法舒地尔通过激活MAPK信号通路促进骨髓间充质干细胞迁移并在脊髓损伤模型中的应用

摘要

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)被认为是治疗中枢神经系统(central nervous system, CNS)创伤的移植细胞，但其有限的移动性和归巢能力限制了其治疗效果。Fasudil (FAS)是一种有效的Rho激酶抑制剂，已被报道可以缓解神经损伤并诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。然而，FAS对骨髓间充质干细胞迁移的影响尚不清楚。本研究发现，FAS可显著增强体外BMSCs的迁移能力和肌动蛋白应力纤维形成，最佳浓度为30μ此外，我们发现MAPK信号通路的激活参与了这些FAS介导的现象。在体内，用FAS预处理的细胞显示出从注射部位到脊髓损伤部位更大的归巢能力。综上所述，目前的结果表明，FAS在两种情况下都是BMSC迁移的促进因子在体内，可能通过MAPK信号通路诱导肌动蛋白应力纤维的形成，提示FAS在中枢神经系统损伤的干细胞移植中可能具有协同效应。

1.导言

脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是一种常见的中枢神经系统损伤，不仅造成不可逆的神经功能障碍，而且给患者及其周围环境带来巨大的负担[1]尽管多年来对各种治疗策略进行了广泛的研究和试验，但脊髓损伤后瘫痪的治疗方法仍然难以捉摸[2，3.］．然而，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchystem cells, BMSCs)无限增殖和多系分化的结果逐渐改变了公众对脊髓损伤的悲观态度[4］．骨髓间充质干细胞在组织修复重建领域具有广阔的应用前景[5，6并已被用于各种临床试验。最近，骨髓间充质干细胞被认为是治疗脊髓损伤的一种替代策略，因为这些细胞能够分化为神经元样细胞，并参与轴突再生过程[7］．然而，只有一小部分移植细胞能成功穿过血脊髓屏障到达受损的靶组织或器官，存活率较低，阻碍了干细胞移植治疗在临床上的广泛应用[8，9]因此，迫切需要开发一种改进的方法来增强骨髓基质细胞的迁移和归巢，以达到更好的治疗效果。

基于干细胞的组织再生需要细胞从最初的定植部位迁移到病变部位[10]肌动蛋白丝-微管相互作用，由几个不同但相互作用的信号通路调节，是整个细胞迁移过程所必需的[11，12］．其中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞运动、增殖和凋亡的主要信号通路，参与脊髓损伤后神经元高兴奋性的维持[13- - - - - -15］．这些发现为今后的临床治疗提供了更多的方向。

Fasudil (FAS)是一种有效的Rho激酶(ROCK)抑制剂，对蛛网膜下腔出血患者有良好的治疗效果，且无严重副作用[16，17］．脊髓损伤后损伤部位RhoA和RhoB(人)或ROCK1和ROCK2(大鼠)表达水平上调[18］．通过FAS的抑制，有可能阻断Rho/ROCK通路在再生过程中的抑制作用，使损伤部位的血流恢复正常，从而进一步保护受损神经组织[19］．此外，Chiba等人还发现FAS可增强体内移植骨髓间充质干细胞诱导的轴突再生，从而对脊髓损伤发挥神经保护作用[10］．但FAS是否有促进BMSCs迁移的潜力，其潜在机制是否通过MAPK信号通路尚不清楚。

在本研究中，我们评估了经FAS体外处理的BMSCs的迁移能力，并探讨了其潜在机制。此外，我们进一步研究了FAS对移植到SCI大鼠体内的BMSCs归巢能力的影响。我们的研究结果为FAS在干细胞移植中发挥有希望的作用提供了理论基础中枢神经系统损伤的手术治疗。

2.材料和方法

2．1．材料

本实验使用的SD大鼠由广东省医学实验动物中心(中国佛山)提供，证号:44007200047868)。所有动物均按广州中医药大学动物指南进行治疗。α-修改了鹰的中型坦克(α-MEM)、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶取自Gibco-BRL (NY, USA)。Cell counting kit-8 (CCK-8)购自Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan)。FAS购于阿拉丁(纯度≥98%;中国上海)。SP600125、PD98059和SB202190购自Selleck Chemicals (TX, USA)。5 -溴-2-脱氧尿苷（BrdU）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州），Transwell系统购自Millipore（美国马萨诸塞州），罗丹明-鬼臼环肽购自Yeasen Biotech（中国上海），FAS溶解于PBS中，然后用培养基稀释。

2．2.细胞分离与培养

如前所述，通过离心和洗涤从4周大鼠胫骨和股骨的骨髓中分离BMSCs[20.］．将细胞接种到25ml培养瓶中培养α-MEM添加10%胎牛血清，置于5% CO的湿化气氛下的标准培养箱中₂95%的空气在37°C。每3天仔细更换一次培养基。当培养的细胞多数为BMSCs时，使用3 ~ 5代的细胞进行后续实验。

2．3.骨髓间充质干细胞免疫表型分析

第三代传代后，对BMSCs进行胰蛋白酶消化，然后离心。然后将细胞颗粒轻轻地重新悬浮到含有0.1%BSA的冰冷PBS中的单细胞悬浮液中，并将密度调整为3 × 10⁶细胞/毫升。接下来，大约3 × 10⁵用藻红蛋白(PE-)标记的抗CD44、CD34的一抗和相应的大鼠IgG1的同型对照抗体在室温下黑暗染色。用冰冷PBS冲洗两次后，用1%多聚甲醛(PFA)固定细胞，流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物表达及纯度。

2.4.骨髓间充质干细胞的分化

为了确定分离的骨髓间充质干细胞在体外是否具有多潜能分化能力，第4代的骨髓间充质干细胞在含有0.01%地塞米松、1%β-甘油磷酸，0.2%抗坏血酸或含0.01%地塞米松，0.3%抗坏血酸，1%胰岛素-转铁蛋白-硒+预混料，0.1%丙酮酸钠，0.1%脯氨酸，1% TGF-的软骨诱导培养基β诱导培养基每3天更换一次，细胞分化后用4%PFA固定20天 进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色和阿尔辛蓝染色。然后用PBS洗涤培养物三次，并用倒置显微镜和照相机拍摄照片。

2．5．细胞增殖实验

采用CCK-8法检测FAS对骨髓间充质干细胞增殖的影响。第4代骨髓间充质干细胞以1 × 10的密度播种在96孔板上⁴每孔4个细胞，每组4个重复。当骨髓间充质干细胞生长到80%汇合时，用血清饥饿细胞12小时，然后用含或不含不同浓度FAS(0、3、10、30和100)的完全培养基处理细胞μM)相应的12、24、36、48、72 h。在每个时间点，10μ每孔加CCK-8试剂L, 37℃孵育2 h。然后根据制造商的方案，在450nm波长下使用微孔板阅读器(Bio-Rad, USA)测量光密度。

2.6。划痕愈合试验

第3代骨髓间充质干细胞以1 × 10的密度播种于6孔板中⁶每孔细胞数。当细胞生长到90%汇合时，将培养基吸出，并将细胞血清饥饿12小时 H在均匀的细胞层上使用无菌微量移液管尖端轻轻地造成划伤，用PBS冲洗去除细胞碎片和漂浮细胞。在0、12和24时拍摄从伤口边缘迁移到受伤区域的细胞 h受伤后在同一区域。固定后，细胞用0.1%结晶紫（Beyotime，中国）染色30分钟 最小值，并按照前面所述进行观察[21].分析分三次进行。

2.7。Transwell迁移分析

使用Transwell系统(Millipore，美国)测量细胞迁移，使用聚碳酸酯滤膜8μ孔隙大小。细胞密度调整为1 × 10⁶细胞/毫升α-MEM含1%胎牛血清。细胞分为以下几组:(1)对照组(0μ上、下腔均为M FAS);(2) FAS组(上腔:0μM FAS，下腔室：30 μM FAS);(3) FAS + PD组(上腔:0μM FAS，下腔室：30 μM和20 μM PD98059);(4) FAS + SP组(上腔:0μM FAS，下腔室：30 μM和20 μM SP600125）；和（5）FAS + SB组（上议院：0） μM FAS，下腔室：30 μM和20 μM SB202190） μ上室加入细胞悬液L，下室加入含有不同试剂的基础培养基。24 h孵育结束后，用棉签拭除上腔所有未迁移的细胞，通过孔迁移的细胞用结晶紫染色。移至滤片下方的细胞用光学显微镜拍照，从每个插入物中随机选取5个视野进行计数。

2.8。若丹明Phalloidin染色

骨髓间充质干细胞在24孔板中生长，每个孔中有一个玻璃盖玻片，每个孔的密度为300个细胞。将细胞血清饥饿12小时 h，随机分为对照组、FAS组、FAS组 + PD组，FAS + SP组和FAS组 + 某人团体。对照组骨髓间充质干细胞给予药物治疗α-MEM，而实验组则与FAS反应，含或不含三种抑制剂之一。处理后，用4% PFA固定细胞20 min，用0.2% Triton X-100渗透细胞15 min，用5%牛血清白蛋白(BSA;生物夏普，中国)在室温下保存30分钟。PBS冲洗BMSCs 3次，100nm罗丹明phalloidin染色30min, 4 ，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;细胞信号技术，美国)标记细胞核，并安装。使用徕卡SPE-II共聚焦激光扫描显微镜(德国徕卡微系统公司)捕捉细胞图像。

2.9。免疫印迹分析

Western blot检测磷酸化细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)、磷酸化c- jun氨基末端激酶(JNK)和磷酸化p38蛋白表达。简言之，每个样品的细胞蛋白都是用细胞裂解缓冲液提取的。将等量的总蛋白在10% SDS-PAGE凝胶(Beyotime，中国)上电泳分离，然后电转移到PVDF膜(Millipore，美国)上。用5%脱脂牛奶阻断后，蛋白样品膜与一抗phospho-ERK1/2 (Abcam，美国)、phospho-JNK和phospho-p38 (Cell Signaling Technology，美国)在4℃下孵育过夜，然后在室温下用辣根过氧化物酶结合的二抗依次孵育90分钟。免疫印迹分析用化学发光成像分析仪(Bio-Rad，美国)捕获图像，并使用Quantity One软件(Bio-Rad，美国)对条带强度进行量化。

2.10。骨髓间充质干细胞的FAS预处理及BrdU标记

第3代骨髓间充质干细胞分为2组(1 × 10)⁶(1)对照组;(2)FAS处理组。FAS溶于PBS，最终浓度为30μM.各组细胞均用10 μ加入或不加入FAS的BrdU摩尔/升持续3天。通过荧光显微镜观察BrdU标记的效率。然后收集细胞用于后续实验。

2.11。挫伤脊髓损伤模型与骨髓间充质干细胞移植

18只成年雌性SD大鼠，体重270 ~ 300 g，随机分为模型组、骨髓间充质干细胞组和FAS +骨髓间充质干细胞组。每只动物均按前面描述的脊髓损伤模型进行中度挫伤，并进行轻微修改[22］．在戊巴比妥钠(40mg /kg, i.p)麻醉下，T9-T10水平行背侧椎板切除术，暴露硬脑膜脊髓。随后，一个10克重量的撞击器(直径2毫米)从50毫米的高度落在T10水平的暴露硬脑膜上。青霉素(3 × 10⁴U/kg)，于脊髓损伤后第3天肌注。醒后，每天手动按压大鼠膀胱两次，直至膀胱自游功能恢复。脊髓损伤7 d后，FAS +骨髓间充质干细胞组大鼠注射与FAS孵育72 h的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞组大鼠经尾静脉注射未经FAS预处理的骨髓间充质干细胞;模型组注射等量的PBS。细胞在注射前均用BrdU标记。

2.12。免疫荧光分析

术后4周，对所有大鼠进行深度麻醉，然后经心脏灌注冰冷PBS和4% PFA。切除脊髓节段(病灶中心5mm)，在同一固定液中固定过夜，用30%蔗糖脱水，OCT化合物包埋。样品被切成10个连续截面μ用PBS冲洗三次后，用5%BSA封闭连续切片，并在4°C下用含有BrdU一级抗体的溶液（细胞信号技术，美国）孵育过夜，以确定移植细胞在脊髓中的分布 在PBS中洗涤分钟，切片在室温下与二级抗体反应1小时 h、 细胞核用DAPI复染5分钟 然后，将载玻片安装并处理以进行显微镜观察。在每个切片的三个随机区域对阳性染色的BMSCs进行定量。

2.13。统计分析

数据进行统计学分析，以均数±标准差表示。两组之间的差异通过未配对的学生进行统计分析 -测试。采用单因素方差分析(ANOVA)评估组间差异。的概率值 被认为具有统计学意义。所有分析均采用spss24.0软件进行。

3.后果

3．1.大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

在培养初期，大鼠骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样和螺旋状排列，在第7天达到80%-90%的汇合(图)1(一)）.漂浮细胞在第3代完全消失(图)1(一))流式细胞术数据显示，表面标记物的表达和细胞纯度对CD44呈阳性（97.3%），对CD34呈阴性（0.9%），表明大多数细胞表达大鼠BMSCs的标准表面标记物（图1 (b)）.经诱导后，骨髓间充质干细胞持续分化为成骨/成软骨细胞，表明骨髓间充质干细胞具有多能性(图)1 (c)）.

3．2.FAS对骨髓间充质干细胞增殖的影响

为了研究FAS对BMSC增殖的影响，将细胞培养在培养基中，并用不同剂量的FAS（0、3、10、30和100）处理 μM) 12-72小时。然后用CCK-8法检测细胞增殖。如图所示2，对照组与FAS处理组间无显著差异，说明FAS对骨髓间充质干细胞增殖无明显促进作用。

3．3.FAS促进骨髓间充质干细胞体外迁移

接下来，我们通过划痕伤口愈合实验和Transwell迁移实验评估了FAS对细胞迁移的影响。在划痕伤口愈合实验中，大量经不同浓度FAS处理的细胞从伤口边缘迁移到伤口区域24 抓伤后h，而在抓伤伤口中仅发现少量未经处理的细胞（3） μ米和10μ米( ）和30μ米( )；数字3（a）)3点30分 μ10米,μ米,30μM将BMSCs创面愈合率分别提高到41.3%、60.5%和72.6%(图2)3 (b)）.合计，FAS (30μM)，对迁移有显著影响，但对增殖没有显著影响，因此被选择用于进一步的实验。Transwell迁移分析也得到了类似的结果。与对照组相比，fas处理组的迁移能力更大，30μM FAS导致迁移到下腔的BMSCs数量增加两倍（图3 (c)）.总之，这些数据表明FAS促进骨髓间充质干细胞迁移，最大的刺激作用在30岁μM。

3．4．FAS可能通过刺激肌动蛋白应激纤维的形成来增强骨髓间充质干细胞的迁移

在高等真核生物中，细胞可以通过不同的迁移方式进行迁移，而迁移的间充质细胞以肌动蛋白应力纤维的存在为特征。为了研究FAS对骨髓间充质干细胞肌动蛋白应激纤维的影响，我们采用免疫荧光技术检测了肌动蛋白细胞骨架在骨髓间充质干细胞中的分布和形成。肌动蛋白应激纤维用罗丹明phalloidin染色，在没有FAS的情况下肌动蛋白应激纤维形成能力明显不足(30μM） 这一观察结果在所有分析的细胞中都是一致的（图4）.

3．5．FAS上调MAPK信号通路的蛋白表达

MAPK信号通路的激活对细胞迁移过程至关重要。为了检测FAS是否能上调MAPK信号通路，我们用FAS（30）处理细胞 μM） 对于30、60、120或240 我们发现磷酸化ERK1/2、磷酸化JNK和磷酸化p38的表达水平显著增加30% FAS处理后min，在60℃时达到最大值 最小，120 最小，120 分别为最小值（图1）5）.

3.6。MAPK信号通路的激活有助于fas诱导的骨髓间充质干细胞迁移

为了进一步研究MAPK信号通路在FAS诱导的BMSC迁移中的作用，我们在ERK（PD98059）、JNK（SP600125）或p38（SB202190）的特异性抑制剂存在下，通过划痕愈合试验、Transwell迁移试验和罗丹明-鬼笔环肽染色分析了细胞迁移能力.如划痕伤口愈合试验和Transwell迁移试验所示（图6)，抑制剂组显示fas诱导的骨髓间充质干细胞迁移明显减少。在罗丹明phalloidin染色中也得到了类似的结果，与对照组相比，胞体上排列着大量的肌动蛋白应力纤维(图)7）.在三种抑制剂存在的情况下，FAS处理后肌动蛋白应力纤维数量减少，只观察到少量沿细胞膜分布的纤维。

3.7。FAS促进brdu标记的BMSCs在SCI模型中的归巢

为确保大多数BMSCs都已标记BrdU，将细胞置于含有10μ3天。免疫荧光结果显示BrdU阳性(BrdU⁺对照组BMSCs为90.6±3.3%，FAS治疗组BMSCs为90.9±2.4% ( ；数据8(一个)和8 (b)）.静脉移植后21天，采用BrdU免疫染色对移植至损伤脊髓的骨髓间充质干细胞进行追踪。植入细胞被鉴定为脊髓中不同大小的红色荧光细胞集合。BrdU的百分比⁺模型组、BMSC组和FAS组损伤部位的细胞 + BMSC组为4.2% ± 0.4, 40.3 ± 1.9和76.3 ± 分别为2.3（图8 (c)）.如图所示8 (d)， BrdU的个数⁺FAS +骨髓间充质干细胞组的细胞数约为骨髓间充质干细胞组的2倍。

4.讨论

越来越多的证据表明，间充质干细胞是组织工程、组织再生和基因治疗应用的一种有前途的细胞来源。从骨髓中分离的间充质干细胞可以分化为神经元样细胞并分泌一系列神经营养因子[23，从而引起了研究者对脊髓损伤治疗的关注。使用骨髓间充质干细胞进行细胞治疗依赖于这些细胞的home和长期移植到适当的靶组织的能力。然而，骨髓间充质干细胞迁移潜力的缺陷已经被讨论和考虑，阻碍了其在基因治疗或组织再生中的有效应用[24］．因此，迫切需要一种改进的方法来提高骨髓间充质干细胞的归巢率。在本研究中，我们假设FAS可能增强骨髓间充质干细胞的迁移。为了确定诱导骨髓间充质干细胞迁移的最佳FAS浓度，从0μM - 100μ在CCK-8试验中，我们发现FAS对BMSC增殖没有积极影响。结合划痕试验，我们发现FAS在30 μM比其他浓度的FAS诱导更多的骨髓间充质干细胞迁移，因此在后续实验中使用该浓度。此外，在Transwell迁移中进一步证实了FAS对BMSCs的迁移促进作用。我们进一步发现FAS促进了骨髓间充质干细胞中肌动蛋白应力纤维的形成，这可能是其促进骨髓间充质干细胞迁移的原因。

细胞骨架由三种主要聚合物体系组成:微管、微丝和中间丝[25］．在所有细胞中，肌动蛋白微丝网络对于维持细胞的形状和功能至关重要，尤其是在真核细胞中[26］．它在细胞过程中有多种作用，如细胞粘附，运动，细胞信号，细胞内运输，和细胞分裂。先前的研究表明，rho抑制剂如FAS不仅促进了间充质干细胞的体外迁移，而且还抑制了肌动蛋白应力纤维的形成[24］．然而，一些研究人员对肌动蛋白应力纤维的形成与细胞迁移之间的关系持相反的观点，这很可能是由于获得细胞的物种不同。间充质迁移细胞的一个特征是肌动蛋白应力纤维的存在，它被认为介导肌球蛋白ii型的收缩性。基于肌球蛋白ii的收缩性调节以空间和时间方式发生的各种细胞活动，以实现定向细胞迁移[27]间充质细胞经FAS处理后，肌球蛋白II将肌动蛋白重塑成细束。这种作用促进了肌动蛋白的积累α-肌动蛋白进入这些肌动蛋白-肌球蛋白束，导致肌动蛋白应力纤维的形成和组装[28］．值得注意的是，应力纤维之间有密切的相互连接，这可能会确保基于肌球蛋白ii的时空收缩性，以实现定向细胞迁移[29，30.］．有趣的是，一些细胞，如白细胞，在没有肌动蛋白应激纤维的情况下迁移得更快，因此一些研究人员得出结论，应激纤维的形成抑制了细胞迁移[31］．后来，这一结论被消除了，部分原因是由于对迁移和静止细胞中不同迁移模式和肌动蛋白应力纤维差异的更准确的理解。

越来越多的证据表明MAPK信号通路在BMSC迁移过程中起着关键作用[25，32- - - - - -34］．早期和晚期MAPKs的激活可能受到不同机制的调控，具有不同的功能[35，这一点仍有待澄清。当激活时，MAPKs增强肌球蛋白轻链激酶(MLCK)活性，导致MLC磷酸化增加[36］．MLC的磷酸化似乎对细胞内肌动蛋白丝的形成和重塑是必需的[37］．在我们的研究中，MAPK家族的三个原型成员，ERK1/2, JNK和p38在FAS处理30分钟后逐步磷酸化。目前的研究结果与另一项研究相似，表明FAS治疗逆转了缺血预适应中PD98059诱导的细胞凋亡[38］．根据目前的研究结果，MAPK信号通路的激活参与fas诱导的骨髓间充质干细胞迁移。

为了改善骨髓间充质干细胞的定向归巢，已经发展了许多技术，如基于干细胞的策略或基于靶组织的策略[39]尽管有很有前途的文献，但仍存在一些局限性，使这些结果难以推广到临床。与其他策略相比，FAS治疗本身被报道可促进SCI后轴突再生和功能恢复，可对BMSCs产生积极影响[40］．在本研究中，我们成功地用BrdU标记大鼠骨髓间充质干细胞，发现FAS对BrdU的标记率没有显著影响。脊髓组织免疫荧光检测显示，经fas预处理的骨髓间质干细胞向损伤区域迁移较多，主要分布在胶质瘢痕周围。这一发现表明FAS可以增强骨髓间充质干细胞在体内的迁移，这可能有助于在临床情况下建立科学验证的细胞移植治疗脊髓损伤的策略。虽然我们的研究没有提供组织学和行为差异的深入评估，但总的来说，FAS + BMSC组在后肢运动功能恢复方面优于对照组。在今后的研究中，还需要对FAS在这种联合治疗中的具体机制进行更详细的研究。

5.结论

综上所述，我们首次报道了FAS在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞的迁移，可能是通过激活MAPK信号通路诱导肌动蛋白应激纤维形成。FAS还可以提高挫伤脊髓模型中骨髓间充质干细胞的归巢效率。因此，骨髓间充质干细胞移植与FAS联合治疗可能在中枢神经系统损伤的干细胞治疗中具有潜在的作用。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no. 201430430429);基金资助:国家自然科学基金资助项目(81673992);2016 a020226008)。

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