文摘

肺气肿是一种呼吸道疾病,表现为肺泡破坏导致气流限制和减少肺功能。尽管有广泛的研究,肺气肿的病理生理学了解甚少,有效的治疗方法仍失踪。证据表明,间充质干细胞(msc)拥有的能力嫁接和诱导修复受伤的组织通过旁分泌作用。因此,本研究的目的是测试的影响气管内的管理lung-derived鼠标msc elastase-induced肺气肿模型。肺功能(静态肺合规)显示增加刚度引起的弹性蛋白酶,而图像测量结果(平均线性拦截和组织/肺泡区)证实了肺泡破坏的严重程度。相反,MSC政府部分恢复肺弹性和肺泡结构。没有证据表明msc获得上皮表型,我们检测到一个增殖活动增加表面活性剂的蛋白质和水通道蛋白5 - C-positive肺细胞,表明MSC-driven旁分泌机制。肝细胞生长因子的数据显示中介放大MSC-driven组织损伤后反应。我们的研究揭示了支持lung-derived msc的性质,虽然完整的识别机制由msc策划和负责上皮修复受伤后未实现的一个关键方面。

1。介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺气肿、哮喘、一起非常盛行全球肺部疾病(1,2]。这些疾病的特点是气流限制,气道炎症,和高反应性3,4),可以与其他疾病(5,6]。特别是,肺气肿的定义是一个进步的疾病与吸烟和其他呼吸道侮辱,导致永久性扩大和肺泡和细支气管的损失7]。长期吸入刺激物吸引炎症细胞和炎症介质进入肺部,在那里他们损害protease-antiprotease平衡从而导致的破坏肺泡单位(8]。鉴于这种疾病的不可逆性和大量的死亡,而且目前的疗法的好处,肺组织内稳态的理解机制对开发新疗法针对至关重要补充的肺泡。因此,肺再生生物学领域的研究在寻找人类肺部疾病防治新策略。

显著的证据表明,间充质干细胞(msc),从成人器官如骨髓和脂肪组织和管理在受损组织,可能引起器官修复主要通过旁分泌作用[9,10]。尽管msc移植程度的相互矛盾的结果,显然,这些细胞可能是防止组织损伤能力独立于移植的11,12]。msc的有用性,其好处也与他们的低免疫原性13),已被证明在肺部疾病的各种模型14,15]。特别是,msc从骨髓和脂肪组织在一个实验性的治疗效果香烟烟雾诱发和elastase-induced肺气肿模型(16- - - - - -19]。到目前为止,一些临床试验的安全性和可行性调查MSC政府报告严重不良事件虽然表明适度的影响尽管无疑效果在动物研究20.,21]。

大多数研究都集中关注骨髓和脂肪tissue-derived msc评估其潜在的肺部疾病,这些来源和科学界的方向基本上是由准备从这些网站获得msc。另一方面,是知之甚少的生物学意义lung-derived msc还因为明显的困难获取肺活检,对这些细胞的研究有限。尽管如此,肺msc可能在肺泡内稳态和维修相关受伤后,可能需要考虑作为一个潜在的工具或细胞疗法的目标,包括其他肺细胞群。因此,我们的研究的目的是测试肺气管内的管理msc的影响到elastase-injured肺气肿。与大多数的研究利用细胞的系统性管理,在我们的工作中,气管内的交付使用。这条路线在系统性输液带来诸多好处,如细胞数量的减少和低风险嫁接其他器官。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和文化

6 / 8肺部都是从丽江雄性C57BL / 6 j小鼠(查尔斯河实验室)为每个隔离小鼠lung-derived msc。样本中收集100毫米直径文化菜肴和很快就洗DPBS w / o Ca2 +和毫克2 +(Euroclone)洗出的血。大血管和支气管组件被移除。为了获得一个细胞悬液,肺部微小地剁碎,保持酶的分离与prewarmed胶原酶溶液(280 U /毫升II型胶原酶(沃辛顿),100 U /毫升青霉素,和100年μg / ml链霉素(笔/喉炎,Euroclone)]。45分钟消化后37°C下风潮,胶原酶被释放通过添加预冷淬火的双重卷缓冲(0.5%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich);笔/喉炎]。细胞悬液进一步纯化由几个段落通过细胞过滤器[70和40μm毛孔(BD生物科学)]和离心机在1200转10分钟去除碎片。细胞颗粒收集然后用DPBS洗净。后离心10分钟(1200 rpm),细胞颗粒镀在60毫米直径文化菜肴。msc被选中的附着力。删除不依从细胞后,细胞培养αmem补充10%的边后卫和笔/喉炎和播种密度7×104细胞/厘米2。从通道3使用的细胞。

2.2。流式细胞术

流式细胞仪分析了MSC表型特征,发现了10000个细胞表面标记。PE-conjugated抗体CD14、CD34、CD44 CD45 CD73, CD90、CD105是使用(BD生物科学)。同形像控制是用来定义阈值为每个特定的信号。数据被FACSAria收购(BD生物科学),分析了FCS表达6(新创软件)。

2.3。GFP慢病毒感染

msc被转导与Cignal慢病毒携带绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因的莫伊50(试剂盒)。24小时后,细胞被洗和转导中被新鲜培养基所取代。在这一点上,Cignal记者结构是集成到靶细胞的基因组DNA。选择细胞稳定表达GFP报告基因,嘌呤霉素(5μg / ml)选择了一个星期。收集GFP-positive msc,在新鲜培养基稀释,用于在活的有机体内程序。

2.4。动物房

实验动物保健和使用委员会批准的协议是坎帕尼亚大学的Luigi Vanvitelli”(294/2016-PR 24.03.2016)。动物保健遵守意大利法规保护动物用于实验和其他科学(116/1992)以及与欧盟指南的使用实验动物(2010/63 /欧盟)。老鼠被安置在动物设施坎帕尼亚大学的Luigi Vanvitelli”。“食物和水供应随意。室温设定在22°C-24°C,相对湿度在40% - -50%,日夜周期在12 h / 12 h。为了防止任何可能的动物痛苦,所有实验动物与盐酸氯胺酮和medetomidine麻醉。所有的老鼠被颈椎脱位牺牲。

2.5。试验协议

肺气肿是诱导在丽江女C57BL / 6 j小鼠气管内的政府的猪胰弹性蛋白酶(PPE;100年80 U /公斤μl(0天PBS)。老鼠被随机分成两组:(1)PPE-MSCs ( ),接收肺msc (5×104细胞在50μl中每个动物)和(2)个人防护用品( ),接收标准电池中。msc在21天或介质气管内的管理。天真的老鼠( ),不接受任何治疗,作为控制。BrdU注射一天两次(50毫克/公斤,i.p。)和添加到饮用水(1毫克/毫升),以确定新形成的细胞。所有老鼠都牺牲了31天。

2.6。气管内的管理

电池管理之前,老鼠与氯胺酮麻醉(40毫克/公斤,i.p。)和盐酸medetomidine(0.15毫克/公斤,i.p)。一个20量度定制的导管插入气管通过口腔和连接到一个鼠标通风机(哈佛装置)。检查后的正确放置导管,通风机断开连接,提供必要的工具(PPE、msc、介质)是由使用细针注射器。然后,老鼠机械通风3分钟和放置在一个温暖的房间,直到他们恢复意识(5 - 15分钟)。

2.7。静态肺合规

动物祭祀之后,体腔被打开了,一个切口在气管,一个20量度导管插入并缝合固定。静态肺合规与5毫升注射器连接到测量气管通过导管通过一个三通活塞和水压力计。通货膨胀曲线,0.2毫升的空气手动注射,3.0 cc。结果在每一增量的压力注入是读取压力计注射后大约1 s。通货紧缩是阅读以相同的方式,手动取消0.2 cc,直到达到最大体积的3.0 cc。通货膨胀和通货紧缩的曲线测量每个动物的两倍。成交量追踪是压力的函数。静态肺是通过每个通货紧缩的平均斜率曲线的中点(22]。

2.8。组织准备

组织学,肺灌注和固定如前所述23]。组织部分,5μ米厚度,。的形态学研究部分与苏木精和伊红染色(圆),Sigma-Aldrich)。分子生物学分析,肺被切除,随后储存在−80°C。

2.9。形态测量学

的形态学评估包括牙槽间的平均距离的测定(平均线性拦截)和组织和空域的计算区域,肺泡数量更正。均值线性拦截是衡量网格叠加在每个图像和计算的次数肺泡壁拦截网格线。这个方程 在哪里N的次数是横向的组织,l是横向的长度,米是拦截的总和,意味着线性拦截(22,24]。形态学测量完成Image-Pro +软件(媒体控制论)。

2.10。免疫组织化学

注入msc被鸡多克隆anti-GFP抗体检测(1:500年,一夜之间在4°C) (Abcam)。鼠单克隆CD45(1: 30,一夜之间在4°C)(罗福斯生物)是用来排除造血血统在msc。肺细胞被免疫染色水通道蛋白5 (AQP5;兔多克隆1:100年,一夜之间在4°C) (Abcam)和表面活性剂蛋白C (SFTPC;兔多克隆1:100年,一夜之间在4°C)(圣克鲁斯生物技术)。自行车使用鼠标单克隆细胞可视化anti-BrdU抗体(1:10、1 h在37°C)(罗氏诊断)。的表达肝细胞生长因子(HGF);兔多克隆1:100年,一夜之间在4°C) (Abcam)及其受体c-Met(鼠标单克隆,1:100年,一夜之间在4°C)(肺细胞信号)也被检测到。核与DAPI染色(Sigma-Aldrich)。二次抗体与FITC共轭、TRITC或Cy5使用稀释的1:100 1 h在37°C(杰克逊ImmunoResearch)。 The quantification of newly formed cells was performed by counting at least 200 AEC1 or AEC2 ( 从每个实验组)和表达为BrdU-positive细胞的百分比。样品进行了分析与徕卡显微镜DM 5000 b蔡司LSM 700共焦显微镜。

2.11。西方墨点法

组织样本中均质裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)。蛋白质浓度由布拉德福德决定化验(Bio-Rad实验室)。20μ克蛋白质提取当时在8 - 12% sds - page分离bis-acrylamide凝胶和转移到聚偏二氟乙烯膜(热费希尔科学)。与主要探讨了膜抗体(1:1000 1小时在室温下)对AQP5 (Abcam) SFTPC(圣克鲁斯生物技术),HGF (Abcam)、表皮生长因子(EGF) (Elabscience)和血管内皮生长因子(VEGF)(圣克鲁斯生物技术)。加载条件测定glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH;1:20000 1小时在室温下)(Sigma-Aldrich)。Peroxidase-conjugated二级抗体(圣克鲁斯生物技术)是用于初级抗体检测,抗体绑定被可视化增强化学发光(1:10000 1小时在室温下)(默克密理博)和图像采集和分析使用Chemidoc-It成像仪(紫外线产品)。乐队的光密度测定和分子分析软件(Bio-Rad实验室)。

2.12。统计分析

结果报告为均值±SD。统计数据进行利用GraphPad棱镜(GraphPad软件)。意义在多个单向方差分析比较确定的纠正与Bonferroni期末测验。的值 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。Immunophenotyping和组织移植

msc孤立的表现型健康小鼠的肺是解决使用流式细胞仪。Lung-derived msc显示表面CD44的表达,CD73, CD90、CD105,与间充质来源的细胞的形象一致。msc还发现部分表达祖CD34标记和完全缺乏造血细胞CD14和CD45标记(图1(一))。隔离和扩张后,msc被感染GFP-carrying慢病毒(图1 (b))。免疫荧光分析解决的能力msc在受伤的灌输组织透露GFP-positive细胞的大量存在,对造血表面标记CD45不利,肺结构后十天内管理局(数字1 (c)- - - - - -1 (f))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图1
MSC描述和移植。流式细胞术(a) Immunophenotypic概要的msc与成年小鼠肺。灰色阴影峰值显示CD标记;红色柱状图表示同形像控制。(b)代表的形象msc慢病毒转导后GFP(绿色)。(c, d)在活的有机体内移植气性GFP-positive msc(绿色)的肺气管内的细胞后十天。(e)代表的形象GFP-positive msc(绿色)和CD45-positive细胞(红色)。(f) - GFP染色的PPE控制肺。核与DAPI复染色(蓝色)。酒吧规模:20μm (d, e), 50μm (b, f), 100年μm (c)。
3.2。形态、形态测量学和功能

组织学分析显示明显的领空的扩大和消灭肺部肺泡壁注入了弹性蛋白酶。这些变化是减毒的滴剂msc(图2(一个))。量化的肺泡毁灭意味着线性拦截显示显著增加PPE组与天真的老鼠相比,虽然msc诱导治疗明显降低(图2 (b))。组织区、肺泡区,肺泡数量被用于计算额外的形态学参数。PPE组表现出组织和肺泡的增量区域肺泡数量(归一化),持续的增加肺泡大小。另一方面,msc管理积极影响肺结构和部分恢复肺泡气肿小鼠(图中观察到毁灭2 (c))。评估组织学改变是否伴有肺力学的变化,静态肺合规检查。合规,PPE组显著增加由于贫穷的弹性反冲,而不是降低后气管内的msc(图2 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
肺组织学和功能。(一)苏木精和伊红染色在肺组织31天。(b)的形态学分析的线性拦截。(c)量化每个肺泡组织和肺泡面积。(d)静态肺功能测量。数据表示为均值±SD ( 在每个实验小组)。酒吧规模:200μm。 和天真; 与PPE。
3.3。Lung-Derived msc的命运

回答这个问题的存在的msc可以参与cell-treated老鼠,结构和功能改变在活的有机体内msc是检查的命运。msc移植没有伴随着显著分化肺血统,缺乏colocalization GFP染色证实的肺泡上皮I型和II型细胞(AEC1和AEC2)标记,分别AQP5和SFTPC(数字3(一个)和3 (b))。因此,排除,msc可以获得(至少在很大程度上)一个pulmonary-committed表型开幕msc的可能性可能间接编排的激活其他细胞组织损伤的修复。elastase-treated肺组织的免疫印迹显示上皮标记的内容AQP5 SFTPC,符合对肺泡壁的破坏性影响。新上皮的形成是由AQP5表达的增加和SFTPC观察肺部接收肺气管内的管理msc(数字3 (c)和3 (d))。事实上,PPE-MSCs组中,一个重要的细胞增殖率确认新的薄壁组织的形成。有趣的是,肺泡上皮细胞的分析显示高增殖率AEC2(数字3 (e)- - - - - -3 (h))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图3
生物效应由msc。(a, b)代表的图像GFP-positive msc(绿色)缺乏肺泡上皮在肺气肿的肺实质的承诺。肺泡I型(a)和II型(b)上皮细胞表达水通道蛋白5 (AQP5;品红色,伪彩色)和表面活性剂蛋白C (SFTPC、红色),分别。(c, d)蛋白表达AQP5 (c)和SFTPC (d)在肺免疫印迹。(e, f)增殖活动(BrdU;白色,伪彩色)PPE-MSC组;肺泡I型(e)和II型(f)上皮细胞表达AQP5(品红,伪彩色)和SFTPC(红色),分别。分散GFP-positive msc(绿色)也存在。核与DAPI复染色(蓝色)。 (g, h) Quantification of newly formed alveolar type I (g) and type II (h) epithelial cells. Data are expressed as the mean ± SD ( 在每个实验小组)。酒吧规模:20μm。 和天真; 与PPE。
3.4。旁分泌作用引起Lung-Derived msc

在寻找可能驱动修复和再生过程的机械的见解,我们检查了一些生长因子如EGF的表达,VEGF和HGF。这些因素在正常肺的存在表明他们的角色在组织内稳态的生理条件。而西方墨点法分析发现EGF和VEGF的无意义的调制,HGF表达,低PPE老鼠,显著提高了msc(数据管理4(一)- - - - - -4 (c))。原位分析证明了内部和细胞外的胶质瘤治疗的小鼠的肺实质与msc。此外,GFP-positive细胞呈现分散细胞内生长因子(数据的分布4 (d)- - - - - -4 (f))。HGF信号MSC-treated肺的重要性得到了提升内容的受体c-Met也表达了AEC2(数字4 (g)- - - - - -4(我))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
(我)
(我)
图4
生长因子和msc。(a - c)蛋白表达表皮生长因子(EGF) (a)、血管内皮生长因子(VEGF) (b)和肝细胞生长因子(HGF) (c)在肺部免疫印迹。(d) -控制HGF染色。(e)代表图像显示(红色)在胶质瘤GFP-positive msc(绿色)的距离。(f)细胞内的内容(红色)在胶质瘤GFP-positive MSC(绿色)。(胃肠道)c-Met表达式(红色)在肺实质的天真(g), PPE (h)和PPE-MSC(我)组;肺泡II型上皮细胞显示由SFTPC(绿色)。核与DAPI复染色(蓝色)。数据表示为均值±SD ( 在每个实验小组)。规模的酒吧:10μ米(f)和20μ米(胃肠道)。 和天真; 与PPE。

4所示。讨论

我们报告,气管内的管理lung-derived msc改善肺泡弹性蛋白酶诱导的损害。这种效应可能是介导HGF的释放MSC-dependent旁分泌机制。HGF / c-Met系统的激活,通过促进肺泡上皮细胞的存活和增殖,可能是一个主要决定因素引发肺气肿肺修复反应。

弹性蛋白酶模型“翻译”主要致病机制占慢性阻塞性肺病:protease-antiprotease失衡,提高蛋白酶的生产决定中断的肺泡炎症细胞完整性(25]。在目前的研究中,elastase-induced恶化被肺msc、改善肺功能和结构管理空域的峰值增大(24]。部分复苏的组织学反应显著的减少意味着线性拦截和肺泡扩张和肺泡数量的增加。一定程度的恢复机械性能衡量静态肺合规可能被视为因果再生过程的结果在肺泡单位。

表型msc的身份和可塑性可能依赖于组织的起源,甚至在同一组织不同。msc来自多个源的复发性间叶细胞标记和随之而来的缺乏造血和内皮标记。许多不同的因素,如CD34,本来,CD117,表示不同的区段(20.,26]。我们lung-derived MSC表型数据证实的表达一般MSC表面标记的集合。虽然msc在来源的表型是相似的,证据显示不同的行为在活的有机体内关于能力分化、迁移或嫁接。这意味着不同的基因表达或表观遗传特征驱动细胞获得不同的生物属性(27]。尽可能多的逻辑也cell-receiving器官起着举足轻重的作用。事实上,它已经表明,lung-derived msc、大量静脉注射时,拥有一个更高的能力嫁接肺对骨髓msc。肺msc表现出更强的表达基因编码旁分泌信号和更高层次的胶蛋白(28]。

MSC-related肺部疾病的治疗潜力包含两个主要机制:免疫调节和multilineage分化10]。msc是免疫抑制和抗炎作用通过细胞间接触和释放的可溶性因子调节免疫细胞的活动(29日- - - - - -31日]。MSC分化潜力的数据显示不同的结果,和争议是否这种现象发生在组织水平正在进行(32]。研究表明骨髓msc具有低可塑性在活的有机体内剩余容量分化成AEC1或AEC2可能由移植较低(33]。在我们的手中,肺的移植msc不是伴随着分化为内胚层的血统lung-derived msc可能指向协调修复,而不是直接取代失去的组织。

msc的机制可能参与组织内稳态调节其他细胞的功能在很大程度上仍未知。有一个共识,VEGF等因素,EGF, HGF参与骨髓和脂肪的保护和修复效果msc (17,33]。类似于胎儿发育,当间充质细胞肺上皮细胞提供营养因素维持其经济增长,交互在成年生活是合理的20.]。生长因子的分析概要文件证明HGF的更强的调制,而EGF和VEGF。我们发现海拔HGF / c-Met轴MSC-treated动物的肺和HGF在GFP-positive邻近的细胞。此外,政府的肺msc伴随着AEC2扩散。在这方面,组织修复中观察到我们的研究是一致的一个概念,一小部分AEC2可能拥有祖属性,当激活,促进修复受伤的肺泡(34]。胶质瘤是一种强有力的形态形成和增殖因子的损伤(35,36elastase-induced模型)和刺激上皮细胞增殖,介导肺泡形成和再生(16,37,38]。人类骨髓MSC、管理在肺气肿发病早期,发挥抗炎和抗凋亡作用介导HGF[通过MSC生产部分中39]。老鼠在肺泡上皮细胞表现出缺乏c-Met受损领空的生存形态和减少AEC2 [40]。短暂的刺激,HGF逆转领空气性肺扩张,在体外实验对肺泡上皮细胞建立保护HGF的影响。HGF在调解的含义MSC-stimulated有利影响也被证明在多发性硬化的实验模型41HGF和c-Met]进一步指示一个关键的角色在从伤病中恢复。

5。结论

我们报告之前未被成年老鼠的属性lung-derived msc,在地方政府推动和协调当地应对损害。虽然细胞生理学和的几个方面在活的有机体内行为相关的治疗潜力lung-derived msc仍有待澄清,驾驶上皮修复机制的理解,以及上皮细胞之间的相互关系和msc、药理和/或可能有助于识别目标细胞干预肺疾病。

信息披露

康拉德他和布鲁诺达是文章的第二作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

安东内拉·德·拉斯泰利Donato Cappetta,旧金山,康拉德,他和布鲁诺的贡献达同样的工作。

确认

这项工作是由普林斯顿2015没有。201532 ahae_004从意大利教育部大学和研究(MIUR)和科学出版基金部门的实验医学,坎帕尼亚大学的Luigi Vanvitelli”没有。5 14.06.16。