文摘
间充质干细胞/基质细胞(msc)调查了影响心血管系统疾病的治疗,包括恰加斯病。msc能够促进他们有益的行为通过proregenerative的分泌和免疫调节因子,包括胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1),在心脏和骨骼肌proregenerative行动。在这里,我们评估的治疗潜力IGF-1-overexpressing msc (MSC_IGF-1)慢性恰加斯病的小鼠模型。C57BL / 6小鼠感染哥伦比亚的压力鲁兹锥体和治疗与msc、MSC_IGF-1或车辆(生理盐水)6个月后感染。RT-qPCR分析证实移植细胞在心脏和骨骼肌组织。移植msc或MSC_IGF-1炎症细胞的数量减少心脏生理盐水相比,控制。此外,msc治疗或MSC_IGF-1显著降低TNF -α,但只有干扰素- MSC治疗减少γ生产与生理盐水组相比。骨骼肌的MSC和MSC_IGF-1-treated老鼠相比减少纤维化盐水控制。重要的是,肌纤维面积减少t . cruzi来华的老鼠,这是MSC_IGF-1治疗后恢复。在骨骼肌基因表达分析显示更高的支持和抗炎分子表达仅在MSC_IGF-1-treated老鼠相比,msc,显著降低TNF的表达α和il - 1β。总之,我们的结果表明MSC_IGF-1的治疗潜力,结合免疫调节和心脏和骨骼肌proregenerative行动。
1。介绍
在再生医学领域,间充质干细胞/基质细胞(msc)是有前途的工具发展的新颖先进的治疗药品治疗慢性炎性疾病(1]。msc可以很容易地从不同的来源获得,包括骨髓、脂肪组织,和脐带组织,允许发展的自体和同种异体疗法(2]。几个临床试验已经进行了临床应用的安全性msc (3]。为了提高治疗效果的msc、超表达转基因的特定生长因子目前正在调查(4,5]。
营养旁分泌因子的释放的msc与许多有关proregenerative和免疫调节效果观察的上下文中MSC-based疗法(2]。这种增长的因素之一是胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1),它已被证明在骨骼肌施加proregenerative行动,促进肌细胞增殖和分化,组织学恢复肌肉纤维的类型和大小,和功能改进6,7]。此外,igf - 1诱导肌细胞肥大和卫星细胞的激活,增加蛋白质合成在差异化的肌纤维8]。在心脏组织,igf - 1是显示改善移植msc、促进新血管形成和抑制心肌细胞死亡(9,10]。
恰加斯病是一种传染性疾病引起的细胞内的寄生虫鲁兹锥体。以前局限于拉丁美洲地区,恰加斯病已经蔓延到其他大洲由于人口迁移11]。心脏并发症发生在大约30%的感染,可出现心律失常和心力衰竭(12]。组织分析揭示了存在慢性心肌炎,myocytolysis,和一个强烈的间质纤维化,持久的寄生的组合的结果,微血管炎症、神经性功能障碍,和自身免疫反应(13]。这些过程也恰加斯病的小鼠模型中观察到由myotropic造成的鲁兹锥体应变,发展进步的炎症反应和纤维化的心,随着强烈的骨骼肌肉发炎,感染在慢性阶段(14]。调制的加剧炎症反应结合刺激内源性恰加斯病的再生是一个有前途的治疗方法。
骨髓间充质调节免疫反应的能力和纤维化的上下文中已经证明t . cruzi感染小鼠(15- - - - - -18]。我们以前生成和特征来源于MSC细胞系的骨头overexpressing igf - 1 (19]。在目前的研究中,我们调查的治疗潜力IGF-1-overexpressing msc在慢性恰加斯病的实验模型,通过评估他们的免疫调节和proregenerative影响心脏和骨骼肌。
2。材料和方法
2.1。动物
六到八周大的女性C57BL / 6小鼠被用于t . cruzi感染。年龄的天真的老鼠一直在相同条件下实验期间,作为未感染的控制。所有的动物生长和维护在动物设施中心的生物技术和细胞疗法,圣拉斐尔医院(萨尔瓦多、巴西),并提供与啮齿动物的饮食和水随意。动物被处理根据美国国立卫生研究院的动物实验指南。所有程序描述了在当地的动物伦理委员会的批准下数量012/09(圣拉斐尔医院、巴伊亚、巴西)。
2.2。IGF-1-Overexpressing msc的文化
超表达转基因MSC与稳定的人类igf - 1 (MSC_IGF-1)以前生成的利用GFP转基因小鼠的骨髓MSC获得(19]。简而言之,msc与过度的慢病毒载体转导hIGF-1,和克隆的特点是聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)评估转基因表达。细胞也被证明能维持msc的特征,包括表型标记,trilineage分化潜能,并降低淋巴细胞增殖的抑制作用。MSC_IGF-1在杜尔贝科修改鹰的培养介质(DMEM)补充10%胎牛血清(青霉素、链霉素的边后卫)和1%(从热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)在37°C和5%湿度孵化器有限公司2每三天,完全培养基替代。
2.3。t . cruzi感染和细胞疗法
老鼠感染通过腹腔内注射1000 trypomastigotes哥伦比亚t . cruzi应变,获得文化LLC-MK2感染细胞的上清液。六个月后感染,老鼠被随机分成三组:msc ( ),MSC_IGF-1 ( )或生理盐水( )。年龄的天真的老鼠作为正常对照组( )。细胞移植是由四个静脉注射细胞悬浊液包含106msc或MSC_IGF-1,放入盐水中,每个注入之间的间隔15天。同等体积的车辆(100μL)中使用生理盐水组(图1(一))。
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2.4。的形态学分析
小鼠安乐死两个月后的起始细胞疗法的协议,在麻醉下氯胺酮和甲苯噻嗪。心脏和骨骼肌被移除,缓冲福尔马林固定在10%。组织部分由光学显微镜分析了石蜡包埋后,紧随其后的是标准的苏木精和伊红染色())。炎症细胞数使用软件Image-Pro + v.7.0(媒体控制论,罗克维尔市,医学博士,美国)。炎症细胞的数量取决于计算10字段(400 x放大)/心脏或骨骼肌部分。天狼星红点的部分是完全数字化使用共焦显微镜A1 +(尼康、东京、日本)。纤维化的比例是由分析整个部分的心脏和骨骼肌,沾着小天狼星红了一个半自动的形态学协议,使用Image-Pro + v.7.0(美国媒体控制论,罗克维尔市,马里兰州)。两个被调查人员进行了分析。
2.5。免疫荧光分析
骨骼肌的部分10μ米和4%多聚甲醛固定和孵化一夜之间在4°C骨胳肌凝蛋白主要抗体稀释1:50 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。第二天,部分被孵化1 h和二次抗体anti-rabbit免疫球蛋白Alexa萤石488共轭的稀释1:600(热费希尔科学)。核沾染了4,6-diamidino-2-phenylindole (VECTASHIELD安装介质与DAPI h - 1200;向量的实验室,伯林盖姆,CA,美国)。荧光纤维的存在是由在A1 +共焦显微镜观察(尼康)。量化彩色区域进行在大型图像捕获100 x放大,使用Image-Pro + v.7.0软件(媒体控制论)。
2.6。细胞因子测定
由ELISA测定血清细胞因子浓度均使用DuoSet对肿瘤坏死因子-α(TNF -套件α)、γ干扰素(IFN -γ)、白介素10 (il - 10)和转化生长因子β(TGF -β),根据制造商的说明(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。
2.7。实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)
总RNA从心脏和骨骼肌标本分离试剂盒试剂(热费希尔科学),浓度是由光度测量。高容量cDNA逆转录工具包(热费希尔科学)被用来合成互补脱氧核糖核酸的1μg RNA遵循制造商的建议。RT-qPCR化验的表达水平进行检测肿瘤坏死因子(Mm00443258_m1),Ifng(Mm00801778_m1),Nos2(Mm01309898m1),__arg1(Mm00475988_m1),Il1b(Mm00434228_m1),Il10(Mm00439616_m1),Tgfb1(Mm00441724_m1),Ptpcr(mm01293577_m1),Cox2(Mm01307329_m1)。GFP和人类的检测igf - 1 mRNA,以下引物序列被用于实时PCR检测:GFP: 5-AGCAGAACACCCCCATCG-3和3-TCCAGCAGGACCATGTGATC-5和hIGF-1 5CCAAGACCCAGAAGGAAGTACA-3和3-TGGCATGTCACTCTTCACTCC-5 。RT-qPCR放大混合物中含有20μ(10 g模板cDNA、TaqMan主组合μL),探测器在最后一卷20μL(所有从热费希尔科学)。所有反应都是在重复运行ABI 7500序列检测系统(热费希尔科学)标准的热循环条件下。平均周期阈值(Ct)值重复测量被用来计算目标基因的表达,以规范化的内部控制,Gapdh使用2−DCt公式。实验与变异系数大于5%被排除在外。nontemplate控制(NTC)和nonreverse转录控制(No-RT)也包括在内。
2.8。统计分析
是由学生的统计对比组以及当比较两组,方差分析后跟Newman-Keuls事后测试多个比较,使用GraphPad棱镜程序(软件有限公司、圣地亚哥、钙、美国)5.0版。结果被认为是重要的时候 。
3所示。结果
3.1。msc和MSC_IGF-1检测移植后心脏和骨骼肌慢性Chagasic老鼠
一个治疗方案由重复msc的静脉注射或MSC_IGF-1(图1(一))与死亡率增加(40%的MSC组和30% MSC_IGF-1集团)对小鼠慢性感染t . cruzi由于肺栓塞。幸存的老鼠( MSC集团和 MSC_IGF-1集团)安乐死两个月后的起始治疗方案为组织学和细胞因子的基因表达分析和量化(图1(一))。
首先,我们评估的存在移植心脏和骨骼肌细胞的检测转基因RT-qPCR mrna。GFP是用来检测msc和MSC_IGF-1 hIGF-1用来检测MSC_IGF-1时。我们检测到GFP mRNA的六个老鼠从MSC_IGF-1组和5 6小鼠MSC组(图1 (b))。虽然没有表达hIGF-1 MSC集团被发现在老鼠心脏的七个老鼠MSC_IGF-1组阳性这个mRNA的表达(图1 (c))。在骨骼肌中,所有老鼠对待msc GFP阳性,而4 7小鼠了GFP的表达和hIGF-1老鼠MSC_IGF-1处理(数据1 (b)和1 (c))。
3.2。细胞疗法与msc和MSC_IGF-1调节心脏炎症和纤维化
接下来,我们通过组织分析细胞疗法的效果进行评估的chagasic老鼠。所有小鼠慢性感染t . cruzi提出了强烈的心肌炎性浸润,这主要是由单核细胞(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。浸润炎症细胞被量化,显著减少细胞的数量测量MSC -和MSC_IGF-1-treated老鼠,相比saline-treated控制(图2 (e))。分散地区的心脏纤维化,分布式沿着心房、房室结、ventriculi,观察t . cruzi来华的老鼠和不是所有天真的控件(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。减少纤维化面积也观察到小鼠的心对待msc或者MSC_IGF-1,相比saline-treated控制(图3 (e))。
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此外,促炎和抗炎基因的表达水平是评价心脏标本。msc治疗或MSC_IGF-1产生TNF的表达显著下降α,而干扰素-γ基因表达降低只有在MSC-treated老鼠心脏(数字4(一)和4 (b))。观察TGF -无显著差异β或il - 10基因表达MSC - MSC_IGF-1和saline-treated组(数字4 (c)和4 (d))。
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我们也调查了系统性免疫调节的影响通过量化血清细胞因子的细胞疗法。类似于心脏组织发现,肿瘤坏死因子的水平α在治疗组显著减少与msc或MSC_IGF-1,虽然干扰素-γ只在MSC-treated集团(数据水平下降4 (e)和4 (f))。观察TGF -没有明显的统计学差异β或血清il - 10水平,当比较小鼠生理盐水控件(数据处理4 (g)和4 (h))。
3.3。Proregenerative和免疫调节的行为MSC_IGF-1小鼠骨骼肌的慢性感染t . cruzi
从天真的小鼠骨骼肌呈现正常的微观结构,保存细胞,观察到)染色(图5(一个))。相比之下,部分t . cruzi来华的小鼠的生理盐水和MSC团体提出明确的迹象骨骼肌破坏和纤维化和脂肪组织(数据替换5 (b)和5 (c))。然而在MSC_IGF-1-treated老鼠,我们观察到显著的保护肌纤维(图5 (d))。这一发现证实了量化肌纤维所占据的区域,由骨胳肌凝蛋白阳性染色(可视化数据5 (e)- - - - - -5 (h))。天真的小鼠肌凝蛋白显著升高+面积比生理盐水或MSC-treated老鼠和老鼠MSC_IGF-1(图提出了一个类似的模式5(我))。
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天真的老鼠的肌肉部分间质细胞结构较低(图6(一)),而t . cruzi老鼠来华的渗透主要由单核细胞肌纤维之间和周围血管(数字6 (b)- - - - - -6 (d))。在骨骼肌纤维化的重要沉积也观察到部分被感染的老鼠,而天真的控件(数据6 (e)- - - - - -6 (h))。然而,图像测量分析并没有显示浸润炎症细胞数量的减少与msc或MSC_IGF-1小鼠,相比saline-treated老鼠。事实上,我们发现,老鼠接受MSC_IGF-1提出更高数量的炎症细胞(图6(我))。这是由RT-qPCR分析证实PTPRC信使rna的检测,证明CD45的表达水平显著升高,panleukocyte标记(图6 (j))。纤维化的形态学分析的量化天狼星红点的部分显示,与msc治疗和MSC_IGF-1能够减少纤维化在骨骼肌(图6 (k))。
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最后,骨骼肌组织的基因表达分析显示,与msc治疗能够显著减少促炎细胞因子的表达TNF -α和il - 1β相比saline-treated老鼠。这不是观察MSC_IGF-1-treated老鼠,没有显示出明显不同的表达水平,相比saline-treated老鼠(数字7(一)和7 (b))。事实上,MSC_IGF-1-treated骨骼肌增加了COX2的表达基因(图7 (c))。MSC_IGF-1治疗没有显著改变伊诺和精氨酸酶基因的表达,分别标记M1和M2巨噬细胞(数字7 (d)和7 (e))。最后,il - 10基因的表达显著高于被MSC_IGF-1组相比其他组(图7 (f))。
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4所示。讨论
在目前的研究中,我们评估igf - 1超表达是否能增加免疫调节和/或再生的行为实验恰加斯病心肌病msc的上下文中。我们发现,移植的MSC_IGF-1减少心脏炎症和纤维化,以类似的大小中观测到的效应MSC-treated老鼠。骨骼肌组织评估的时候,然而,标志着再生效果观察与MSC_IGF-1细胞在小鼠体内移植。
igf - 1与过程有关的心脏和骨骼肌再生(7,8,20.]。然而,这些研究都集中在igf - 1在骨骼肌急性损伤后的再生,而其作用长期设置,在持久的肌炎的存在,没有解决。我们曾表明,igf - 1基因表达增加心脏和骨骼肌中感染的急性期t . cruzi在老鼠21]。在这里,我们发现MSC_IGF-1有明显影响的骨骼肌再生的小鼠慢性感染t . cruzi骨骼肌纤维,损失可能会直接损伤诱导的结果t . cruzi感染与慢性炎症引起的sarcopenia和增加地方和TNF -循环水平α(22]。循环肿瘤坏死因子——这一事实α水平同样调制msc和MSC_IGF-1表明骨骼由IGF-1-overexpressing细胞肌纤维的恢复不是免疫调节行为的结果,而是可能直接行动的结果由骨骼肌中igf - 1。
igf - 1的作用在卫星细胞的激活和肌肉再生是良好的23]。它也知道炎症对肌肉的修复是至关重要的,和巨噬细胞在这一过程中扮演着重要的角色通过分泌igf - 1促进Pax7激活和增生+卫星细胞(24]。有趣的是,招聘的骨髓细胞骨骼肌也为了Pax7 - / Myod-independent方式导致肌细胞生成(25]。此外,我们之前已经证明的直接贡献骨骨髓来源的细胞再生肌纤维t . cruzi感染,骨髓嵌合体实验模型(21]。
免疫细胞之间的交互和肌肉再生以前一直探索的,和抑制巨噬细胞的活动损害肌肉再生,导致严重纤维化(26]。巨噬细胞亚型也与肌原性的项目的不同阶段,由于促炎(M1)巨噬细胞在增殖阶段占主导地位的肌肉再生和抗炎(M2)巨噬细胞在分化阶段(27]。在目前的研究中,治疗MSC_IGF-1与单核细胞浸润骨骼肌的数量增加,随着高表达的炎症介质,如肿瘤坏死因子-α和il - 1β和抗炎细胞因子il - 10。这些结果可以解释为igf - 1的直接行动,但也有可能免疫反应指向transgenes-GFP hIGF-1-could已经引起,这是没有在目前的调查研究。
一个有趣的发现是增加骨骼肌组织中COX2的表达MSC_IGF-1-transplanted老鼠。igf - 1信号可以诱导COX2的表达在不同的细胞类型,包括角化细胞(28),乳腺(29日),和各种肿瘤细胞(30.- - - - - -32]。COX2参与花生四烯酸代谢酶,负责类花生酸的生产,包括tromboxanes和前列腺素,是重要的炎症介质。重要的是,前列腺素E2已被证实能起到至关重要的作用在成肌细胞增殖和再生的过程,和功能恢复已经证明(33,34]。我们发现hIGF-1的表达在移植小鼠的肌肉组织,表明这个因素可能参与本地COX2 upregulation观察到在我们的研究中并建议PGE2的参与在慢性肌肉再生由MSC_IGF-1 chagasic老鼠。
一些细胞类型研究指向恰加斯病的疗法。骨髓单核细胞最初进行临床前研究,并与减少心脏炎症和纤维化(35),主要是由于他们的免疫调节作用36),但未能显著改善心脏功能在一个随机临床试验(37]。msc之前也一直在研究恰加斯病的实验模型,并与炎症和纤维化(重大改进16,18]。恰加斯病的小鼠模型的一个重要限制是缺乏左心室功能障碍,不允许调查功能改善心脏,可能与治疗有关。这限制了我们的结论方面的免疫调节,纤维化和再生,在组织层面进行评估。需要额外的临床前研究使用不同的模型来评估潜在的这种基因和细胞治疗在改善左心室功能。到目前为止,临床试验的结果与msc治疗心力衰竭的病因一直温和,在最好的情况下(38]。但是,没有临床研究与msc恰加斯病的患者心脏功能障碍的表现。
总之,我们的结果表明,超表达生长因子可能是一个有趣的方法改善的治疗潜力msc、自igf - 1过度推广增加proregenerative操作与维护免疫调节和antifibrotic行动,相比普通msc、慢性恰加斯病的小鼠模型。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者承认巴西机构FINEP CNPq, FAPESB研究经费。