文摘
视网膜疾病治疗的干细胞替代依赖干细胞分化成视网膜细胞。我们之前证明人类牙周ligament-derived干细胞可以直接到视网膜血统感应。在这里,我们报告人类脂肪干细胞的分化转化潜力(对asc)视网膜血统和增强了Notch信号调制。人类对asc,腹部脂肪隔绝,表达间充质而不是造血干细胞标记,它们可以分化成脂肪细胞,软骨细胞和成骨细胞在体外。在‘诺金’/ shh / igf - 1诱导,对asc治疗显示视网膜祖细胞的表达升高,视网膜神经节,和感光细胞标记以及glutamate-evoked钙响应,并没有观察到noninduced细胞。定期归纳治疗相比,Notch信号激活JAG1增强视网膜祖细胞的表达和前体标记而不影响glutamate-evoked钙响应。相比之下,Notch信号抑制榫眼显示更多的视网膜神经节细胞,但推迟了谷氨酸刺激。总之,我们的研究结果显示,人类对asc拥有视网膜分化转化潜力在‘诺金’/ shh / igf - 1诱导,可以进一步增强Notch信号激活。
1。介绍
视网膜疾病,包括年龄相关性黄斑变性、青光眼、糖尿病性视网膜病变,色素性视网膜炎,是不可逆转的盲症和视力损害的主要原因,影响全世界超过3亿人。人类视网膜内在再生能力有限,目前的治疗方案是不够的功能修复病变视网膜细胞。干细胞替代,这依赖于干细胞的分化成视网膜细胞,可能是一个潜在的战略视网膜疾病治疗(1,2]。
视网膜祖细胞(rpc),胚胎干细胞(ESCs),诱导多能干细胞(万能)集中研究了视网膜细胞合成(3,4]。然而,人类成体干细胞研究,可以方便地获得自体移植,视网膜分化是有限的。我们建立了协议直接人类牙周ligament-derived干细胞(PDLSCs)视网膜家族通过抑制骨形成蛋白(BMP)和Wnt信号通路与补充胰岛素样生长因子1 (igf - 1)5,6]。我们假定我们的视网膜差异化策略可以普遍应用于不同类型的成体干细胞。
脂肪组织,来自中胚层,可以安全地通过抽脂,包含大量的脂肪干细胞(对asc)。人类对asc拥有multilineage分化潜力低风险的诱导自身免疫和畸胎瘤的形成7]。他们可以表达视网膜和视网膜色素上皮(RPE)细胞标记在RPE-conditioned培养基培养(8,9]。此外,对asc也可以诱导视网膜细胞在体外成对的异位表达框protein-6 (PAX6)基因fibronectin-supplemented介质(10]。这些建议对asc人类应该具备分化转化潜力对视网膜血统。
除了BMP、Wnt和igf - 1信号通路,Notch信号通路也参与不同的发育过程,包括retinogenesis和神经发生,控制细胞命运的决定(11,12]。先前的研究表明,缺口信号激活促进RPC增殖,防止RPC分化成视网膜细胞(12]。此外,notch 1信号参与感光的规定发展初期和晚期视网膜发展(13]。失活或删除notch 1 rpc增加感光前体生产老鼠(14]。同样,抑制切口促进感光前兆的产生从人类ips的衍生rpc (15]。此外,减少切口表达增加视网膜神经节细胞(RGC)《创世纪》16]。然而,notch 1+祖细胞表达Atoh7和Otx2,暗示的作用Notch1信号RGCs和感光细胞的分化17]。然而,Notch信号的作用在人类成体干细胞的分化视网膜仍然遥遥无期。在此,我们假设Notch信号调制可以提高人类成体干细胞的分化转移对视网膜血统。本研究确定的分化转化潜力对asc人类视网膜血统,‘诺金’/ shh / igf - 1诱导。我们也对asc划定Notch信号的作用在人类的视网膜分化。
2。材料和方法
2.1。人类脂肪中提取干细胞的隔离和维护
人类对asc从腹部脂肪的抽脂后3健康受试者知情同意书。本研究民族委员会批准的人类研究汕头大学联合汕头国际眼科中心和香港中文大学。短暂,从捐赠者样本收集后,多余的肌肉组织,脱脂组织和血液跟踪第一次从脂肪组织中删除,然后切碎的离心机。漂浮的组织分离,与I型胶原酶消化37°C 2小时。酶堵塞后,消化组织透过100μ尼龙网和离心机。人类对asc维护ADSC-BM介质(Lonza)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco), 1%谷氨酰胺,0.1%的抗生素ga - 1000。媒介是补充每3天,细胞融合时通道达到60 - 70%。人类对asc通道3 - 5被用于这项研究。
2.2。在人类脂肪中提取干细胞干细胞标记表达式
孤立的人类对asc表情特征的间充质干细胞(MSC: CD44, CD73、CD90、CD105)和造血干细胞(HSC: CD14、CD34、CD45)标记使用流式细胞仪根据制造商的协议(BD生物科学)。对asc短暂,人类是从文化的菜0.05%胰蛋白酶/ EDTA清洗两次冷污点缓冲区(BD生物科学),在寒冷的污点和resuspended缓冲2×10的浓度7细胞/毫升。细胞悬液是孵化与相应抗体(补充表1)或同形像控制对冰覆盖铝箔30分钟,以避免光。抗体探测后,细胞被洗两次染色缓冲区和分析Accuri C6流式细胞分析仪(BD生物科学)和至少10000事件。阳性细胞的百分比计算的同形像控制细胞。
2.3。人类脂肪中提取干细胞的间叶细胞谱系分化
对asc脂肪形成分化的人类是由脂肪细胞分化诱导的基础培养基补充10%脂肪细胞补充(StemPro Gibco) 14天。治疗细胞被固定为4% (w/v)多聚甲醛(pH值7.4;Sigma-Aldrich)和沾油红O试剂在环境温度为10分钟。
对asc成骨分化的人类是由骨细胞和软骨细胞分化诱导的基础培养基含有10%的骨细胞补充(StemPro Gibco) 14天。碱性磷酸酶活性检测,细胞被固定在冰冷的丙酮和孵化与电视台/ BCIP 20分钟的解决方案。钙沉积分析的细胞被固定在4%多聚甲醛和染色茜素红S (Sigma-Aldrich) 2 - 3分钟。
对asc软骨形成分化的人类是由骨细胞和软骨细胞分化诱导的基础培养基有10%软骨细胞补充(StemPro Gibco)人工基底膜涂层为14天。结果chondrogenic颗粒固定在4% (w/v)多聚甲醛(pH值7.4)、脱水和嵌入在10月的细胞球cryosectioned和阿尔新蓝染色(Sigma-Aldrich)染色30分钟。
消极的控制对asc不添加脂肪细胞,骨细胞、软骨细胞补充。
2.4。视网膜诱导人脂肪干细胞
视网膜诱导治疗分为阴性对照组和3诱导组。阴性对照组,细胞治疗10% FBS-supplemented 1: 1杜尔贝科修改鹰介质:营养混合物F-12 (DMEM / F12;Gibco)介质超低附件培养皿(康宁)3天然后在Matrigel-coated Gibco培养皿21天。对于视网膜诱导组,一个三级的大脑/ shh / igf - 1诱导方法被采用。首先,人类对asc (5×105细胞)在超低聚合附件培养皿感应介质1 (IM1;血清DMEM / F12培养基补充10%击倒替换(Gibco), 1 x B27补充(Gibco), 1 ng / mL的大脑(PeproTech), 1 ng / mL dickkopf-related蛋白1(消退;PeproTech)和5 ng / mL igf - 1为3天(PeproTech))。聚合的细胞被转移到Matrigel-coated培养皿和感应介质处理2 (IM2;DMEM / F12培养基补充1 x B27补充,补充1 x N2 (Gibco), 10 ng / mL的大脑,10 ng / mL消退,10 ng / mL igf - 1和5 ng / mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF;PeproTech) 7天。后来,培养基是取代感应介质3 (IM3;DMEM / F12培养基补充1 x B27补充,1 x insulin-transferrin-selenium(它;Gibco), 10 ng / mL的大脑,10 ng / mL消退,10 ng / mL igf - 1,和5 ng / mL bFGF)和进一步治疗2周。描绘Notch信号调控的作用在人类对asc的视网膜分化,JAG1 (20μM;Notch信号激活)γ分泌酶抑制剂(榫眼,10μM;Notch信号抑制剂)被补充进IM3和治疗2周。媒介是补充每3天。治疗细胞收集在天0,10、17日和24日进行进一步的分析。
2.5。RNA和蛋白质分离
媒介的愿望后,细胞治疗直接细胞溶解的350μ3.5 L一国补充的缓冲区μL (β巯基乙醇(Sangon生物技术)。提取RNA和蛋白质同时根据制造商的协议(NucleoSpin RNA和蛋白质,Macherey-Nagel)。RNA被RNase-free筛选了水,而蛋白质颗粒溶解于解决包含TCEP缓冲区。提取的RNA和蛋白质样本存储在−80°C各自的基因表达和免疫印迹分析。
2.6。基因表达分析
总RNA浓度是衡量NanoDrop nd - 1000分光光度计(热费希尔科学)。总RNA (1μg)是反向转录成互补DNA(互补)使用PrimeScript RT试剂盒(豆类)热循环(S1000热循环,Bio-Rad)。RPC的表达(PAX6和新经济学院),RGC (ATOH7和TUBB3),光感受器(CRX,海军研究实验室,ρ,RCVRN)和Notch信号(NOTCH1和HES1)标记评估了QuantiNova SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒)与特定的引物(补充表2)LightCycler480(罗氏)。管家基因(ACTB)是用于规范化。
2.7。免疫荧光分析
的治疗人类对asc Matrigel-coated盖玻片固定刚做好的4% (w/v多聚甲醛在PBS (pH值7.4)在环境温度为15分钟。固定细胞在PBS冲洗三次,剩下的自由醛被50 mM冰冷的NH淬火4Cl的解决方案。洗后,细胞渗透和被PBS补充0.15% (w/v皂素,1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)、1% (v/v)正常山羊血清(门店),0.01% Triton x - 100, 0.01% Tween-20 10分钟。阻塞后,细胞被孵化与主要抗体(补充表1;BSA皂素在PBS稀释含0.425%,1%,1%的门店,Tween-20 Triton x - 100, 0.0015%和0.0015%)18个小时在4°C。细胞培养与各自fluorophore-conjugated二级抗体和0.1% (v/v)DAPI (PBS稀释含1% BSA和1%门店)在环境温度为1小时。这些细胞被安装,在共焦显微镜和荧光信号的可视化(TCS SP5徕卡)。九成像,并意味着人类ASC 3独立样本不同治疗组进行比较。
2.8。免疫印迹分析
总蛋白质是由BCA量化分析。等量的总蛋白(20μg)热变性,解决12.5% SDS-polyacrylamide凝胶电泳,转移到PVDF膜。与5%脱脂牛奶阻塞后,污点是探测主要抗体RPC (PAX6)和感光(ρ)标记(补充表1)18个小时在4°C,紧随其后的是各自的辣根过氧化物酶,(合)共轭二次抗体。被检测到的信号增强化学发光(圣克鲁斯生物技术有限公司)和ChemiDoC XRS的成像+系统(Bio-Rad)。GAPDH是用作正常化管家蛋白。
2.9。Glutamate-Evoked钙响应
自发的胞内钙瞬变是评估使用fluo-4-acetoxymethyl酯(Fluo-4点;英杰公司)。简单,治疗或控制人类对asc在天24孵化汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院,Ca2 +/毫克2 +无;Gibco)包含5μ普朗尼克Fluo-4点和0.1% f - 127(英杰公司)在室温下30分钟。与哈佛商学院洗涤后,1毫米谷氨酸(Sigma-Aldrich)补充说,使用共焦显微镜和荧光图像立即捕获(徕卡TCS SP5),激发波长为495 nm和发射波长为515 nm,每1秒共计5分钟20 x物镜。荧光强度在特定的时间间隔测量共有50个细胞实验一式三份(至少10细胞在每个样本)。荧光的细胞变化( ; 每个地区计算的) 。Ca2 +荧光比率转化为Ca2 +使用浓度方程 ,在那里是Fluo-4的离解常数(400海里),是荧光比率( ),Ca是休息2 +集中在神经细胞(100海里)。
2.10。统计分析
数据提出了均值±标准差(SD)的3个独立的细胞系。所有统计分析使用商用软件(SPSS 20.0版;SPSS Inc .,芝加哥,IL)。独立的t以及和单向方差分析(方差分析)与事后图基的测试被用来比较治疗组之间的意思。意义被定义为 。
3所示。结果
3.1。人类脂肪Tissue-Derived干细胞的特征
人类对asc首次以MSC的表达(CD44, CD73 CD90、和CD105)和HSC (CD14、CD34、CD45)标记。流式细胞仪分析表明,CD44表达被发现在99.10±1.01%,CD73在97.07±2.56%,CD90 99.90±0.24%,和CD105在99.45±0.39%的人类对asc(图1(一))。相比之下,0.17±0.23%的人类对asc CD14阳性,CD34 1.42±1.40%, CD45 2.53±1.41%。确定对asc孤立的分化能力,对asc脂肪形成,骨和软骨形成人类进行评估。超过90%的人类对asc可以分化成脂肪细胞与淡黄色的脂质沉积(图1 (b))。此外,人类也可以分化成成骨细胞也表示通过密集的碱性磷酸酶活性和红色的钙沉积,以及软骨细胞,表明酸性多糖的浅蓝色染色。我们的研究结果表明,人类对asc从腹部脂肪主要是功能分离msc。
(一)
(b)
3.2。视网膜人类脂肪Tissue-Derived干细胞的分化
人类对asc治疗视网膜感应介质(图24天2(一个))。观察sphere-like结构低贴壁培养3天。Matrigel-coated表面,聚合对asc迁移从玫瑰和展出neural-network-like形态浓缩细胞体(图2 (b))。相比之下,人类对asc在负对照组仍呈形状和不断扩散。
(一)
(b)
来验证对asc人类的视网膜分化能力,视网膜的表达谱系标记检查在天0,10、17日和24日之后归纳。基因表达分析表明,RPC的表达(PAX6和新经济学院),光感受器(CRX,海军研究实验室,ρ,RCVRN)和RGC (ATOH7和TUBB3)标记基因时间增加视网膜诱导治疗期(图3(一个))。Sybr绿色PCR分析表明,在24天,PAX6和新经济学院基因对asc在治疗人类增加了38.03±8.41倍( )和38.41±4.12倍( 相比),分别在第0天表达式。同样的,CRX,海军研究实验室,ρ,RCVRN基因增加了15.46±1.75倍( ),3.94±0.81倍( ),14.25±1.96倍( ),245.90±15.46倍( ),分别。与此同时,的表达ATOH7和TUBB3基因在对asc retinal-induced天24增加16.65±3.35倍( )和1.75±0.19倍( ),分别。相比之下,所有视网膜标记基因显示阴性对照组无显著变化在整个治疗期间。
(一)
(b)
(c)
连贯的基因表达的结果,PAX6和ρ蛋白的表达在对asc retinal-induced时间调节,为3.06±1.31倍( )和3.00±0.53倍增加( ,图3 (b))分别为24天,,而在第0天的表情。此外,免疫荧光分析表明,表达的对asc retinal-induced PAX6 (74.74±2.42%, ),CRX (40.72±7.01%, ),POU4F2 (35.10±7.86%, )和TUBB3 (21.25±6.18%, ;图3 (c))。相比之下,视网膜标记表达式中没有观察到对asc的阴性对照组。
的功能对asc retinal-induced被glutamate-evoked钙反应评估。观察一个健壮的荧光强度增加后对asc retinal-induced谷氨酸刺激,但只有一个非常微弱的信号是阴性对照组(图中观察到4补充视频1和补充视频2)。荧光强度的变化( )在对asc retinal-induced 525.18±228.80%,而阴性对照组(133.79±159.82% )。
(一)
(b)
(c)
确认视网膜的特异性分化转移,对asc retinal-induced进行评估与染色脂肪形成和骨生成和负染色的脂质沉积,碱性磷酸酶和钙沉积在对asc retinal-induced(补充图1)。总的来说,我们的研究结果表明,人类对asc,小杯/ shh / igf - 1治疗,成功特别是transdifferentiated功能性视网膜细胞。
3.3。Notch信号调节视网膜人类脂肪Tissue-Derived干细胞的分化
描绘的规定Notch信号在人类对asc的视网膜分化,JAG1 (Notch信号激活剂)和榫眼(Notch信号传导抑制剂)应用于视网膜感应介质(图2(一个))。对asc Notch信号调节器的效果对人类的表情证实了Notch信号下游效应器(HES1基因)。在JAG1治疗组HES1基因显著调节在24天(1.50倍 ;图5(一个)),而普通感应集团,榫眼治疗组,HES1基因显著下调在24天(1.43倍 )。值得注意的是,Notch信号受体的表达(NOTCH1基因)也是调节JAG1治疗组的1.76倍( ),但没有改变的榫眼治疗组。
(一)
(b)
(c)
对于RPC标记基因表达分析,表达的PAX6基因调节的JAG1治疗组24天(1.93±0.31倍 ),相比常规诱导组。同样,的表达新经济学院基因也增加JAG1治疗组24天(1.37±0.21倍 )。相比之下,的表达新经济学院基因表达下调的榫眼治疗组1.32±0.22倍( )。光感受器标记的表达式CRX,海军研究实验室,ρ基因调节1.51±0.28倍( ),1.40±0.17倍( ),2.55±1.15倍( ),分别在JAG1治疗组24天,相比常规诱导组。RGC标记的表达式ATOH7和TUBB3基因在JAG1治疗组增加了1.78±0.31倍( )和1.15±0.06倍( ),分别在24天,相比常规诱导组。人类对asc榫眼治疗组视网膜显示类似的标记基因表达,定期归纳治疗组。
连贯的基因表达的结果,免疫印迹分析表明,PAX6蛋白的表达明显调节JAG1治疗组24天(1.45±0.33倍 ),而普通感应组(图5 (b))。同样,ρ蛋白的表达也调节JAG1治疗组的1.47±0.17倍( )24天,相比常规诱导组。此外,的百分比PAX6 JAG1 nucleus-positive细胞治疗组(87.06±2.69%, )高于常规诱导组(74.74±2.42%;图5 (c))。CRX的百分比JAG1 nuclear-positive细胞治疗组(81.42±6.49%, )明显高于常规诱导组(40.72±7.01%),和CRX的百分比nuclear-positive细胞在榫眼也明显高于治疗组(68.94±4.77%, )。TUBB3-positive细胞的百分比低JAG1治疗组(14.23±4.68%, ),但是更高的榫眼治疗组(28.93±3.40%, ),而在常规诱导组(21.25±6.18%)。此外,的百分比POU4F2 nuclear-positive细胞更高的榫眼治疗组(46.12±5.84%, )比常规诱导组(35.10±7.86%)。
谷氨酸刺激后,荧光强度的变化JAG1治疗组(532.10±191.77%;图6 (b))与普通感应组(525.18±228.80%;图6(一))。相反,荧光强度的变化榫眼治疗组(369.36±90.43%;数据6 (c),6 (d))明显小于常规感应集团( )。此外,时间响应的谷氨酸刺激DAPT-treated细胞也显著延迟(141.60±16.24秒, ;图6 (e)),相比常规诱导组(59.40±10.29秒)。JAG1治疗并不影响诱导的反应对asc谷氨酸刺激(60.30±9.94秒)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
总的来说,我们的研究结果表明,缺口信号激活进一步增强视网膜的表达标记和产生更多的rpc和感光前体而不影响对asc谷氨酸刺激在人类的视网膜分化过程。相比之下,Notch信号抑制产生更多RGCs但抑制谷氨酸刺激。
4所示。讨论
干细胞从脂肪组织主要是分离msc,它们可以分化成脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞在体外在感应(图1)。对asc除了中胚层的血统,也被分化成外胚层的血统的报告,包括神经元和视网膜血统,在特定的诱导条件下(18,19]。到牙齿相比,脂肪组织更容易访问和容易获得的抽脂以最小的侵袭性。此外,人类对asc丰富可以孤立的高增殖能力(20.]。他们也有一个低风险的诱导移植后畸胎瘤(7]。人类对asc应该是一个有前途的视网膜细胞合成细胞来源,在体外疾病模型,和细胞替代疗法。
小杯/ shh / igf - 1协议最初开发人类的视网膜分化的ESCs [3]。我们有这个协议适用于诱导人类PDLSCs视网膜血统(5,6]。‘诺金’和消退的各自的BMP和Wnt信号通路的抑制剂。得罪BMP和Wnt信号通路促进神经板发展和retinogenesis21,22),而igf - 1指定的视网膜祖身份(3]。在这项研究中,小杯/ shh / igf - 1治疗对asc重组人类独特的neuron-like形态(图2 (b))。细胞聚合促进感应到神经元血统(23),而人工基底膜助攻神经元细胞的成熟(24]。相比之下,人类对asc,没有小杯/ shh / igf - 1治疗,保留了呈形态和高度增殖。
小杯/ shh / igf - 1治疗成人干细胞是特定的。我们以前的研究表明,‘诺金’/ shh / igf - 1诱导下,人类PDLSCs眼睛可以表达字段转录因子(Pax6,处方,Lhx,Otx2),感光标记(海军研究实验室,视紫红质激酶),神经元和视网膜神经节细胞标记(ATOH7,POU4F2,β-III微管蛋白,图2,τ,NEUROD1,SIX3)。此外,诱导PDLSCs显示出显著的兴奋性谷氨酸(5,6]。在这项研究中,RPC (PAX6和新经济学院),光感受器(CRX,海军研究实验室,ρ,RCVRN)和RGC (ATOH7和TUBB3)标记显著调节时间的方式诱导治疗期间(图3)。此外,由于内视网膜神经元具有谷氨酸受体(25,26)的神经传递函数对asc retinal-induced评估了glutamate-induced钙响应(图4)。类似于人类PDLSCs我们之前的研究,一个健壮的观察荧光强度增加对asc retinal-induced谷氨酸刺激后,确认对asc retinal-induced拥有一个可兴奋膜性质,像发展中视网膜神经元26,27]。总的来说,我们的研究结果表明,人类对asc transdifferentiate成功能性视网膜细胞在大脑/ shh / igf - 1诱导治疗。小杯/ shh / igf - 1诱导治疗是一种化工战略一个精确定义公式和视网膜分化条件,可以采用综合临床应用的视网膜细胞。
Notch信号是一个后生动物使用的进化机制,控制细胞的命运通过当地细胞相互作用[11]。在脊椎动物中,有四个级距受体(Notch 1、2、3、4)和两个配体(三角洲和锯齿状)。切口的激活信号诱导转录抑制因子基因的表达,如HES1压制颈板的基因表达,从而抑制神经元分化。因此,切口的激活信号导致的维护神经干细胞群,而失活Notch信号诱导神经元分化和耗尽的神经干细胞群(28,29日]。Downregulation notch 1促进神经元分化骨骨髓来源的msc (30.]。然而,Notch信号的失活导致完全丧失的神经干细胞在发展和成人端脑,指示一个绝对要求维护Notch信号的神经发生的神经干细胞和适当的控制29日,31日]。
在这项研究中,我们证实了Notch信号调制的upregulation的功效HES1JAG1治疗(如Notch信号激活剂)在榫眼差别及其对这些治疗(Notch信号传导抑制剂;图5(一个))。值得注意的是,NOTCH1表达式也调节JAG1治疗组,表明积极的反馈回路对asc成立于人类视网膜分化过程中Notch信号激活。由JAG1 Notch信号激活,在常规的大脑/ shh / igf - 1诱导治疗,进一步提高视网膜祖细胞的表达和前体标记(PAX6,新经济学院,CRX,海军研究实验室,ATOH7)以及成熟的光感受器(ρ)和RGC (TUBB3)标记(数据5(一个)和5 (b))。JAG1治疗也产生更多PAX6 CRX-positive细胞,但不POU4F2 TUBB3-positive细胞(图5 (c)),这表明Notch信号激活能增强视网膜祖和前体的维护或生产标记在成人视网膜干细胞分化。类似于之前的斑马鱼视网膜发展报告,非洲爪蟾蜍,小鸡,和老鼠,Notch信号的作用是为了保存一个未分化的祖细胞池,获得干细胞特性,并防止分化(14- - - - - -16,32,33]。相比之下,由榫眼Notch信号抑制表达下调的表达新经济学院基因,但显示更多POU4F2 TUBB3-positive细胞,这表明Notch信号抑制降低RPC人口但会增加生产对视网膜神经节血统。然而,榫眼治疗也推迟了谷氨酸刺激的反应对asc retinal-induced(图6),这表明Notch信号可能参与对asc retinal-induced谷氨酸信号传输。除了直接监管在分化过程中,Notch信号也可以与其他信号通路,包括BMP和Wnt信号通路(34,35),和细胞命运决定将多因子的11]。Notch信号促进循环的阻遏蛋白表达和活化剂的颈板命运规范在祖细胞(36,37),这表明Notch信号的祖细胞的作用,不是静态的,而是动态的或振荡。此外,长期激活Notch信号不会干涉祖时间的正常发展状态(38],rpc的连续供应所需的生产分化神经元和视网膜发育的完成(39]。Notch信号调制的分子机制在成人视网膜干细胞分化和视网膜分化对asc的最佳条件,以及对asc的神经保护作用,需要进一步调查。
5。结论
总之,人类对asc视网膜具有分化潜力在‘诺金’/ shh / igf - 1诱导治疗,视网膜祖细胞的合成和前体细胞可以进一步增强了Notch信号激活。人类对asc应该是一个有前途的自体来源的成体干细胞在视网膜细胞合成,在体外疾病模型,和在未来干细胞替代治疗。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Yuqiang黄和陈Chong-Bo主要进行了实验。Bing黄和梁Jiajian帮助实验。黄Yuqiang招募研究对象。前街亲属Ng、气Pui彭日成和Mingzhi张监督这个项目。Yuqiang黄街亲属Ng Chong-Bo陈,气Pui彭日成解释结果和写的手稿。
确认
我们表达我们最深的感谢所有的参与者在研究。本研究支持的中国广东省自然科学基金(2016 a030313063)和中国的广东省医学科学研究基金会(A2015452)。
补充材料
补充1。补充表1:抗体用于流式细胞术、免疫荧光和免疫印迹分析。
补充2。补充表2:引物进行基因表达分析。
补充3。补充图1:评估脂质沉积、碱性磷酸酶和钙沉积对asc retinal-induced。
补充4。补充1:视频glutamate-evoked钙反应诱导组。
补充5。补充视频2:glutamate-evoked钙反应阴性对照组。