在体外小鼠造血支持的信号从一个脾基质细胞系

文摘

很少有模型系统演示造血作用在体外。以前,我们描述独特脾基质细胞系支持在体外造血细胞,尤其是髓细胞的发展。这里,5 g3脾基质细胞系已调查能力支持造血细胞祖细胞的分化在体外。最初,5 g3显示表达的标记内皮或造血细胞和间充质而不是像血管周的骨髓网状细胞通过基因表达。特别是5 g3像CXCL12-abundant网状细胞或血管周的网状细胞,这是重要的利基元素在骨髓造血作用。分析5 g3的造血支持作用,特定信号通路抑制剂进行调节细胞生产的能力在体外在cocultures基质覆盖骨骨髓来源的造血干/祖细胞。这些研究发现Wnt和Notch通路的重要作用以及酪氨酸激酶受体,如c - kit和PDGFR。基质细胞生产cocultures构成造血作用,因为脾基质提供的信号通路反映那些支持在骨髓造血作用。

1。介绍

多个交互发生在HSC和骨髓基质利基,作为造血作用的关键诱因。已知信号事件包括CXCL12 / CXCR4和自洽场/ c - kit receptor-ligand交互和Wnt和Notch信号1- - - - - -4]。众所周知,产生的可溶性因子CXCL12和自洽场血管周的网状细胞是造血干细胞(HSC)的重要介质迁移和维护,分别为(1,5]。造血干细胞自我更新的Wnt信号是至关重要的,HSCWnt3a^−−/老鼠是严重受损的重新能力(6]。切口在造血的作用在活的有机体内是有争议的。然而,抑制切口cocultures CD146⁺血管周的细胞与人类HSC给B细胞增加开发HSC较少,建议的角色等级在HSC维护(2]。尽管大量的信息在信号通路和利基市场支持造血的骨髓,很少有例子,可以诱导造血作用在体外通过提供生长因子或细胞与基质coculture利基。

这个实验室之前报道5基质细胞系g3孤立的小鼠脾脏的支持在体外生产特定的骨髓细胞(子集7]。这一发现与基质细胞在脾脏脾造血利基,唤起兴趣和脾脏的二级网站支持造血作用。5 g3基质被证明支持瞬态生产骨髓前体细胞和长期生产的小说不同的dendritic-like细胞类型,即“L-DC”[7]。先前的研究认为L-DC高度激活CD8的内吞作用的能力⁺T细胞,但不是CD4细胞⁺T细胞(8,9]。5 g3提供contact-dependent支持造血作用[8]。这是长期的克隆分离脾文化STX3,不像成熟的内皮细胞和成纤维细胞的基因表达,尽管它被证明能力薄弱与内皮细胞基底膜基质中形成管状结构(10,11]。这个属性已经与周和血管周的基质细胞(12]。

5 g3基质行因此被调查进一步标志表达确定血统起源与间质和血管周的网状细胞的组件HSC龛中描述的骨髓。为了解决这个问题是否涉及5个g3 cocultures支持造血的HSC给后代细胞分化,而非造血细胞的增殖或扩张,信号通路调节造血的骨髓进行了研究。已知信号通路的抑制剂包括切口,Wnt和酪氨酸激酶c - kit PDGFR coculture化验测试了对细胞的影响生产、维护的祖细胞和髓细胞包括L-DC生产。

2。材料和方法

2.1。动物

特定的无菌C57BL / 6 j (H-2K^b:CD45.2)小鼠年龄在4到8周从约翰科廷商学院获得医学研究(JCSMR:堪培拉、行动、澳大利亚)。动物实验是按照澳大利亚执行代码的动物保健和使用科学目的(第八版,2013)。动物实验伦理委员会批准的所有程序都是在澳大利亚国立大学(阿奴:堪培拉,澳大利亚)协议A2013/11之下。

2.2。基质细胞培养

脾脏长期文化(LTC)已经建立了多年来在这个实验室通过不断的文化整体脾细胞悬液(13,14]。这些已经被证明包括基质细胞单层连续支持生产不同的骨髓细胞。STX3基质行是来自脾LTC停止造血细胞的生产时间和通道在体外(10]。STX3通过单细胞克隆沉积使用流式细胞术,然后克隆生长融合,recloned和检测造血支持能力。几个克隆行包括5 g3研究被选为造血细胞系(支持者15]。5 g3最初分为早期endothelial-like细胞系的基础上能够形成管状结构在基底膜基质16]。然而,它并没有成熟的内皮细胞表达标记,其血统起源一直不清楚。

冻结的股票5 g3倾斜,这样实验一直参与细胞通道3 - 4次冻结的股票。5 g3细胞生长从冻结的股票被刮前面描述的条件下,通过培养细胞(7]。简单地说,细胞培养在37°C公司5%₂在空气湿度95%杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (Sigma-Aldrich:城堡山、新南威尔士、澳大利亚)补充10%胎牛血清(FCS), 5×10⁻⁴M 2-mercaptoethanol, 10毫米玫瑰,100 U /毫升青霉素、链霉素100 ug /毫升、4 mg / l葡萄糖,6 mg / l叶酸,36毫克/ l L-asparagine, 116 mg / l L-asparagine盐酸(sDMEM)。胰岛素治疗是用来分离基质细胞实验。

2.3。流式细胞术

细胞被染色的抗体稀释fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)缓冲区(FCS DMEM /叠氮化钠0.1% / 1%)。抗体特定的足球俱乐部γII / IIIR (CD32 / CD16)(美国eBiosciences:圣地亚哥,CA) 5克/ 10⁶1毫升阻止细胞非特异性抗体结合细胞。荧光染料或biotin-conjugated抗体CD11b CD11c, mhc ii, F4/80, CD3, B220, CD150, CD48因子,Ly6G, CD45.2, CD29, CD51, CD54, CD31, gp38, CD105, Thy1.2,本来,VCAM1, CD140a, Flt3, NK1.1, CD19, Gr-1, Ter119,和c - kit,以及streptavidin-PE-Cy7 streptavidin-PE,和streptavidin-FITC从BioLegend购买(美国圣地亚哥,CA)。染色1μg / ml propidium碘(PI) (Sigma-Aldrich)被用来区分活细胞。盖茨Isotype-matched控制抗体用于设置评估特定的抗体绑定。平均荧光强度(MFI)计算平均通道荧光的净变化为特定抗体同形像控制之上。荧光- 1 (FMO)控制被用来为特定的抗体绑定设置盖茨在多色染色实验。流仪分析使用BD FACSDiva (Becton Dickinson)和FlowJo软件(美国或树明星:亚什兰)。

2.4。骨髓祖细胞的准备

单个细胞悬浮液准备通过骨髓细孔筛。红细胞裂解与血统(林)损耗进行了使用mac®磁珠技术(Miltenyi研究:格拉德巴赫,德国)如前所述[8,17]。

2.5。隔离的造血干细胞和祖细胞

Lineage-depleted(林⁻)骨髓祖细胞制备和沾fluorochrome-conjugated CD150抗体,Flt3, c - kit,本来描绘长期——(LT) HSC和multipotential祖细胞(MPP)排序。抗体的特定谱系标记被用来门成熟的造血细胞。LT-HSC CD150被排序⁺Flt3⁻林的子集⁻本来就⁺c - kit⁺(LSK)细胞和MPP CD150⁻Flt3⁺的子集LSK细胞(17]。排序进行BD FACSAria™II细胞分选仪(正)。

2.6。基质Coculture化验

评估在体外造血作用,林⁻骨髓细胞覆盖在1 - 5×10⁴细胞/毫升以上5 confluency g3层的80 - 90%。LT-HSC和MPP覆盖在1 - 5×10³细胞/毫升。控制文化包括基质或林⁻骨髓细胞只和LT-HSC MPP单独培养。在这些控件,7天内没有明显的造血细胞生存的文化。抑制剂使用包括伊马替尼(FLT3抑制剂、PDGFRA / B和c - kit酪氨酸激酶;蓝宝石生物科学:滑铁卢,新南威尔士、澳大利亚),Plerixafor (CXCL12 / CXCR4抑制剂信号;蓝宝石生物科学),XAV939 (WNT /β连环蛋白抑制剂;Sigma-Aldrich)、WntC59 (PORCN WNT激活抑制剂;Sigma-Aldrich),和榫眼(等级/γ分泌酶抑制剂;Sigma-Aldrich)。这些都是根据试验实验浓度影响。他们补充在cocultures两周一次的介质变化。评估细胞生产cocultures,不依从细胞收集每7天的愿望和替换介质。

2.7。显微镜

细胞形态学观察和拍摄使用evo®FL数字荧光显微镜(美国电子显微镜科学:哈特菲尔德,PA)配备了索尼®ICX445 CCD相机(索尼:Minato TKY,摩根大通(JP)。

2.8。转录组分析

总RNA制备使用RNeasy迷你包(试剂盒:克利夫顿山,维多利亚,澳大利亚)使用小鼠基因组转录组分析430 v2 genechips(美国Affymetrix,圣克拉拉,CA)。从提取RNA双链cDNA合成在一个两步的过程。第一链cDNA生产使用T7 - (dT)₂₄引物和上标II逆转录酶(英杰公司生命技术:威弗利山,维克,澳大利亚)。两样东西cDNA是从第一个合成的。cRNA被转录在体外和生物素标记双链DNA使用BioArray高产RNA转录标签工具包(Affymetrix)。cRNA杂化genechips这是洗和彩色Affymetrix流体。了Affymetrix GeneArray®扫描仪被用来分析genechips。

2.9。统计分析

数据作为样本的平均值±标准错误(SE)的大小 。统计分析涉及到复制的成对比较文化与控制。这些都是建立在同一时间,在某些情况下,在几个时间点化验。因此统计过程涉及Bonferroni调整学生的的显著性水平 - - - - - -测试( ),反映的事实是,多个一起进行了比较。

3所示。结果与讨论

3.1。5 g3间充质细胞

描述5 g3的血统起源细胞染色与特定的细胞表面标记的抗体。基质是表达CD105, CD29,本来,Thy1与间充质干细胞。细胞也表达了VCAM1、CD51 CD140a (PDGFRA)标记血管周的网状细胞(图1)。他们也gp38染色,成纤维细胞的网状细胞的一个已知的标记(18]。5 g3没有表达CD31或CD54内皮标记(图1)。5 g3基质不是证实了内皮和转录组分析在图2显示没有表达Cdh5,Fli-1,或Erg(19,20.]。5 g3也表示没有造血细胞的标记包括骨髓和淋巴(图子集1)。

3.2。5 g3基质支持骨髓形成

5 g3的造血支持能力在cocultures涉及覆盖种植长达7周的林⁻骨髓细胞(7)(图3(一个))。从这个实验室工作的历史表明,这类cocultures产生四个主要类型的细胞(7,8,17,21,22]。细胞在基质生产的图解表示cocultures覆盖与林⁻骨髓如图3 (b)。多个实验十多年没有确认生产T, B,或红色的细胞,但长期生产髓系树突状细胞是cocultures以来持续维持髓系祖细胞(7,8,16,17]。

不依从细胞中产生cocultures收集上层清液和染色与抗体特定CD11b, CD11c, mhc ii,和F4/80流仪鉴定细胞产生。总骨髓人口首次CD11b封闭⁺CD11c^{+ /−}人口。然后L-DC人口CD11b封闭⁺CD11c^{+ /−}F4/80⁺mhc ii⁻细胞,常规(c) DC-like CD11b细胞⁺CD11c^{+ /−}F4/80⁻mhc ii⁺不成熟细胞,骨髓细胞或CD11b“祖”⁺CD11c⁺/⁻F4/80⁻mhc ii⁻(图3(一个))。的CD11b⁻CD11c⁻F4/80⁻mhc ii⁻人口不是一个纯粹的人口为髓系祖细胞的祖细胞,但纯度和前兆。14天后,L-DC构成61.3%的细胞产生,cDC-like细胞(13.2%)和骨髓细胞(12.3%)小种群(图3(一个))。21天之后,主导L-DC人口明显,代表92.6%的细胞,小髓细胞的数量(4.2%)和假定的祖细胞(10.4%)也明显(图3(一个))。cDC-like细胞和骨髓细胞从前兆出现在林仅是暂时性的⁻骨髓和21到28天消失的文化7,8,21]。

3.3。Wnt信号控制生产Cocultures髓细胞

基因分析是在两个复制实验比较5 g3基质细胞在LTC生产。这些实验,5 g3细胞种植和通道三次RNA收集之前,和LTC建立了前6周总细胞RNA制备的集合。基于转录组分析,5 g3基质表达Wnt配体(特别是Wnt5a)和Wnt受体包括卷曲的受体2 (Fzd27()和卷曲的受体Fzd7)(图2)。控制造血细胞表达Fzd7和Wnt6(图2)。5 g3和造血细胞表达高水平的Ctnnb这个编码β连环蛋白,Wnt信号的一个重要转录监管机构轴蛋白负责监管β连环蛋白。评估Wnt信号是否重要在体外造血作用,添加了两个不同的抑制剂与林cocultures建立⁻骨髓细胞。通过降解XAV939扰乱Wnt信号β连环蛋白(23]。WntC59发生是一种潜在的抑制剂PORCN所需Wnt棕榈酰化,从而阻断激活Wnt家族的蛋白质(24]。

XAV939治疗显著降低了电池的生产与控制在所有时间点10μ克/毫升,1μ克/毫升,但在低浓度(图是无效的4(一))。XAV939作用于β连环蛋白,对于细胞生存和增殖(25]。相比之下,WntC59抑制剂给显著增加细胞生产在所有时间点的浓度为10μg / ml但没有效果在较低浓度(图4(一))。WntC59块Wnt家族的激活蛋白表达g3和5月5日发布祖细胞从维护和自我更新的状态,所以给增加骨髓细胞的分化。β连环蛋白和其他Wnt造血细胞表达的蛋白也cocultures隔绝,所以抑制剂可能是作用于一种或两种造血基质细胞(图2)。然而,在Wnt信号的情况下,特定的细胞抑制的目标是次要的证据表明Wnt信号控制造血系统。

3.4。伊马替尼在5 g3基质Cocultures抑制骨髓形成

基因分析5 g3揭示基因编码的表达生长因子和自洽场一样,CXCL12, PDGFA, VEGFA, IGF2,和CSF1但不是FLT3L CSF2或CSF3(图2)。的表达Cxcl12和KitL(CSF)符合假设5 g3反映了血管周的脾网状细胞类型。调查自洽场或CXCL12造血的作用在体外,具体的抑制剂伊马替尼和Plerixafor滴定与林cocultures建立⁻骨髓细胞。Plerixafor CXCL12趋化因子受体CXCR4受体的拮抗剂。然而,Plerixafor-treated cocultures给连续细胞生产在所有治疗cocultures与控制一系列浓度(图4 (b))。没有抑制细胞生产的实现,但增强的细胞生产实现了随着时间的推移,给文化处理显著提高细胞生产10μ克/毫升,1μ克/毫升(图4 (b))。这一增加可能与在HSC CXCL12迁移的作用,这种迁移的抑制可能导致分化。伊马替尼是一种选择性自洽场c - kit受体的酪氨酸激酶抑制剂,它还能抑制其他酪氨酸激酶包括PDGFR (CD140)和FLT3 [26]。配体的生产PDGFA和VEGFA造血细胞(图2)表明,PDGFRA和PDGFRB也可以抑制伊马替尼的目标。FLT3 / FLT3L交互的作用并不表示重要的基于基因表达的缺失(图2)。伊马替尼在10μg / ml显著抑制细胞生产从文化(图7天4 (b))。伊马替尼似乎法案通过减缓细胞祖细胞层面的发展,可能抑制自我更新,维护,或生存。伊马替尼可以通过绑定到c - kit祖细胞或抑制通过绑定PDGFRA或PDGFRB (CD140a / b)基质细胞表达的。抑制或这两种信号通路通过造血细胞生产是一致的。

3.5。角色等级信号在Cocultures造血作用

基因分析在图2确定几个Notch通路基因表达的基质包括Dll1,Dlk1,Dtx2造血细胞,即Dtx2,Jag1,Notch1。Notch信号的作用在体外造血作用因此调查。的γ分泌酶间接切口抑制剂,榫眼,因为它消除了信号通过防止切口胞内域的乳沟和易位到细胞核基因激活。在试验林的实验⁻骨髓cocultured / 5 g3, L-DC产生被发现明显高于cocultures对待榫眼为10.0μm . L-DC的子集,cDC-like细胞,骨髓细胞和CD11b⁻CD11c⁻子集列举丰富的祖细胞。这是符合早期的发现表明cocultures建立HSC和MPP g3 / 5只产生L-DC和没有其他骨髓或直流子集,尽管他们并维持一个祖人口(17]。10.0的抑制作用μM榫眼因此测试cocultures LT-HSC和MPP g3 / 5。CD11b L-DC是封闭的⁺CD11c^{+ /−}F4/80⁺mhc ii⁻细胞和CD11b“祖”⁻CD11c⁻F4/80⁻mhc ii⁻细胞,无髓细胞(CD11b⁺CD11c^{+ /−}mhc ii⁻F4/80⁻)或(CD11b cDC-like细胞⁺CD11c^{+ /−}mhc ii⁺F4/80⁻)生产。使用的控制策略如图5(一个)。

更高的数量在MPP cocultures L-DC都产生了10.0μM榫眼与控制(图5 (b))。众所周知,切口和Wnt信号,必须保持HSC和MPP处于未分化状态27]。观察到L-DC增加生产和MPP cocultures祖数字下降表明,缺口信号可能需要维护的MPP 5 g3基质cocultures这样抑制导致L-DC分化和更大的生产。相比之下,榫眼并不影响细胞生产HSC cocultures [2,28]。一种解释可能与信号冗余,这样5 g3基质提供一个数组HSC的信号分子,但更受限制的信号对MPP曲目。阻塞Notch信号可以有一个更深刻的影响从MPP比HSC L-DC生产。从这个实验室以前的工作表明,L-DC可以推出HSC和MPP, HSC产生MPP cocultures L-DC成为FLT3-dependent的发展过程(17]。

4所示。结论

为特定的支持证据在体外由脾造血基质线增加的可能性在活的有机体内脾脏包含造血干/祖细胞的利基市场。脾的描述基质第5行g3作为血管周的网状细胞现在支持假说与骨髓的类似利基市场。5 g3清晰表达间充质标记和密切与CXCL12-abundant网状细胞骨髓中描述的细胞表面标记和基因表达5]。而培养细胞的表型可能不同于他们在活的有机体内同行、细胞系模型上下文提供重要的信息。现在在这里,我们定义一个特定的角色5 g3基质在体外造血作用,至少证据,Wnt, c - kit /自洽场和PDGFR / VEGF信号。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

确认

这项工作是支持的项目拨款的HO澳大利亚研究理事会(# DP130101703)和澳大利亚国家健康与医学研究理事会(# 585443)。HKL支持由一个澳大利亚国立大学研究生奖学金。作者认识到感谢教授提供的统计帮助T O ' neill,债券商学院(澳大利亚昆士兰)。

补充材料

补充图1:基质细胞不表达造血细胞的标记。补充图2:切口的具体效应抑制体外造血作用。(补充材料)

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