CD34的治疗效果之间的相关性⁺细胞治疗和指导在活的有机体内血管生成在晚期弥散性冠状动脉疾病患者

文摘

背景。本研究旨在检测CD34的治疗效果之间的关系⁺细胞治疗在晚期弥散性冠状动脉疾病患者反映在血管造影评分和指导的结果在活的有机体内血管生成试验(DIVAA)在他们的孤立的外周血单核细胞(PBMC)——派生内皮祖细胞(epc)。方法。血管造影评分(0:< 5%;1:5 - 35%;2:35 - 75%;3:> 75%),提出了预处理和post-CD34血管密度的提高⁺治疗晚期弥散性冠状动脉疾病患者给30收到CD34⁺细胞治疗。患者分为低分集团(血管造影评分0或1, )和高分集团(血管造影2级或2级3 )。和KDR循环内皮祖细胞的百分比⁺/ CD34⁺/ CD45⁻,CD133⁺/ CD34⁺/ CD45⁻,CD34⁺在每个病人用流式细胞仪测定。PBMC-derived内皮祖细胞来自患者接受DIVAA通过14天在裸小鼠移植。DIVAA比率(即。,mean fluorescent units in angioreactors with EPCs/mean fluorescent units in angioreactors without EPCs) was obtained for each animal with implanted EPCs from each patient.结果和结论。内皮祖细胞的数量显示两组间无显著差异。DIVAA比高分组显著高于低分组( )。逻辑回归透露一个重要DIVAA比率和血管造影评分之间的联系(或3.12,95%置信区间CI: 1.14 - -8.55, )。ROC曲线下的面积(AUC) 0.8519 ( )。我们建议DIVAA可能是一个可靠的工具来评估冠状动脉血管化后CD34⁺细胞治疗。

1。介绍

骨骨髓来源CD34的能力⁺维管组织的细胞修复和再生被广泛报道在各种动物疾病模型,包括心肌,外围,脑缺血(1,2]。此外,CD34的临床意义⁺细胞治疗一直在强调的有前景的结果,许多临床试验登记患者缺血性疾病不适合手术或药物耐火材料(3- - - - - -8]。尽管越来越多的成功的基础研究到临床应用(即。,phase 1) studies has provided enough evidence to support the clinical safety of autologous stem cell treatment, the selection of optimal time points, cell dosage, and route of administration remains unclear [9,10]。

在我们之前的临床试验(6],严重的弥漫性冠状动脉疾病(CAD)患者冠脉内接受输血的circulating-derived CD34⁺细胞直接浓缩为内皮祖细胞(epc)被分为低收入和高分血管造影组的九个月后随访。心脏核磁共振的结果和三维超声心动图表现出显著改善左心室的射血分数(LVEF)高分的科目比低分同行。因此,研究结果表明,血管造影评分可以可靠地反映CD34后患者的长期预后⁺细胞治疗。另一方面,因为多达31.6%的病人38(12)不能令人满意地回应了细胞治疗研究中,预测治疗效果与血管造影评分可能的临床重要性选择先进的干细胞治疗的病人,如浓缩EPC纯度和数量在良好的组织实践(三磷酸鸟苷)设施。

本研究试图探讨协会血管造影的分级和指导的结果在活的有机体内终末期患者的血管生成试验(DIVAA)收到CD34弥漫性冠状动脉疾病⁺细胞治疗。

2。对象和方法

2.1。研究人口和协议

2015年2月至2016年3月,所有患者年龄20到80收到CD34⁺细胞治疗(第一阶段临床试验)阻塞性冠状动脉疾病(包括稳定和不稳定心绞痛和心肌梗死≤≥3个月Killip-3)与冠状动脉血管造影发现严重的弥漫性CAD、非实际候选人经皮冠状动脉介入或冠状动脉搭桥手术(CABG)(即。,when vessel involvement was too diffuse and the diameter was too small for intervention), those who had Canadian Cardiovascular Society class II–IV angina, and those whose thallium (Tl-201) scan showed reversible myocardial ischemia as well as those who had previously received CABG with venous or arterial graft failure that could not be revascularized by the catheter-based approach for either the native vessel or the graft were prospectively enrolled. Patients who were carriers of hepatitis B or C; those with history of surgery, trauma, or myocardial infarction within the preceding 3 months; those with liver cirrhosis, hematology disorders, renal insufficiency (defined as creatinine clearance )、恶性肿瘤、发热性疾病,急性或慢性炎症疾病研究,严重的二尖瓣或主动脉瓣返流,充血性心力衰竭(NYHA Fc 4),预期寿命小于2.0年,和年龄小于20岁或80岁以上;或者怀孕的妇女被排除在本研究之外。总共有38例加入我们之前的第一阶段临床试验,和结果已经出版6]。然而,3例患者由于到期心血管死亡和五个病人由于noncardiovascular到期长期随访期死亡。结果,只有30的38例参与本研究。

所有符合条件的患者收到CD34⁺细胞治疗超过一年进行了外周血抽样三级转诊中心的门诊(高雄长庚医院)的培养内皮祖细胞(epc)。血管生成反应的定量评估培养内皮祖细胞是由导演在活的有机体内使用裸小鼠血管生成试验(DIVAA)。不完整的临床随访患者被排除在外。冠状动脉的血管造影研究进行了9个月后细胞疗法。血管生成在血管摄影的程度比DIVAA每个病人。概述研究的协议如图1。本研究对人类研究机构审查委员会批准号(IRB长庚纪念医院:103 - 7569 - a3),在高雄长庚医院进行。

2.2。血管造影评分的定义

改进的血管生成/新血管形成对病人和post-autologous CD34⁺细胞治疗是血管改变的评估使用[描述船舶密度之前的评分系统3]。短暂,四个心脏病专家盲治疗达成共识了评分分数定义如下:年级0:不到5.0%;1级:5.0% - 35.0%;2级:大于35.0%小于或等于75.0%;三年级:大于75.0%。因为数量有限的病人为每个血管造影(也就是年级。,0, 1, 2, and 3), the patients were divided into low- and high-score groups. High-score was defined as grade 2 and grade 3, while low-score was defined as grade 0 and grade 1.

2.3。流式细胞术分析

识别来自外周血内皮祖细胞,应用流式细胞术对EPC表面标记的评估,包括套KDR⁺/ CD34⁺/ CD45⁻,CD133⁺/ CD34⁺/ CD45⁻,CD34⁺,如我们的最近的报告所述6,8,11]。短暂,单核细胞的密度梯度离心分离Ficoll-Paque加上™(通用电气医疗集团生物科学,乌普萨拉,瑞典)和进一步孵化荧光dye-conjugated单核抗体。孵化后,单核细胞被固定在1%多聚甲醛的流式细胞术分析通过使用fluorescence-activated细胞分选仪(FACSCalibur系统;美国贝克曼库尔特,CA)。循环内皮祖细胞的分析每个样本重复进行,和平均水平被报道。

2.4。内皮祖细胞培养

聚蔗糖梯度被用来分离外周血单核细胞(PBMCs)从血液收集肝素管文化的内皮祖细胞(EPC)和人类EPC的协议文化被描述在我们先前的研究[6,8]。总之,全血与PBS稀释(1:1)含2%胎牛血清(的边后卫;美国CA Gibco BRL)和7毫升的稀释血液然后仔细地覆盖到5毫升Ficoll-Paque +(通用电气医疗集团生物科学,乌普萨拉,瑞典)。PBMC层被离心分离没有刹车和PBS洗。孤立PBMCs培养内皮生长medium-2 (EGM-2;Clonetics®、钙、美国)fibronectin-coated菜在37°C公司为5%₂。

2.5。导演在活的有机体内血管生成试验(DIVAA)

内皮祖细胞的血管生成反应每个病人被定向定量评估在活的有机体内血管生成试验(DIVAA)裸鼠根据制造商的协议(Trevigen,医学博士,美国)。简单地说,女性裸体小鼠,6到8周的年龄,和2%异氟烷麻醉angioreactor的植入。两个切口是dorsal-lateral裸鼠皮肤,一人一边,约1厘米长。(即两个angioreactors含有生长因子。,没有(即右侧)和两个。,左侧卧)培养内皮祖细胞(4×10⁵epc / angioreactor)从一个病人在手术切口皮下植入一个裸小鼠被关闭中断4 - 0尼龙缝线(数字2(一个)和2 (b))。14天之后,30裸体小鼠携带来自30个病人的内皮祖细胞与2%异氟烷麻醉前仔细切除angioreactors植入。细胞的收集angioreactor孵化与异硫氰酸荧光素(FITC)结合凝集素在一夜之间在4°C。血管化在angioreactor评估分光光度计(热科学™Fluoroskan提升™FL微型板块荧光计,万塔,芬兰)在485 nm基于特定绑定的程度凝集素和内皮细胞之间的反映在FITC-lectin荧光信号的强度(即。相对荧光单位,RFU)。14日植入后,血管生成和新血管形成的水平反映在平均荧光强度的两个angioreactors右侧(即。内皮祖细胞),在另外两个左边(即。相比,控制)是使用DIVAA比率(即。,mean fluorescent units in angioreactors with EPCs/mean fluorescent units in angioreactors without EPCs) for each animal. All animal experimental procedures were approved by the Institute of Animal Care and Use Committee at Kaohsiung Chang Gung Memorial Hospital (Affidavit of Approval of Animal Use Protocol No. 2014121814) and performed in accordance with the National Research Council of the National Academies Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition, 2011).

2.6。统计分析

所有的值表示为 在适当的地方、数字或百分比。连续变量的差异分析了两组之间的独立t以及。超过三个独立团体的方式通过方差分析进行了分析。连续变量配对比较t以及对matched-paired样本。皮尔森相关测试是用来评估两个定量变量之间的关系。二元逻辑回归模型进一步用于评价血管生成相关评分的主要因素。使用SPSS统计软件进行统计分析为Windows版本13 (SPSS为Windows版本13;SPSS,芝加哥,IL)。的值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。研究患者的特点

38岁的患者严重的弥漫性CAD进行CD34⁺细胞治疗,8个病人到期的长期随访。因此,只有30的38个病人参与本研究(图1)。根据随访造影评分,CAD患者分为低分组(血管造影0或1年级, )和高分集团(血管造影2级或2级3 )。的特点,总结了30例表1。年龄、性别、身体身高、体重、体重指数、CAD的风险因素,和以前的中风的发生率,旧的心肌梗死,冠状动脉搭桥手术病人低分和高分组没有差异。此外,发现血管疾病和使用药物并没有显示这些团体之间的显著差异。实验室的研究结果也进行了总结。血清肌酐水平,肌酐清除率,中度和重度的慢性肾病的发病率(CKD、第三阶段和第四阶段)三组之间没有什么差别。与KDR循环细胞的百分比⁺/ CD34⁺/ CD45⁻,CD133⁺/ CD34⁺/ CD45⁻,CD34⁺三组干细胞标记显示,三组之间没有区别。

3.2。在活的有机体内血管内皮祖细胞由DIVAA的潜力

30的荧光强度比较双方的老鼠显示明显高于相对荧光单位(RFU)右侧(即。内皮祖细胞)相比,在左边(即。(控制) ,图2 (c))。阐明内皮祖细胞的血管生成和新血管形成能力是否与患者随血管造影成绩,内皮祖细胞被分成低分集团(血管造影 或1, )和高分集团(血管造影 或3, )进行比较。比较两组之间的DIVAA证明了DIVAA高分组的比例明显高于在低分集团( )(图2 (d))。

3.3。协会与血管造影评分DIVAA比率

研究DIVAA比率之间的关系和血管造影评分,单变量和多变量逻辑回归模型被用来找到重要的变量之间的关系和血管造影结果。单变量逻辑回归分析应用于选择重要的变量( )(表2)。DIVAA比率时用作预测血管造影发现后自体CD34的工具⁺细胞治疗,患者更高DIVAA比例更高的血管生成/ neovasculature分数(或3.12,95%置信区间CI: 1.14 - -8.55, )。

3.4。预测能力的DIVAA比率

澄清DIVAA的力量在预测患者的血管造影结果收到自体CD34⁺细胞治疗,接收机算子特征(ROC)曲线分析(图3)。当低和高血管造影评分之间进行比较,ROC曲线下的面积(AUC)为0.8519(95%置信区间:0.7132—-0.9905, )。一个最佳分界点为3.07使用ROC曲线确定。当患者根据分界点划分,高分的敏感性和特异性分别为72.22%和100%,分别。此外,如果我们要正确识别病人的高分(超过85%),一个适当的分界点的价值被认为是1.965与敏感性88.9%,特异性50.0%,分别。

4所示。讨论

本研究试图探讨血管生成之间的关系/新血管形成严重的弥漫性冠状动脉疾病患者的内皮祖细胞收到自体CD34⁺细胞治疗和血管造影评分,证明提高DIVAA比率与血管造影评分较高有关。目前的调查代表第一项研究解决的可能性使用DIVAA小鼠模型与临床结果。

CD34⁺是最常用的标记的内皮祖细胞(epc)在临床血液学和干细胞试验(4,6,12]。虽然在造血干细胞分化转化的能力和内皮祖细胞心脏细胞已经被广泛讨论(13,14),新血管形成仍收到CD34后最重要的结果⁺细胞治疗通过直接输血细胞整合到新成立的船只和旁分泌的方式释放血管生成细胞因子(1,15]。因为我们发现许多基线特征和常规实验室发现不能清楚地解释提前血管造影评分的变化,我们专注于孤立的CD34的再生潜力的调查⁺细胞可能反映了冠状脉管系统在当下研究的新血管形成。

管形成试验是一个常规的血管生成试验广泛应用于确定内皮祖细胞的血管生成潜力在体外。然而,以前的研究已经表明没有显著差异EPC-mediated血管生成低分到高分群体在g - csf(粒细胞集落刺激因子)刺激管形成试验(6]。有三个优点使用DIVAA取代传统管形成的分析来确定EPC-mediated血管生成/新血管形成。首先,DIVAA更紧密地模仿人体的生理环境。第二,DIVAA允许长期观察9到15天,使血管化的更准确的评估。相比之下,capillary-like结构管形成分析,通常观察到6至12小时的潜伏期后,总是消失在长时间的潜伏期,长期观察血管化是不可能的。第三,传统管形成化验的结果,取决于细胞密度和细胞迁移能力(16,17)不能可靠地评估EPC-mediated新血管形成,主要是由于内皮祖细胞的分化成熟的内皮细胞(18]。因此,DIVAA不仅提供生理环境EPC分化为成熟内皮细胞,但它也允许长期观察血管生成/新血管形成。

管理CD34的疗效⁺细胞对缺血性心脏病患者被认为是归因于内皮祖细胞的血管生成能力。使用CD34治疗效果的差异⁺细胞在先前的研究可能归因于这样一个事实:内皮祖细胞只占小比例的CD34⁺细胞还包括几个亚种群的造血干细胞(19- - - - - -21]。事实上,它已经表明,内皮祖细胞只占1%的循环单核细胞(22]。因此,孤立的CD34的直接输血⁺内皮祖细胞的细胞可能不能保证足够的纯度达到一个最理想的治疗结果。另一方面,足够数量的内皮祖细胞可能不会达到预期的治疗目标从内皮祖细胞的血管生成能力,包括增殖、分化,并动员骨髓,可能受损的慢性病如糖尿病、高血压和肾脏功能障碍,常常导致系统性氧化应激(23,24]。因此,干细胞临床应用的质量应该考虑(21]。为了这个目的,一个长期的评估在活的有机体内血管生成潜力DIVAA可能有助于区分EPC-mediated血管生成的能力/新血管形成不同患者的基础疾病。

干细胞疗法已流行作为标准治疗方案,改进的概念“干细胞药物”的产品,如安全、复制、和效率,开发25]。本研究的结果显示了DIVAA之间的显著相关性比率和临床血管造影评分,建议使用这个的可能性比作为选择的指导后续的治疗策略。例如,高DIVAA比率可能会建议患者接受自体CD34⁺细胞直接与最小操纵,而患者低DIVAA比可能会收到epc浓缩在良好的组织实践(三磷酸鸟苷)设施内输血。尽管大多数的干细胞临床试验集中在调查的最优路线,剂量,为干细胞管理和时间,目前的研究结果表明,干细胞的质量和数量的确定需要达到一个最理想的治疗结果个体基于精密医学的概念,强调剪裁医疗满足个人需求(26]。

5。限制

这项研究有一定的局限性。首先,本研究样本量相对较小。因此,病人从我们II和III期临床试验将在未来加强我们的发现。其次,由于内皮祖细胞CD34之前没有孤立的研究对象⁺细胞治疗的价值DIVAA预测随后的血管造影评分仍不清楚。第三,很难区分是否EPC-directed血管生成由proangiogenic旁分泌的影响因素或直接并入新船在我们DIVAA模型。

6。结论

本研究的结果显示了EPC之间的显著相关性血管生成能力从晚期弥散性冠状动脉疾病的患者在活的有机体内小鼠模型及其血管造影评分,暗示可能使用这个模型的预测临床结果CD34之后⁺细胞治疗。

的利益冲突

作者报告没有关系,可能被视为利益冲突。

作者的贡献

黄Tien-Hung Cheuk-Kwan太阳,Hon-Kan Yip,李Fan-Yen构思研究和参与的设计研究中,数据采集和分析以及起草的手稿。yi ling Chen Pei-Hsun唱,Chi-Hsiang楚负责实验室分析和故障排除。梅尔·s·李和袁萍林参加了数据采集、分析、和解释。所有作者阅读和批准最终的手稿。黄Tien-Hung Cheuk-Kwan太阳,Fan-Yuan李,Hon-Kan Yip同样对本文亦有贡献。

确认

本研究支持计划资助从长庚医院、长庚大学(没有。CMRPG8E0941)和科技部,台湾(没有。102 - 2314 - b - 650 - 004)。

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