrna调节和33个microrna表达下调液源自osteogenically分化ADSCs (gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba 值< 0.05),由火山地块(图表示gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.4。Exosomal microrna影响成骨分化通过一系列生物过程gydF4y2Ba

Exosomal microrna能影响成骨分化过程通过一系列生物过程的第一个目标相关基因,这样他们可以调节轴突引导,MAPK信号和Wnt信号修改基因表达、细胞代谢等生物功能。gydF4y2Ba

3.4.1。Exosomal microrna的途径分析和功能分析gydF4y2Ba

确定成骨分化过程中信号通路改变ADSCs由外生小分子核糖核酸,KEGG途径分析和Biocarta途径进行分析。结果显示,目标基因的差异表达microrna主要是相关过程,如轴突指导(gydF4y2Ba值= 1.16gydF4y2BaEgydF4y2Ba-18)、MAPK信号(gydF4y2Ba值= 2.31gydF4y2BaEgydF4y2Ba-16),Wnt信号(gydF4y2Ba值= 1.03gydF4y2BaEgydF4y2Ba-15),内吞作用(gydF4y2Ba值= 7.1gydF4y2BaEgydF4y2Ba-12),调节肌动蛋白细胞骨架(gydF4y2Ba值= 1.31gydF4y2BaEgydF4y2Ba-11),TGF -gydF4y2BaβgydF4y2Ba信号通路(gydF4y2Ba值= 5.26gydF4y2BaEgydF4y2Ba-10)(图gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba)。它认为这些生物通路参与ADSCs成骨分化。gydF4y2Ba

探讨差异表达microrna的潜在的生物功能,我们进行富集分析,包括英国石油(BP)、CC, MF大卫。据统计显著性分析结果(gydF4y2Ba值< 0.05),我们发现等功能酶绑定(gydF4y2Ba值= 7.7gydF4y2BaEgydF4y2Ba-69),细胞投影(gydF4y2Ba值= 1.29gydF4y2BaEgydF4y2Ba-54),转录因子的活动(gydF4y2Ba值= 1.53gydF4y2BaEgydF4y2Ba-45),调节基因表达(gydF4y2Ba值= 4.52gydF4y2BaEgydF4y2Ba-74年),和细胞代谢(gydF4y2Ba值= 5.92gydF4y2BaEgydF4y2Ba-74)主要影响差异表达microrna(数字gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6 (d)gydF4y2Ba)。有趣的是,这些函数是ADSCs的成骨分化密切相关。gydF4y2Ba

3.4.2。miRNA-mRNA网络分析gydF4y2Ba

microrna可以针对单个或多个基因参与相同或不同的信号通路,以调节骨再生的过程(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。探讨差异表达microRNA之间的联系和相关蛋白mrna,我们选择10个microRNA (mir - 130 - a - 3 - p, miR-30b-5p, miR-34a-5p, mir - 183 - 5 - p, mir - 212 - 3 - p, mir - 324 - 5 - p, mir - 345 - 5 - p, mir - 378 f, mir - 513 - 5 - p和mir - 513 b - 5 - p)与最明显的微分表达式使用TargetScan预测下游靶基因,microRNA。ORG, miRDB和构造使用Cytoscape miRNA-mRNA网络。如图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,我们发现一个microrna可能识别多个目标同时mrna,和一个基因也可能由多个microrna。更重要的是,大量microrna是预测参与多种途径促进成骨分化。例如,mir - 130 - 3 - p是一个最高的microrna的微分表达式和预测的高概率的绑定gydF4y2BaSIRT7gydF4y2Ba。先前的研究已经发现,击倒SIRT7提高成骨分化的骨髓间充质干细胞(bmsc) [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

3.4.3。qPCR验证microrna的表达gydF4y2Ba

6 microrna (mir - 130 - a - 3 - p, mir - 513 b - 5 - p, miR-30b-5p, miR-34a-5p, mir - 324 - 5 - p,和mir - 378 f)与被选出的最明显的微分表达式验证使用qPCR微阵列分析的结果。与微阵列得到的初步结论一致,与液由未分化的ADSCs相比,5 microrna的表达(mir - 130 - a - 3 - p, miR-30b-5p, miR-34a-5p, mir - 324 - 5 - p,和mir - 378 f)在液源自osteogenically分化ADSCs显著增加(gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba )gydF4y2Ba虽然mir - 513 b的表达——降低(图5 - pgydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。qPCR结果确认差异表达microrna被微阵列的有效性,表明这些microrna在调节ADSC成骨功能。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

骨再生领域的一个主要问题是干细胞的诱导分化为成骨细胞。除了成骨分化中,基因改造,生长因子,MSC-derived液也备受关注,近年来因其诱导成骨分化能力的干细胞(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。然而,ADSC-derived液很少检查领域的骨再生。在我们目前的研究中,我们探索了差异的影响液分别来自osteogenically分化ADSCs和未分化ADSCs ADSCs成骨分化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。我们的研究结果表明,osteogenically分化ADSC-derived ADSCs液可促进成骨分化,而未分化ADSC-derived液不能(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这一发现提供了证据,ADSC-derived液可以与优秀的成骨效果理想的诱导因素,安全,和广泛的可用性在骨再生和临床应用。李等人证明,添加ADSC-derived液对成骨分化培养基可以促进成骨分化的骨髓mscgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。据我们所知,在缺乏因素干预成骨分化,第一次,我们有了良好的成骨活性osteogenically分化ADSC-derived液。此外,我们发现它只花了6小时为ADSCs摄取大量ADSC-derived液(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),而48 h骨骨髓来源干细胞(bmsc) [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。我们推测,这可能是因为ADSC-derived液更容易吸收的同型的细胞,即ADSCs。这表明ADSC-derived液囊和ADSCs骨组织工程可以减少液的损失,这是由于吸收时间更长,从而更有效地促进骨再生。gydF4y2Ba

了解骨生成的确切分子机制是极为重要的促进干细胞的成骨的疗效和临床应用骨再生。迄今为止,大多数研究都集中在研究表观遗传和转录因子涉及干细胞(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),而很少有研究关注外来体的影响“货物”干细胞的成骨分化。已经指出液可以通过影响调节相应的生物学过程相关的受体细胞的途径。例如,越等人表明huc-MSC-derived液促进皮肤伤口愈合通过影响Wnt4信号(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。张等人表明,液可以提高骨再生通过激活PI3K / Akt信号通路(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。有趣的是,小分子核糖核酸可以调节mRNA的表达通过绑定具体到3gydF4y2BaUTR目标基因,从而影响相应的信号通路(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。基于之前的研究,我们得知有蛋白质、dna、rna、脂质,和其他生物分子在液,其中蛋白质和rna扮演重要角色(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。RNA的一个重要类,microrna是参与一系列的关键过程,包括细胞生长、细胞增殖、分化、凋亡和细胞死亡。许多评论都提到microrna骨生物学中发挥重要作用[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。此外,没有报道关于microrna的全基因组表达和功能在ADSC-derived液。我们分析了microrna的表达差异未分化ADSC-derived液和osteogenically分化ADSC-derived液微阵列分析。gydF4y2Ba

失调的exosome-derived microrna的表达已经发表在精神分裂症和局部乳腺癌[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。这些研究表明,microrna的表达在不同条件下液发生重大的改变。在这项研究中,我们发现2170成熟microrna 1868 pre-miRNAs ADSC-derived液。相对于未分化ADSC-derived液,有234显著差异表达microrna(201调节和33个表达下调)osteogenically分化ADSC-derived液。不同的microrna的热图液表明microrna的过程中可能发挥重要的监管作用ADSCs成骨分化,促进液。gydF4y2Ba

microrna法案通过与互补的碱基配对序列在mrna和沉默相应基因的表达,从而干扰信号通路(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。此外,10个差异表达microrna显示选择高折变化预测目标基因和执行路径分析。我们发现一个microrna可以针对多个mRNA,信使rna可以由一个或多个microrna。这个结论与先前的报道是一致的(gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。在我们的研究中,大多数预测microrna参与相关信号通路在成骨分化,包括MAPK信号通路,Wnt信号通路,TGF -gydF4y2BaβgydF4y2Ba信号通路等(图gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba)。例如,gydF4y2BaSIRT7gydF4y2Ba预计是一个极有可能的目标mir - 130 - a - 3 - p,最高的褶皱变化。我们还证实,mir - 130 a的表达- 3 - p在Exo_D14显著增加,而Exos_D0(图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。先前的研究已经表明,SIRT7抑制成骨分化的bmsc得罪Wnt信号通路,而mir - 130 - a - 3 - p促进它(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba),这是符合我们的预测。事实上,Wnt信号通路是一个高度保守的途径参与调节细胞生长、分化、存活、细胞凋亡和扮演一个重要角色在干细胞的自我更新和维护gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。迄今为止,许多研究已经证实Wnt信号通路的重要的监管作用的过程中成骨分化的干细胞(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]。因此,mir - 130 a - 3 p / SIRT7 / Wnt轴可能是小说ADSCs调节成骨分化的分子机制。进一步澄清目标基因差异表达的小分子核糖核酸的生物功能,去分析,包括英国石油(BP)、CC、MF、。去的结果分析表明,影响目标基因主要参与酶结合,细胞投影,转录因子的活动,调节基因表达和细胞代谢(数字gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6 (d)gydF4y2Ba)。很明显,某些差异表达microrna在液密切相关的细胞和分子反应ADSCs的成骨分化过程。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明,exosomal microrna可能起着至关重要的作用在提高骨再生。可以更快吸收液同型的细胞,而不是其他细胞。我们相信ADSC-derived液囊和ADSCs将作为优秀的“诱导因素”和“种子细胞”在创建组织工程bone-a开发援助临床骨缺损的修复。此外,如何的详细机制ADSC-derived液提高成骨分化ADSCs需要进一步探索,但这些综合分析实验将为理解机制构建丰富的信息库exosome-mediated ADSCs促进成骨分化。gydF4y2Ba

我们应该表明这项研究有一些局限性。我们只比液源自osteogenically分化ADSCs和未分化ADSCs。这可能导致我们失去信息的动态变化exosomal microrna在成骨分化过程。此外,具体涉及液的分子机制仍然是难以捉摸的。因此,这些问题在未来的研究应该探索。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

总之,我们所知,我们首次证明osteogenically分化ADSC-derived ADSCs液可促进成骨分化。重要的是,我们成功地识别microrna的液和执行功能分析涉及coregulated网络。这些将作为一个新的基础,基础研究在临床骨再生和骨再生疗法。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

不存在利益冲突。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢所有捐助者参加这个项目和同事造成的人类脂肪组织主办的整形手术,在中国医科大学第一医院。这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。51872332),辽宁省的国家自然科学基金(没有。20170541040),中国博士后科学基金会(没有证书。2018 m641741)。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

(a)的结果实时荧光共焦显微镜的成像显示ADSCs逐渐内化的过程中同源液贴上迪勒(红点)从0分钟到360分钟。(b) 9时间点(1分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟、360分钟)在同一视场选择获取图像。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba

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